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1、人体寄生虫学实验补充教材前 言 人体寄生虫学是临床医学、基础医学、法医学、预防医学等专业的必修课程，也是一门实践性很强的学科。实验教学的内容包括了形态和功能两大部分，教材采用本室自编的人体寄生虫学实验指南，该教材已沿用多年，虽几经修订，但其中涉及功能的综合性实验内容较少，已不能满足基础医学专业本科生实验教学的需要。本教材是在现有实验教学的基础上，将多年来在基础医学专业本科生中开展的人体寄生虫学的综合性功能实验进行整理汇编而成，以人体寄生虫病为主线，运用免疫学、分子生物学等研究方法，通过一个个相对独立的实验，探讨有关人体寄生虫病的诊断、致病机理等方面内容，为学生将来从事医学研究工作奠定基础。本补
2、充教材主要供本校基础医学专业学生使用，也可作为临床医学八年制学生的实验参考资料。病原生物学系2005年12月第一部分 日本血吸虫致病相关实验实验目的：掌握日本血吸虫的主要感染方式、寄生部位及成虫形态特征；掌握日本血吸虫病的诊断方法；了解肝、肠组织内日本血吸虫卵的形态及其病变特征，日本血吸虫的虫卵抗原和成虫抗原的制备。实验一 日本血吸虫动物模型的建立和解剖（本实验为自主设计实验，具体要求和内容见人体寄生虫学实验指南）实验二 诊断日本血吸虫病的免疫学方法之一ELISA实验原理：酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）是常用的诊断日本血吸虫
3、病的免疫学方法。将日本血吸虫的可溶性抗原包被在特制的聚苯乙烯反应孔内，将待测的血清加到反应孔内，如血清中含有相应的特异性抗体，即可形成抗原抗体复合物，若在反应孔内加入相应的HRP酶标记二抗，即可通过底物的显色反应来判断实验结果。ELISA方法可广泛用于多种寄生虫感染的检测。实验材料和方法：试剂PBS (10 mM pH7.4) NaCl 8g KCl 0.2g Na2HPO4 .12H2O 2.9g KH2PO4 0.2g 蒸馏水至 1000ml PBST（ 含0.05% Tween-20的PBS）包被液（PH9.6，0.05M碳酸盐缓冲液）封闭液：3脱脂奶（3g脱脂奶/100mlPBS），底
4、物显色液 柠檬酸（0.1M） 12.15ml Na2HPO4（0.2M） 12.85ml 邻苯二胺（OPD） 20mg H2O2 80ml 双蒸水 25ml 总体积 50ml, 临用前加H2O2兔抗血清：血吸虫感染动物实验获得，20冻存备用抗兔IgGHRP注：检测病人时用待测病人的血清，二抗则用抗人IgG-HRP器材 分光光度计、酶标仪、超声粉碎仪、离心机等主要步骤1 日本血吸虫成虫及虫卵抗原的制备收集上述感染动物（家兔）的虫卵及成虫，用适量的PBS稀释，超声粉碎后高速离心30 分钟，分别收集上清液，测定蛋白含量。2 ELISA过程：包被：以包被液稀释上述抗原成5ug/ml, 100ul/孔，
5、4 湿盒过夜洗涤：以PBST洗涤5次封闭：以3脱脂奶封闭，300ul/孔，室温1小时 与抗血清反应：加入兔抗血清（1：400），100ul/孔，室温1小时同上洗涤6次与酶标二抗反应：加入羊抗兔IgGHRP（1：5000），100ul/孔，室温1小时同上洗涤6次显色：加入显色液200ul/孔，室温半小时，避光终止：以2N H2SO4 50ul 终止反应实验结果观察和分析OD490nm处读取结果（阳性反应呈棕色或棕黄色）注意事项1 严格实验操作，严防孔间交叉污染。2 实验中要设定无抗原的空白对照、阳性对照和阴性对照。第二部分 溶组织内阿米巴致病相关的功能实验实验目的：掌握溶组织内阿米巴滋养体和包囊
