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1、第九章 干细胞第一节 干细胞概述一、干细胞( stem cells)与个体发育正常生物个体发育的过程是按严格的时空程序进行的一系列细胞分裂、分化和细胞凋亡相互协调作用的结果。从一个受精卵、全能胚胎干细胞或组织谱系干细胞最终分化为具有独特功能体细胞所组成的组织器官,这是一个彼此协调而又制约的复杂过程,这一过程通常被称为发育的遗传程序(genetic program) ,被记录在细胞基因组的结构中。不同物种有不同的遗传程序,这可能是物种在长期进化过 程中逐渐形成的。在哺乳动物个体发育的不同阶段,包括胚胎、幼年和成年个体的各个发育时期,都存在着发育潜能参差不同的干细胞。干细胞最终演变为独特结构和功能
2、的体细胞或成熟生殖细胞,这过程即是所谓细胞分化。从分子水平而言,可以认为细胞分化是部分基因选择性地被激活或差异性表达,从而控制专一性蛋白质的合成和排布的结果。对正常细胞分化来说,最重要的是多个基因表达过程在数量和时空上的精确联系和密切配合,并受不同层次的基因调控网络系统精确无误地调节和控制。干细胞在胚胎和成体组织内部的活动,包括干细胞基本特性的分子机制和调节控制、胚胎细胞的迁移活动、时空程序与相邻胚胎细胞的相互作用,对细胞增殖和分化的关系等,虽已有所了解,但由于技术上的原因,直接证据还很少,因此,干细胞增殖和分化问题仍是今天发育生物学研究的主题内容之一.二、干细胞的定义和分类因干细胞是指一类具
3、有自我更新和产生分化后代这两种基本特性的细胞。 一个充满生命力的雌雄两性机体都是由两类不同的组织和器官构成的。一类是全部由体细胞组成的,另一类是以生殖细胞为主的,也包括一些由体细胞组成的组织和器官构成的。前者是执行机体生命活动各种生理功能的;后者一切都为了保证生殖系统的卵巢和辜丸中的卵子和精子的发育和成熟并延续生命的。对人类来讲,从一个受精卵的单细胞要产生200多种不同类别的细胞来构成各种组织和器官,必然要靠全能性的早期胚胎干细胞通过自我更新和产生分化后代来实现的。自我更新是指干细胞可进行均等分裂,产生两个遗传特性上完全一样的干细胞,均等分裂是大多数细胞的特性,而产生分化后代指的是干细胞还可进
4、行不均等分裂,产生的两个子代细胞中一个仍是干细胞,而另一个是遗传特性有所不同的,要开始走上分化道路的定向祖细胞。早期胚胎细胞是全能的,它既可产生体细胞,又能产生生殖细胞,这包括从早期的卵裂球和囊胚期的ICM细胞以及后来胚胎的3个胚层已分化后的生殖嵴区的原始生殖细胞;而分化的后代细胞可从包括全能细胞向多能细胞和细胞谱系的各级祖细胞发展,这些细胞仍旧可通过均等和不均等两种分裂方式进行繁殖,一直到最后的终未分化体细胞。干细胞可分为两类:一类干细胞包括从早期囊胚ICM (inner cell mass)细胞分离并在体外培养和建系的胚胎干细胞(embryonic stem cells,简称ES细胞)和从
5、胚胎生殖嵴原始生殖细胞(primordial germ cells, PGC)分离建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells,简称EG细胞) ;另一类是先在成年组织和器官,以后在胎儿组织被证明其存在,随后个别也在体外培养和建系成功的干细胞, 称为组织干细胞( tissue stem cells) ,又称成体干细胞(adult stem cells) 。三、胚胎干细胞研究简史哺乳动物早期胚胎体积小,又在母体子宫内发育,因此,要在体内对各类干细胞的分化及其机制进行 实验研究几乎不可能。从20世纪50年代开始,人们一直在致力于寻找一个既能在体外增殖,又具有胚胎细胞全能性(totip
6、otency)或多能性的(pluripotency)并通过适当条件能被诱导分化为各种类型分化细胞的实验模型。20世纪50年代末美国发育生物学家Stevens (1967)将着床前发育阶段的小鼠胚胎(包括受精卵) 或12天胚龄的胚胎生殖嵴异位移植到同系成年小鼠辜丸或肾脏被膜下,移植后7天,发现有80%接种灶出现并发展为畸胎瘤。从中分离、培养和建立了胚胎性癌细胞(embryonal carcinoma cell, EC)系,揭开了胚胎性干细胞早期研究的序幕。EC细胞既具有恶性生长又具有早期胚胎细胞发育多潜能性的双重性质。在20 世纪70年代, EC细胞常用作研究哺乳动物发育遗传以及细胞分化的实验模