6、的形态特征及致病特征；熟悉溶组织内阿米巴滋养体的伪足运动、吞噬红细胞作用及阿米巴病的免疫学和分子生物学诊断方法；了解溶组织内阿米巴致病的分子特征和溶组织内阿米巴的培养方法。实验一 溶组织内阿米巴吸附红细胞抑制实验实验原理溶组织内阿米巴滋养体可借助其一系列的致病因子侵袭宿主组织器官，尤其是半乳糖/乙酰氨基半乳糖凝集素(Gal/GalNAc lectin)，可介导滋养体附着于宿主结肠上皮细胞等细胞表面，进一步引起细胞溶解、组织破坏并形成溃疡。实验材料和方法试剂溶组织内阿米巴HM11MSS（标准株），美国NIH Dr. L.S.Diamond Lab引入，美国ATCC 注册，本实验室保种A液：0.5
7、M 葡萄糖 B液：0.5M 葡萄糖 C液：0.5M乙酰氨基半乳糖 D液：PBS2.5戊二醛器材 普通光学显微镜 离心机 加样器 细胞计数板 主要步骤：1溶组织内阿米巴HM11MSS的无菌培养（教师准备）2红细胞吸附抑制实验1） 将阿米巴培养管置于冰上10分钟，上下颠倒混合，以使滋养体从试管壁上脱落于培养液中2） 400g 离心2分钟3） 弃上清液，加入PBS，调节阿米巴终浓度为105/ml4） 分别取100ul阿米巴液至4个1.5ml离心管中，各加入A液100l，B液100l，C液100l，D液100l，颠倒混匀，室温静置5分钟5） 400g 离心2分钟6） 弃上清液，加入50l PBS和50
8、ul红细胞（106/ml）,混匀7） 冰浴10分钟后转入15ml 离心管中，加入10ul 蒸馏水，迅速于600rpm离心1分钟8） 加入2.5戊二醛，固定30分钟9） 400 rpm 离心2分钟，重复2次10） 弃上清，剩余约100l，轻柔重悬11） 含0.2%H2O2的二氨基联苯胺（DAB）溶液中染色30分钟12） 400 rpm 离心2分钟，重复1次，镜下观察实验结果观察和分析镜下观察各组溶组织内阿米巴吸附红细胞情况并计数实验二 Dot-blot (斑点杂交)实验原理Dot-blot (斑点杂交)是一种常用的免疫学方法。将特定的阿米巴抗原点样在硝酸纤维素滤膜上，然后加入特异性阿米巴抗体与膜
9、上相应的抗原反应，再加入HRP酶标记的二抗，通过染色即获得相应结果。实验材料和方法试剂抗原：溶组织内阿米巴的重组蛋白，表面半乳糖/乙酰氨基半乳糖可抑制性凝集素的中介亚单位 (全长150kD)0.01mol/L PH 7.4 磷酸盐缓冲液（PBS）0.05 吐温20的PBS (PBST)封闭液：5脱脂奶（5g脱脂奶/100mlPBS）阿米巴病人血清及健康人血清辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体（anti-human IgG-HRP）显色液1M PH7.6 Tris-Hcl 90ul3%CoCl2 100ul DAB 6mg蒸馏水 9.8ml临用前加30H2O2 10ul 器材硝酸纤维素滤膜， p
10、arafilm封口膜，湿盒等 主要步骤：1. 剪膜 (1.5cm4.0cm) 2. 将2ug抗原按2l/次，分次或分别点样于膜上，室温晾干约30min3. 准备湿盒，将玻片置于相关支架上，盒中加上适量的水或PBS，剪大小适当的parafilm封口膜贴在玻片上4. 将膜置于parafilm上，加封闭液约500ul覆盖膜，静置于湿盒中30分钟5. 吸去封闭液，加以封闭液稀释的病人血清及健康人血清350l (1:200)，静置1小时6. 吸去血清，以PBST洗膜。换液间隔时间依次为5min、5min、10min、10min7. 将膜置于湿盒中的玻片上，加1：500稀释的抗人IgGHRP 350l，静
11、置1小时8. 吸去抗体，PBST洗膜，换液间隔时间同上9. 将膜浸入显色剂中，以膜背景不被染色为度（一般显色时间不超过30min）实验结果观察和分析 根据滤膜的显色情况判断结果，阳性反应呈棕色或棕黄色。实验三 IFA诊断阿米巴病实验原理免疫荧光试验 (Immunofluorescence assay，IFA）是诊断阿米巴病的常用免疫学方法。其基本过程是将纯培养的溶组织内阿米巴滋养体洗涤除去培养基后，固定，尔后加样在在特定的玻片上，经封闭后加入不同稀释度的待测血清，再加入荧光素（FITC）标记的二抗，在荧光显微镜下观察荧光的有无和强弱来判断结果。实验材料和方法试剂溶组织内阿米巴HM11MSS（标
12、准株），美国NIH Dr. L.S.Diamond Lab引入，美国ATCC 注册，本实验室保种抗原片（由HM11MSS标准株制备，20冻存备用）0.01mol/L PH 7.4 磷酸盐缓冲液（PBS），封闭液：3脱脂奶（3g脱脂奶/100mlPBS），阿米巴病人血清及健康人血清FITC标记的抗人IgG抗体（anti-human IgG-FITC）器材荧光显微镜， 洗缸，湿盒等主要步骤：1封闭：取出抗原片，每孔加50ul 封闭液，置湿盒内室温15min 2加待测血清及阴性、阳性对照血清将不同稀释度的待测血清（1：16，1：64，1：256，1：1024，1：4096）及阴性对照（1：16，1：
13、64）、阳性对照（1：256，1：1024，1：4096）以每孔50ul 加入抗原片上，置湿盒内室温30min3 洗涤：在特制洗缸内以PBS洗涤15min，期间换洗液3次。4 加荧光素标记的二抗：1：100稀释荧光素标记的抗体（稀释液为3脱脂奶），每孔25ul，置湿盒内室温30min（避光），洗涤15min, 同上5 加50甘油PBS，盖上盖玻片，于荧光显微镜下观察。实验结果观察和分析 在荧光显微镜下观察荧光的强弱来判断结果实验四 溶组织内阿米巴病的PCR诊断实验原理PCR基本原理及方法是依据细胞分裂中的 DNA半保留复制机理以及dNTP分子在不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制
14、体外合成系统的温度，以促使双链变成单链DNA；单链DNA与人工合成的引物退火以及在dNTP存在下，耐高温的DNA聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链DNA。依据PCR基本原理，通过特异性引物从溶组织内阿米巴的DNA中扩增获得相应的特异性片段，根据琼脂糖凝胶电泳上是否存在特定的DNA片段判断结果。实验材料和方法试剂碘液（碘5g, 碘化钾10g, 蒸馏水100ml）10%甲醛-PBS 乙醚Triton X-100 2Lysis buffer: 0.2M NaCl 20mM Tris-HCl pH 8.0 20mM EDTA pH8.0 4% SDS苯酚/氯仿/异戊醇 (25:24:1)PCR 实验相
15、关试剂1） 10X buffer2） Taq酶3） dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP): 各2.5mMol4） 引物p11、p125） 消毒蒸馏水6） 致病性阿米巴DNA7） 电泳缓冲液 0.04mol/L Tris-乙酸 0.001mol/EDTA配制40ml 2%的琼脂糖(Agarose)溶液：称取Agarose 0.4g入250ml的烧瓶中，加入40ml电泳缓冲液，微波炉加热溶解，待琼脂糖溶液温度降至75度时，加入溴化乙锭溶液(1mg/ml)20l，混匀，使终浓度为0.5g/ml。倒入电泳板中，冷却备用。器材离心机、摇床、PCR仪、电泳槽、紫外成像系统等主要步骤：
16、一醛醚沉淀法取粪便1g左右（黄豆大小），加PBS混匀制成悬液，滤过二层纱布以去除粗渣，滤过液2500rpm离心1分钟，弃上清液，沉渣加入10%的甲醛-PBS 5ml, 固定30min，加入3ml乙醚，剧烈振摇1分钟，2500rpm离心1分钟，弃上层液，以棉签檫净试管壁上的残液，直接镜检或碘液染色镜检。（若为可疑AIDS病人，为安全起见，可直接以10%的甲醛-PBS 5ml或更多固定30min，再离心调节体积为5ml，余下步骤同前）二溶组织内阿米巴DNA的提取1沉渣反复冻融3-6次（冻 -30C或-80C 10min, 融 37C 2min）2加Triton X-100, 使终浓度1%1.25%