7、型,并取得了一些重要结果。后因EC细胞核型异常,分化细胞类型有限等缺点而不再被使用。20世纪80年代初,英国Evans和Kaufman以及美国Martin 2家实验室独立地从小鼠囊胚成功地建立了能在体外不断增殖,并维持不分化状态的多潜能胚胎干(ES)细胞系,开创了ES细胞生物学研究的新时代。但此后ES细胞在其他动物上的分离和建系却颇受挫折,直到20世纪80年代后期才有所突破,见表 19.1。 20世纪90年代初,美国Matsui等从小鼠9天胚胎生殖嵴建立了多潜能的胚胎生殖细胞系,同一时期,少数其他动物也相继建立了ES或EG细胞系。1998年美国威斯康星大学Thomson等人利用36枚新鲜或冻存
8、的人工体外受精胚胎,获得人ICM细胞,经体外培养后,首次成功地建立了5株人类ES细胞系,同年, John Hopkins医学院Shamblott等人从5 -9周人流胚胎的生殖嵴和肠系膜首次培养出人EG细胞系。第二节 胚胎干细胞胚胎干细胞又称ES细胞主要是指从早期胚胎的卵裂球、囊胚ICM细胞分离培养和建系的细胞。而从胚胎生殖嵴中PGC分离培养建成的称胚胎生殖细胞简称EG细胞。这2类干细胞统称为胚胎性干细胞,其最基本的重要特性是具有稳定地在体外自我更新并保持不分化和发育的多能性,即可以在体外分化为属于3个胚层的各种细胞。一、ES和EG细胞培养、建系技术体外培养建系ES和EG细胞的技术以小鼠的最为成
9、熟,成功率最高,其基本原则是有赖于获得全能性胚胎细胞或细胞团并建立体外适合其增殖和抑制分化的培养系统。由于早期胚胎细胞离体后极易发生分化,首先要解决阻止其分化、确保维持其全能性或多能性这一关键问题。目前常用的细胞分化抑制物主要有3种:饲养层细胞( feeder layer cells)、特殊细胞的条件培液(conditioned medium) ,如BRL (Buffalo rat liver)细胞条件培液,分化抑制因子(differentiation inhibitory factor, DIF) ,如白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF) 。此外,
10、也有添加通过gp130信号转导途径的细胞因子,例如,白介素6 (lL一6)、Oncostatin M和睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)等同样可达到维持小鼠ES细胞的不分化状态。 因此,体外培养ES和EG细胞可划分为两大类:饲养层培养法和无饲养层培养法。(一)饲养层细胞培养法不论ES细胞或EG细胞,原代或初期培养阶段一般都需依赖于能分泌使它们在体外存活和增殖所必需生长因子的饲养层细胞。不同类型的饲养层细胞分泌的生长因子略有不同。但都要求在ES或EG细胞培养过程中的饲养层细胞保持不分裂增殖,而仍然保持细胞的代谢活性。常用的饲养层细胞有下列两种:
11、一种是取自各种品系小鼠交配后12 dpc (days post coitum)的胚胎成纤维细胞(embryonic fibroblast, MEF) 。经丝裂霉素C (mitomycin C)处理以终止细胞分裂后,用作ES细胞培养的饲养层。另一种是来自SIM小鼠 (S)胚胎的对硫代鸟嘌岭(thioguanine, T)和乌本苷(ouabain, O )有抗性的成纤维STO细胞系,主要分泌干细胞生长因子(stem cell factor, SCF)和白血病抑制因子(LIF)。此外,SL - M220细胞是小鼠胚胎造血的基质细胞SI/SI4经基因改造产生专一性跨膜型SCF的细胞系,以它作为饲养层更
12、有利于促进EG细胞生长。用作 ES细胞或EG细胞培养的饲养层的MEF或STO细胞均需用10 mg/L丝裂霉素C在370C灭活,用前经PBS 彻底洗涤。(二)无饲养层培养法饲养层细胞的制备在一定程度上使ES和EG细胞培养过程显得较为繁杂。近来以添加某些特定细胞的条件培养液和LIF生长因子至含胎牛血清(FCS)的正常培养液,借此替代饲养层细胞。有3种条件培养液可用于小鼠ES细胞培养:直接在ES细胞基础培养液中加入重组生长因子和LIF等。Buffalo大鼠肝细胞条件培养液(BRL-CM)。2 -3周龄幼年大鼠心肌细胞条件培养液(RH - CM) 。一般以2 -3份上述细胞条件培养液加1 - 2份新鲜
13、的ES细胞培养液,再添加10% - 20%胎牛血清,共同组合成无饲养层的ES 细胞培养系统。但往往在胚胎干细胞原代和建系初期缺乏饲养层时,用这种条件培养液培养ES和EG细胞成功率不高,因此,正确使用饲养层细胞和条件培养液在ES/EG细胞建系初期仍是成功的一个关键因素。(三) ES和EC细胞的体外培养1. ES细胞不同动物,甚至同种不同品系动物的胚胎发育速度和方式存在着较大差异,例如,猪ICM细胞生长与 小鼠的不一样,其生长速率很慢,且有一个休眠(quiescent)时期。因此,ES细胞培养建系需根据各个物种而选择不同发育阶段的早期胚胎。例如,一般小鼠多选用3 -4 d的囊胚或2 - 3 d的桑
14、椹胚,猪取8 - 10 d 的囊胚,绵羊取8 -9 d的囊胚,人和牛取7 -8 d的囊胚。同时,经体外受精的胚胎或由核移植获得的重构胚胎在体外培养至所需适当的发育阶段也是选取ES细胞培养的有效材料来源。基本培养液为含15% - 20% FCS、0.1 mmol/L-疏基乙醇和50IV/mL青霉素、50g/mL链霉素的 DMEM液.将桑椹胚或囊胚接种于预先铺有作为饲养层而无有丝分裂活性的单层MEF细胞的35 mm培养皿中。培养2 -3天后按下列两种方法之一分离出ICM细胞进一步培养:方法一：免疫手术法(immunosurgery)。由于4 - 4.5 dpc的小鼠囊胚主要由己分化的滋养外胚层(t
15、rophectoderm)和未分化的ICM细胞组成,前者细胞表面一般已表达主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC) ,能识别其相应抗体和形成免疫复合物,在补体存在时可导致细胞发生免疫溶解。 囊胚去除透明带,直接暴露于稀释的兔抗JCR小鼠脾细胞抗血清(抗H - 2b)。再移到新鲜豚鼠血清中, 囊胚的滋养外胚层细胞呈泡状,发生免疫溶解;而ICM细胞不具H -2b抗原,不发生免疫溶解,故细胞完整元损。ICM细胞经Hanks液洗涤后,移至96孔铺有MEF或STO饲养层细胞和DMEM基本培液的板内进一步培养。方法二:常规培养。桑椹胚或囊胚在铺有M
16、EF饲养层的DMEM基本培养液中,未去透明带的桑椹胚或囊胚培养3 -4 d,ICM细胞团从贴壁的囊胚内长出来。吸出ICM细胞团,用0.25% (m/V)膜蛋白酶(trypsin)和0.2 mmol/L EDTA混合消化液在370C消化5 min.部分解离的细胞团移至铺有MEF饲养层的24孔培养板, ICM细胞首先出现贴壁生长,继续培养4 d,可在一些孔内见到巢状集落生长的ES细胞团。用胰蛋白酶消化巢状ES细胞团,并继续培养,一般4 -5 d间隔用胰蛋白酶消化,克隆和纯化ES细胞,视ES细胞密度逐渐转移到较大容积的培养皿或培养瓶。ES细胞在培养过程中,有时在巢状干细胞团周边出现少量分化细胞,这时
17、除了需继续维持饲养层细 胞外,在培液中再添加适量的LIF生长因子,可克服细胞进一步分化的现象。但有的物种例如猪ICM细胞对LIF并不敏感,难以抑制其在体外分化,巢状集落形成率很低, LIF不适用。ES细胞常用培养基的添加物除胎牛和小牛血清外,主要有多种生长因子,例如表皮生长因子(ECF) ,可促进细胞DNA合成和 mRNA转录,使细胞周期的S期提前,周期缩短;胰岛素样生长因子( ICF)对ICM细胞有促进增殖作用; 干细胞生长因子( SCF)对干细胞有调控和促分裂作用,同时可抑制细胞凋亡。此外,在培液中还需添加还原剂-巯基乙醇,可使血清中的含硫化合物还原成谷胱甘肽,以消除ES细胞培养过程中产生
18、的毒性过氧化物,同时,-巯基乙醇有诱导细胞增殖和促进胚胎细胞贴壁作用。近来注意到血清可抑制一些种类ES细胞形成克隆。因此,根据不同物种ICM细胞在体外生长状况,需要对基本培养液中的各种添加物作适当调整。2. EG细胞哺乳动物PGC细胞最早发生于近尿囊基部的卵黄内胚层内,随着胚胎发育和纵向转折,卵黄囊的一部分成为胚胎的后肠,PGC细胞也随此经背侧系膜向生殖嵴移动。因此, PGC取材主要根据其在不同物种的早期胚胎中所处迁移位置而定。小鼠EG细胞建系基本过程如下：收集8. 5 - 10. 5 dpc小鼠胚胎,在解剖镜下用镊子剖取包含原始生殖细胞(PGC)的生殖嵴组织，以0.02% EDTA液孵育含P