17、，100C煮沸10min3冷却至室温，加入蛋白酶K，使终浓度为0.5mg/ml, 再加入等量Lysis buffer(2)，55C缓慢振荡数小时或过夜，60度振荡1小时。4加入等量酚：氯仿：异戊醇=25：24：1，缓慢振摇数小时或过夜。15000转离心2min， 取水相，转移入新管中。5重复步骤4两次。6. 15000转离心2min，取水相，转移入新管中,估计容量。加入10% 3mol/L的乙酸钠和2-2.5 倍的无水乙醇，-20度过夜。7.15000转离心10min，弃上清液，加70%乙醇悬浮。15000转离心10min，弃上清液，自 然干燥，加适量双蒸水溶解备用。注：滋养体DNA抽提，与包
18、囊相似，但更简单，只要取含脓血的粪便，加入等量的Lysis buffer和最终0.5mg/ml的 蛋白酶K，55C数小时而后60C12小时，再P/C/I抽提，余下相同。组织液、脓液中的虫体DNA提取则要根据组织的性质而定，组织液若粘稠可用不含针头的OT针筒从送样品的盛器中取0.1ml，若为一些稀释的组织液可以高速离心后沉渣加Lysis buffer溶解。三PCR1. 取0.5ml薄壁管，依次加入 消毒水15l 5 Buffer 2.5l 5 MgCl2 1.5l 5 dNTP 2l 5 p11 1.25l 5 p12 1.25l 5 Taq酶0.5l 5 DNA 1l 5 （最后加） 共125
19、l，分装成五管。 2PCR程序设置：94 94 59 72 722min 15 sec 30sec 60 sec 1min34 cycles6 启动PCR仪，待温度升至80时将试管放入。7 PCR结束后，取10l DNA液与2l溴酚蓝指示剂混合上样，同时上样DNA Marker 1ul， 100V电泳约25分钟，紫外成像系统下观察结果并拍照记录结果。实验结果观察和分析 通过观察琼脂糖凝胶电泳上是否存在特定的DNA片段进行诊断。第三部分 滴虫病相关实验实验一 滴虫病的药敏试验实验原理 选用对阴道毛滴虫的代谢有抑制阻断作用的药物，经孵育后以台盼兰染色观察死亡的虫体数并设无关药物作为对照组。实验材料
20、和方法试剂阴道毛滴虫虫株由美国ATCC引入，本实验室保种甲硝唑和吡喹酮阴道毛滴虫纯培养用的培养基（同溶组织内阿米巴培养，但pH 5.8）苔盼蓝器材培养箱，细胞计数板，显微镜等主要步骤：1 培养：阴道毛滴虫从低温取出后复苏，培养24小时后更换培养基，加入pH 5.8的BI-S-33培养基，360.5培养72小时再进行转种。360.5培养，当生长72小时达到对数生长期后即可进行实验。（教师准备）2 药物培养基配制：用不含任何抗菌素的BI-S-33培养基将含10mg/ml甲硝唑和吡喹酮的备用液稀释成如下浓度：100g/ml、10g/ml、1g/ml、0.1g/ml；3 虫体准备：阴道毛滴虫培养生长7
21、2小时后，冰浴10分钟，上下颠倒混和，以血球计数板计数，1600rpm离心2min后调节虫体浓度，使之达到1106/ml，取10l，加等量的0.1苔盼蓝染色，保证活虫数在98后方可进行实验；4 实验操作：取1ml阴道毛滴虫培养液加入含不同药物浓度的培养基中，终体积为6ml，360.5培养12小时，并设不含药物培养基为对照。12小时后取培养管冰浴，滋养体以0.1苔盼蓝染色检查，每管检测100个，观察死亡的虫体数。实验结果观察和分析 在普通光学显微镜下观察存活的阴道毛滴虫的百分率来判断结果。 附：阿米巴培养一 有菌培养主要用Robinsons培养基，不仅可以培养溶组织内阿米巴，也可以培养哈门氏内阿
22、米巴、结肠内阿米巴、微小内蜒阿米巴等多种阿米巴。一般应用6ml7ml或更小的螺旋有盖培养管。组成成分：1. 盐水琼脂斜面：溶解15g琼脂粉和8g氯化钠于1000ml蒸馏水中，加热溶解。分装在小试管(23ml)中高压灭菌(121,15min)，当琼脂冷却至75左右，倾放使其形成斜面。2. 红霉素：将0.5g实验室用红霉素粉剂置于无菌容器中，加入20ml 70%乙醇溶解，4放置2小时以上，而后加灭菌水至50ml。3. 米粉：市售梗米粉经高压消毒或180干燥灭菌。4. 配制50mmol邻苯二甲酸氢钾（Phthalate），pH6.3，高压灭菌。5. 血清(牛或马血清)：56 30min灭活。6. 大