19、GC细胞的生殖嵴组织, 37 0C , 15 min。吸管轻吹打散,接种于铺有MEF或STO饲养层细胞的4孔培养板内。接种细胞首先出现贴壁生长,每天或隔天更换培养液。生殖嵴组织培养物在饲养层细胞上分裂增殖,4 - 6 d后在显微镜下将包含原始生殖细胞的细胞团用胰蛋白酶消化并转移至新的饲养层细胞上,继续培养增殖。重复用胰蛋白酶消化并移至新的饲养层细胞,经过同上2 -3次过程,一般可产生巢状(nests)生长的干细胞集落。最后将它转移到铺有饲养层细胞的培养瓶内进一步扩增。 EG细胞的饲养层常用STO细胞,培养液基本同ES细胞,但除LIF外还要添加干细胞因子(SCF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFG
20、F)。二、ES和EG细胞系基本特性(一)体外能无限增殖建系后的ES细胞在体外培养不仅能存活,还能无限增殖,这是干细胞自我更新基本特性在体外培养 中的延续。假使在培养条件合适时,ES细胞可以在体外无限增殖。但实际上,传代次数愈多,ES细胞会像常规细胞一样,出现核型不正常的情况,并失去了ES细胞原有的一些重要特性。129品系小鼠的ICM细胞是非常容易建立的ES细胞系,而其他品系的小鼠就不那么容易了,说明遗传因素是制约ES细胞建系成功与否的一个条件。ES细胞和EG细胞来自不同的发育阶段,在遗传上是有区别的,如EG细胞的胰岛素样生长因子受体基因甲基化印记修饰等,这在人和其他大动物可能一样。猪EG细胞我
21、们已建系成功,但猪ES 细胞只能在体外短期存活,还未能建系。关键可能还是培养系统不合适。表明同一品系的ES和EG细胞的培养建系条件也并不相同。(二)体外产生分化细胞ES细胞的这个重要特性同样是干细胞产生分化后代这个基本特性在体外培养中的延续。由于早期胚胎细胞离体后极易发生分化,因此,ES和EG细胞体外培养的首要条件是建立适合其增殖、抑制其分化、确保维持其多能性的培养体系。ICM细胞一般接种于铺有灭活的小鼠MEF细胞作为饲养层的琼脂平板上,加有含抑制分化的LIF的培养液,或再添加适当的分化诱导物质(如维甲酸等) ,或通过悬滴培养成拟胚体 (embryoid bodies, EB)等特定的条件下,
22、都极易分化产生包括3个胚层的各种类型的分化细胞,常见的是几种类型细胞混杂在一起,单一类型的细胞要靠定向诱导分化。EG细胞的分化细胞也属于3个胚层的,但工作和分化细胞种类的报道都比较少见。从1981-2003这20余年中,这2类胚胎干细胞所分化的细胞都是体细胞,未见有分化为生殖细胞的报道。这样人们就自然形成了胚胎干细胞是多能性 (pluripotency)的概念。2003-2004年国外发表了几篇文章,证明体外培养的ES细胞能产生雌、雄两性的生殖细胞,过去要证明体外培养的ES和EG细胞是否具有发育全能性,要靠把带有各种标记的干细胞注射至囊胚,再通过种系传递实验先寻找干细胞嵌合到卵巢或辜丸的动物,
23、再通过育种寻找干细胞参与卵子或精子的动物,并作纯系繁育,对大动物来说,这种嵌合体实验要花大量人力、物力和二三年时间才能完成。现在能在体外用实验证明培养的ES细胞具有发育为精子和卵子的能力,实现了体外培养的ES细胞也能表达全能性 (totipotency)概念,这不能不说是ES细胞体外定向诱导分化的一个重大突破。目前个别实验室已先后得到相同的结论,今后若能有更多类似工作的重复和考验,必将使干细胞研究推向新阶段。(三)体内产生畸胎瘤ES和EG细胞若接种于免疫缺损小鼠(裸鼠或SCID小鼠)腋窝下,或接种于同种同基因小鼠的皮下、眼窝和器官包膜下,均可形成由内胚层、中胚层和外胚层多种类型细胞构成的畸胎瘤
24、。后者通过组织学检查, 可以用作分析和鉴定ES或EG细胞的发育多潜能性,判断所产生分化细胞种类的多寡。 (四)巢状生长有多能胚胎干细胞分子标记ES和EG细胞在体外彼此呈现单层或多层紧密堆积,而形成岛状或巢状集落群体的生长形态。将这种岛状或巢状群体细胞的克隆挑出,用胰蛋白酶轻度消化后接种于新的饲养层或特定的条件培养液中,继续培养3 -4天后,分散的ES细胞或EG细胞又重新长出彼此紧密接触的岛状或巢状群体细胞克隆。根据经验,用dispase酶代替胰蛋白酶消化可使EG细胞少受损伤,集落形成率较高。因此,呈巢状集落生长是ES和EG细胞最具特征性的生长方式。但是,不同动物ES和EG细胞巢状集落是有所不同
25、的。例如,猪EG细胞也有自身的形态学特性,猪EG细胞集落常是圆的,比小鼠ES和EG细胞集落较扁平和较不透明。在扫描电镜中,猪EG细胞彼此比小鼠的更具有粘附性,难以解离,再培养的种植率也比大多数小鼠ES和EG细胞的低得多。小鼠、猪和包括人类在内的灵长类动物的ES和EG细胞都具有特征性的多能胚胎干细胞的分子标记, 主要的分子标记列于表19.2.除牛的ES细胞不表达碱性磷酸酶(AKP)活性外,其他动物和人的ES或EG细胞都表达AKP的活性。分化的ES或EG细胞都不表达AKP。因此,AKP活性可作为ES或EG细胞是否分化的重要标记之一。胚胎发育阶段特异性抗原(stage specific embryo
26、nic antigen, SSEA)是早期胚胎细胞表面的一类糖蛋白,不同种类的SSE A因糖基化不同而区分为SSE A -1、SSEA -3和SSE A -4不同的表位分子。未分化的早期胚胎细胞 SSEA呈阳性,而分化的细胞为阴性。人和灵长类ES细胞表达SSEA -3和SSEA -4,而SSE A-1仅在人EG 细胞及刚开始分化的ES细胞中表达。小鼠的ES和EG细胞只表达SSE A-1.肿瘤相关抗原(tumor related antigen, TRA)是一种对唾液酸酶敏感的细胞表面糖蛋白,生殖细胞肿瘤标记(germ cell tumor marker, GCTM)是另一类抗原决定簇不同于TR
27、A的细胞表面糖蛋白。人及猴的ES细胞 与TRA -1 -60、TRA -1 - 80和GCTM -2抗体均可起反应。人与猴是近亲,因此,人与猴的ES细胞都表达 TRA分子,而啮齿动物小鼠却缺(见表19.2) ,推测TRA可能是灵长类多能胚胎干细胞特异性的分子标记。Oct -4是生殖系专一性转录因子,在小鼠胚胎发育早期、生殖细胞谱系以及体外培养的多能胚胎干细胞中特异地表达,被认为是全能和多能性的一种标志基因。小鼠、猪和包括人类在内的灵长类动物的ES和 EG细胞都表达Oct - 4(表19.2) 。(五)染色体数目和核型正常无论是小鼠或人的ES和EG细胞,经体外传代培养后,具有正常的染色体数目和二
28、倍体核型,即使冻存复苏后应仍然保持这种特性。这里,冻存与复苏的条件是非常重要的,对不同的ES和EG细胞都应专门做实验寻找最合适的冻存和复苏的条件。新建立的ES细胞系常有不正常的核型,因此,需对新建系的ES细胞进行染色体数目和核型进行分析确认,特别是为遗传操作所用的ES细胞,染色体数目和核型必须正常。同时,与普通培养细胞一样,ES和EG细胞经体外长期培养、冻存、复苏和传代,染色体和核型也会发生变化。因此,长期培养的ES和EG细胞也应做染色体数目和核型检查。(六)遗传可操作性ES细胞遗传操作的可行性是由于ES细胞在体外可以不断地自我增殖,又是具有发育的全能或多能性, 并能通过构建嵌合体而产生有功能
29、的生殖细胞。这为通过基因工程途径改造物种提供了独特的、无与伦比的受体细胞,小鼠的ES细胞的实践也证明了这一点。一般体细胞由于增殖能力差,基因修饰或改造的效率比ES细胞的低得多。ES细胞遗传操作主要有2类方法：一是通过同源重组技术去剔除ES细胞基因组的一个目的基因,所谓基因剔除(knock out)途径,其二是转染一个外源基因定点整合到ES细胞基因组的正确位置,即所谓基因定点敲入(knock in)技术。常规基因随机整合技术缺点很多,不仅易导致内源有利基因结构失活和破坏,或者激活有害基因(如癌基因等)。而且导入的外源基因的表达水平也难以预测,导致可能产生异常表型的转基因动物。总之ES细胞的遗传可
30、操作性已成为胚胎干细胞生物学的另一重要的特性。(七)形成嵌合体实现种系传递参与嵌合体实现种系传递是ES细胞生物学的又一重要概念。这在前面已有提及,只有通过形成嵌合体实现种系传递即要分析干细胞是否能参与形成生殖腺中卵子和精子才能鉴定体外培养建系的ES和 EG细胞是否具有全能性。自从20世纪80年代初小鼠胚胎干细胞建系以来,这技术是一直被沿用的,但小鼠ES细胞的生殖细胞嵌合率要高于小鼠EG细胞很多,其他动物的这类嵌合率与小鼠ES细胞相比较的材料也没有。对大多数动物而言从胚胎的ICM细胞和胚胎生殖嵴原始生殖细胞得到的体外培养建系的ES和EG细胞都应具有上列7点基本特性,这也是ES和EG细胞建系的鉴定
31、指标。人ES和EG细胞除了第七点因伦理道德原因不能实施外基本上也具有上述基本性质。三、ES和EG细胞定向诱导分化(一)基本原理细胞诱导分化是一个细胞与其微环境相互间复杂而又精密协调的分子细胞学过程。早在20世纪六七十年代前,实验胚胎学家就发现蛙类早期原肠胚(gastrula)的背唇(dorsal lip)的背方区域能够诱导外胚层分化为神经管,而靠近腹侧面则诱导出尾部结构。接着又发现胚胎发育中组织发生和身体构造形成是一连串的诱导连锁过程,例如神经组织听囊形成后,则诱导邻近的间质细胞形成软骨囊;水晶体则剌激覆盖的外胚层诱导出角膜。在体胚胎的细胞分化过程中, 诱导作用的结果不只是决定于各种诱导物质的