23、肠杆菌培养液(R液)： NaCl 5g (NH4) 2SO4 1g 柠檬酸.2H2O 2g MgSO4.7H2O 0.05g KH 2PO4 0.5g 乳酸(90%纯度) 0.4ml加水至95ml，调节pH至7.0，最终调节容量至100ml，制备成贮存工作液。使用前稀释，将10ml贮存液加入85ml双蒸水，调节pH至7.0，高压灭菌。7. BR基础阿米巴培养液：25ml R液中加入1个克隆的细菌或1ml细菌，37振摇培养2448小时。8. BRS完整阿米巴培养液：在上述BR溶液中加入等量血清，继续培养24小时48小时即可备用。含阿米巴包囊的粪便培养操作步骤：在含琼脂斜面的培养管中加入10mg米
24、粉、120ml红霉素液和足够遮盖斜面量的邻苯二甲酸氢钾和BRS液(4:1混合液)，加入少量(约50mg)粪便，混匀，37培养24小时后，移去培养上清液，再 加入适量4:1混合液和60ml红霉素和米粉。37继续培养48小时后，取米粉与粪渣混合物一滴，显微镜下观察有无滋养体；若未发现虫体，则再加入米粉，继续培养24小时观察。若发现虫体可将少量培养混合液转入新鲜培养基中继续培养，即为转种。并可进一步转成无菌培养。二、无菌培养最常用的是BIS-33培养基，也称TYI-S-33培养基，几乎可用于所有的内阿米巴属原虫、蓝氏贾第鞭毛 虫、阴道毛滴虫等。培养在6ml的玻璃有盖培养管中，由于阿米巴为兼性厌氧代谢
25、，故应紧盖管盖，并呈5的角度放置。BIS-33培养基含三个组分，即营养液、维生素混合液、成牛血清。营养液(870ml) 消化蛋白胨、酵母提取物混合物 30g 葡萄糖 10g NaCl 2g KH 2PO4 0.6g K2HPO4 1.0g L-半胱氨酸盐-HCl(L-Cystein-HCl) 1g 维生素C 0.2g 枸橼酸铁胺(棕色结晶) 22.8mg 溶于600ml双蒸水中，调节pH至6.8，最终容量调至870ml，分装，121消毒，20分钟。压力降至零后速取出。冷却后，于-20贮存。维生素培养液(1000ml) 溶液A： 烟酰胺 (Niacinamide) 45mg 盐酸维生素B6 (p
26、yridoxal hydrochloride) 4mg 泛酸钙(Calcium pantothenate) 23mg 盐酸硫胺(thiamine hydrochloride) 5mg 维生素B12 1.2mg 均溶于双蒸水，定容至25ml；溶液B：核黄素(Riboflavin) 7mg 加0.1N NaOH数微升使其易溶解，再加双蒸水至45ml;溶液C：叶酸(Folic acid) 5.5mg加0.1N NaOH数微升使其易溶解， 加双蒸水至45ml;溶液D：d-生物素(d-Biotin)2mg，加双蒸水至45ml;溶液E：DL-6,8-硫辛酸(DL-6,8-硫辛酸)1mg，溶于5ml 95%
27、乙醇中，加入500mg Tween80 上述各液混合，定容至200ml，0.2mm滤膜过滤灭菌，4暗处保存。 成牛血清成牛血清56灭活3.54小时，分装，-20保存。完全培养剂：营养液87ml，成牛血清10ml或15ml，维生素混合液2ml，混合，冷藏备用。有菌转无菌培养1. Robinsons培养基上生长的溶组织内阿米巴滋养体，当生长到对数生长期时，将每管的上清液吸去一部分.然后将各管液体混合至同一离心管，自然沉淀12分钟，再吸弃部分上清液，再混匀。2. 将混合物加入含滤纸的三角漏斗中，收集滤液，同时不断加少量温暖的BIS完全培养液保持滤纸湿润。3. 向滤液中加入抗菌素(10倍于常量)：如1000 u/ml青霉素，1mg/ml链霉素，1000单位多粘菌素/6ml。同时加入固定的短膜虫。37斜放培养。 4. 24小时后，弃全部培养基，加入新鲜的BIS培养基、固定的短膜虫和抗菌素。 5. 待虫体大量增长后，可按常规转种，同时加入半量抗菌素和固定的短膜虫。经两周左右可以完全无菌化。 附：短膜虫培养：将大量培养的虫体3000转15分钟离心收集，无菌PBS洗3-4次。4下无菌10%PBS福尔马林固定24小时。再用无菌PBS洗涤5-6次，4贮存备用。