32、性质和专一性,同时也决定于被诱导细胞的反应能力( competence) ,后者受遗传、发育潜能等内在因素的限制。诱导物质的专一性和被诱导细胞的反应能力必须在时空上相互巧妙配合,才能保证被诱导细胞按预定的细胞类型方向分化。ES细胞是体外研究诱导分化的较理想的模型。其在体外被诱导分化的途径可能不一定与在体胚胎细胞的完全相同,但在实验操作时,也应同时考虑诱导物的性质和ES细胞本身所具的反应能力这两个基本问题。在胚胎细胞被诱导分化实验中,所用诱导物质种类繁多,诱导模式也不尽相同,难以归类论述。但按作用机制大致可分为两类。一类是使被诱导细胞可逆性地轻度损伤:例如无机物、有机酸、醇、亚甲基盐、硫氢化物、
33、氨水甚至蒸馏水或缺钙的盐水,都能使两栖类胚胎细胞渗透压改变致成轻度损伤,导致神经细胞分化。 另一类诱导物,如类固醇激素、维甲酸衍生物(RA等) ,多肽生长因子(bFGF、TGF、Activin)等,则是通过其与被诱导细胞表面各自的受体结合而介导的细胞诱导分化。同一种诱导物可以诱导出不同类型细胞或变化多端的构造,问题较复杂,不仅涉及诱导剂的浓度差别、诱导作用模式和微环境的未知因素等,而且也可能与被诱导细胞本身的发育潜能和对诱导剂的反应性等差别有关。ES和EG细胞定向诱导分化是当前ES细胞生物学研究中的热点之一。(二)定向诱导分化的类型体外定向诱导分化可分为谱系分化(lineage differe
34、ntiation)和定向分化(committed differentiation)两种类型,第一种谱系分化包括ES细胞经谱系祖细胞(lineage progenitors)、谱系定型细胞(lineage committed cell) 到终末分化细胞的整个细胞分化的全过程。在这过程中,会出现一些不稳定的、过渡型的前体细胞。研究和分析这种过渡型的前体细胞,对认识组织谱系细胞的分子和细胞水平分化机制和全过程是有帮助的。但因为细胞呈一过性或连续性,定性和判断的标准尚有待探索。同时,由于ES细胞也是一种具有不受约束的和无序的自我发育特性, ES细胞在体外被诱导时常同时出现不同胚层类型的多种分化细胞,这
35、也增加了识别谱系祖细胞和谱系定型细胞的困难性。谱系诱导分化的途径可用于细胞分化的基础研究，但有关报道并不多。第二种定向分化则要设法控制ES细胞导向产生单一类型的终末分化细胞,这是当今临床细胞移植或细胞治疗迫切需要的,也是至今报道较多的,但仍未完全解决的、探索中的难题。根据国外报道和我们的经验,对ES细胞转染细胞专一的转录因子、标志基因或有关细胞分化因子等遗传操作,并结合报道基因和添加特定细胞因子诱导条件选择等手段,可能是探索ES细胞定向诱导分化的一条有效途径。(三) ES细胞体外诱导分化的基本途径1.单层ES细胞培养和诱导分化单层ES细胞在撤除LIF并添加适当浓度的细胞分化诱导剂,如维甲酸(r
36、etinoic acid, RA) ,二甲亚砜 ( DMSO)和环六亚甲基双乙酰胶(HMBA)等并添加适当的生长因子条件下,每隔2天,更换含诱导剂的新鲜培养液。细胞分化类型随诱导剂和生长因子性质及其浓度,细胞浓度,培养条件等因素,特别是ES细胞本身的分化潜能和特性而异。通常单层培养的ES细胞较难分化为单一类型的细胞,常出现以某种类型分化细胞为优势的情况下,杂有一些其他类型的分化细胞。因此,单层ES细胞培养途径的定向诱导分化已不多见。2. ES细胞拟胚体形成和诱导分化通过形成拟胚体方式是目前ES细胞定向诱导分化的最基本的常用途径。有两类方法可使ES细胞形成拟胚体。(1)软琼脂培养ES细胞经胰蛋白
37、酶消化,吹打成单个细胞,接种于预先以软琼脂铺底的培养皿内,ES细胞呈悬浮生长,增殖,彼此粘附聚集而形成拟胚体。(2)悬滴培养ES细胞经胰蛋白酶消化,制备成单个细胞悬浮液,滴种在直径为10 cm培养皿的盖子上,制成许多悬浮细胞小滴,培养皿内加入适量PHS,然后小心盖上带有许多小滴的盖子,使盖子上的许多小滴倒置成悬滴。培养皿边缘用parafilm封起来,避免小滴枯干,置370C ,5% CO2培养箱。培养3天后,悬滴中的ES细胞聚集形成拟胚体。将拟胚体移至含细胞分化诱导剂(如RA)的培养皿或微孔板进一步培养。然后移放人铺有 0.1%白明胶的培养皿或微孔板内,在含有或不含细胞分化诱导剂,并缺乏LIF
38、的培养液中进一步培养,可被诱导分化为不同类型的细胞,除了直接分化为终末分化细胞外,也可能在适当的条件下,先分化为过渡型的前体细胞或组织谱系干细胞。悬滴培养法形成的拟胚体的形状和大小较软琼脂层上的更为完整均一,重复性也很好。(四) ES细胞体外诱导分化的几种细胞人类ES/EG细胞建系成功,各国科学家正借鉴小鼠ES细胞体外诱导分化的成功经验,致力于将人ES 细胞改造成以临床基因、细胞治疗和组织工程种子细胞为目的的各种定向诱导分化细胞研究。有关体外诱导分化的报告仍以小鼠ES细胞为模型的居多,而且大多还是偏重于混合型分化细胞的描述性资料。目前至少有20余种从ES细胞诱导分化而来的体细胞在多家实验室获得
39、成功,特别是近年几篇有关ES细胞在体外可分化为生殖细胞的报道,从实验上证明了ES细胞的全能性的性质(表19.3) 。ES细胞研究中,造血细胞(hematopoitic cell)是报道最多的一种分化细胞类型。小鼠ES细胞拟胚体在体外可分化为类似于早期胚胎卵黄囊血岛样的结构,分化产生红细胞、髓细胞和淋巴细胞等各种造血系统的细胞。一般常采用分阶段诱导小鼠ES细胞分化为造血干细胞和B淋巴细胞:首先使ES细胞发育成拟胚体,然后,用胰蛋白酶消化成单个细胞,经干细胞因子(SCF)、血小板生成素( TPO)和胚胎细胞的条件培养液处理,使其定向分化为造血干细胞;再用原代骨髓基质细胞作饲养层和SCF及IL-6细
40、胞因子处理,可进一步使ES细胞来源的造血干细胞分化为B淋巴细胞系。根据小鼠ES细胞体外分化为造血细胞的研究,发现ES细胞体外分化为造血细胞体系一系列发育顺序类似于在体胚胎的发育过程。在体胚胎研究表明, 7.5 d的小鼠胚胎最初在卵黄囊(yolk sac)内出现大而有核的前成红细胞。当胚胎长至10 -12 d肝形成时, 则卵黄囊前成红细胞逐渐消失。这表明胚胎造血器官是从卵黄囊转移到胚胎肝脏的。而在ES细胞体外分化实验中,生长4d的拟胚体首先出现前成红细胞,拟胚体生长至第10 -12 d时前成红细胞逐渐消失。成熟红细胞和成髓细胞都是在前成红细胞出现后不久才产生。利用骨髓基质细胞或其条件培养液,可以
41、诱导小鼠ES细胞在体外分化为造血干细胞。这一重要进展为分析研究ES细胞分化为造血干细胞的早期决定以及分化机制和过程提供了实验模型。小鼠在体胚胎的卵黄囊血岛内,前成红细胞的产生总是伴随着内皮细胞的出现,因而普遍认为内皮细胞和前成红细胞来源于共同的祖细胞。同样,ES细胞体外分化时,拟胚体的血岛样结构中前成红细胞集落周围也有内皮细胞出现。ES细胞衍生的拟胚体分化的管状结构是由内皮细胞排列组成的,管道内还含有一些造血细胞,类似于胚胎发育中的早期血管发生。近年,笔者实验室利用具过度表达转化生长因子1 (transforming growth factor1 , TGF1)的小鼠ES细胞,在含维甲酸(RA
42、)培养液中经悬滴培养先形成拟胚体, 再继续贴壁培养,发现拟胚体周围呈辐射状长出许多血管样结构。表明ES细胞中过度表达的TGF1在血管形成中起着重要作用。利用外源重组TGF1添加至培养液,同样也能诱导内皮细胞组成的血管样结构。血管发生是一个极为复杂而有序的细胞生物学过程。TGF1是血管发生中的重要调节因子,但在体外也可抑制内皮细胞增殖;另一方面,细胞外基质成分的结构三维性(立体)对内皮细胞粘附、伸展、移动、增殖和生物合成都有明显效应。将ES细胞单层培养在含重组TGF1的I型胶原蛋白为基质的三维系统内,或直接将过度表达TGF1的ES细胞单层培养在I型胶原蛋白为基质的三维系统内都能获得内皮细胞组成的
43、血管样结构,而缺乏重组TGF1处理或无过度表达TGF1的正常ES细胞在I型胶原蛋白为基质的三维系统内培养,都不能形成血管样结构。因此,TGF1可能是通过细胞外基质行使其形成血管的功能;此外,用重组TGF1处理的ES细胞中,能检测到碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因表达,所以,TGF1可能调节ES 细胞和/或其分化细胞的bFGF基因表达。从而提示bFGF可作为血管内皮细胞的生长因子之一,促进内皮细胞分化和形成血管。单层培养的小鼠ES细胞的诱导分化实验中,在10mol/L维甲酸(RA)与1 mmol/L双丁酰基环腺昔磷酸(dibutyryl cyclic adenosine monophosp
44、hate, dBcAMP )共同作用下,90% -95%的分化细胞为神经胶质细胞。小鼠ES细胞也可在体外被诱导分化为少突神经胶质细胞(oligodendrocytes )和运动神经元。ES细胞拟胚体在特定条件贴壁培养时也能被诱导分化为神经元。用悬浮培养4 d的拟胚体在含RA的培养液中继续培养 4 d,再使拟胚体贴壁培养则可高效重复地分化出神经细胞,不仅表达专一性的神经微丝M和微管蛋白,还有钠、钾、钙等离子信号通道的特征。分化的神经细胞还表达神经递质GABA、glycine和受体NMDA等不同物质。甚至在体外诱导分化早期的拟胚体中检测到神经元和神经胶质细胞的共同前体细胞的专一性标志巢蛋白(nes
45、tin)。用RA诱导ES细胞分化为表达-氨基丁酸的神经细胞植入Huntingtons病(一种遗传性舞蹈病)大鼠模型体内,具有神经细胞功能的移植物使患鼠症状有所改善,并存活了6周。因此,ES细胞体外诱导分化细胞有可能成为临床细胞治疗的移植物来源的新途径之一。这些工作都表明通过用某一简单的化合物,有可能激活ES细胞基因组中一套仅用于神经细胞分化的基因,而抑制了沿着其他细胞类型分化途径中应表达的基因。近年来, ES细胞在体外定向分化为多巴胶能神经元已取得了重大突破,这对神经发生的 基础研究和临床神经细胞移植具有极重要的意义。悬浮或悬滴培养的小鼠ES细胞的拟胚体在RA诱导条件下贴壁生长数天,常出现某些
46、分化细胞集落具节律性自发收缩现象,显然是肌细胞。电镜观察证实,收缩的细胞内存在着肌原纤维、肌小节和闰盘等典型心肌细胞特有结构。发现心肌细胞分化过程中,分化细胞团刚开始收缩时型肌球蛋白重链(MHC)表达占优势,继续培养数天,则型MHC逐渐占优势,最终在分化的心肌细胞中,27 %表达型MHC ,33 %同时表达和型MHC ,40 %表达型MHC。这种MHC亚型的转变与在体胚胎心肌发育过程极相似。除心肌细胞外,决定骨骼肌发育的基因myf-5、myogen in , myoD等在ES细胞拟胚体的分化细胞中都能够表达,而且表达时序与在体胚胎发育中相同。ES细胞拟胚体贴壁培养1- 2周后一般都能出现肌细胞
47、,继续培养则融合成肌管,显示出骨略肌发育的典型特征。分化的肌细胞常表达成熟肌细胞专一的Ca2+信号通道和烟碱受体(nicotinic receptor) 。二甲亚砜诱导ES细胞拟胚体可形成心肌、平滑肌和骨倍肌等多种类型肌细胞,用肌肉专一性的调节因子myoD基因转染ES细胞并结合DMSO诱导处理,额外表达myoD基因的ES细胞,则主要分化为骨骼肌,没有心肌和平滑肌类型细胞出现,且骨骼肌常融合形成肌管。因此,看来通过改造ES细胞某种基因和给予适当培养条件的途径,是诱导ES细胞向特定单一类型细胞分化的可行方法之一。小鼠ES细胞或EG细胞通过悬滴培养法,形成的拟胚体被转移到铺有琼脂的培养皿中,悬浮培养
48、3 d, 每天更换含有诱导剂二甲亚砜(DMSO)的培养液。3 d后,经过诱导剂处理的拟胚体移人表面事先用明胶 (gelatin)包被的培养皿中进一步贴壁培养。这时给培养液中加入胰岛素、三腆甲腺原氨酸(triiodothyronine) 和胎牛血清,10 -15 d后大部分拟胚体分化为脂肪细胞。脂肪细胞中的脂滴含有甘油三酯(triglycerides) ,很容易用油红O (oil red O)染色鉴定,显示特异性红色。笔者实验室曾用RA替代二甲亚砜诱导剂,其余条件同上,约60%以上的EG细胞拟胚体可被诱导分化出脂肪细胞。ES细胞诱导分化为软骨细胞的条件较为苛刻,一般成功率也较低。小鼠ES细胞通过
49、形成拟胚体并结 合添加转化生长因子家族(如TGF1 ,BMP-2和BMP-4)可诱导分化为表达软骨相关基因和蛋白的软骨细胞。ROSA-geo基因转染的小鼠ES细胞,在缺乏G418的情况下聚集成拟胚体。用10%小牛血清代替胎牛血清,培养液中含有分化诱导剂1mol/L地塞米松(dexamethasone) ,2 - 3 d更换培养液,50 d后,这种拟胚体发育成软骨细胞,经Alcian blue液染色,显示出明确的软骨细胞特征,细胞间存在着11型胶原。小鼠ES细胞经过拟胚体阶段,结合无血清和多种生长因子、有丝分裂原处理,可被诱导分化为分泌胰岛素的、类似胰岛的结构。近来利用人ES细胞经过悬浮培养获得胚体,再经如bFGF等生长因子诱导可分化为以产生胰岛素为特征的胰岛样细胞,为临床糖尿病的细胞治疗提供了细胞来源打下基础。ES细胞定向诱导分化为肝细胞已有少数几篇报道。国内蒯小玲等成功地用RA、肝