余甘子中水溶性鞣质的抗动脉粥样硬化作用机制研究.docx
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1、352 实用预防医学 2007 年 4 月 第 14 卷 第 2 期 Practical Preventive Medicine ,Apr. 2007 ,Vol 14 ,No. 2 文章编号 :1006 - 3110 (2007) 02 - 0352 - 04 【论 著】 余甘子中水溶性鞣质的抗动脉粥样硬化作用机制研究 呙爱秀 ,黄兴国 ,唐湘云 摘要 : 目的 在细胞水平证实中药余甘子 ( Phyllanthus Emblica L . ) 的两个可溶性鞣质成分 Phy - 13 (beta - 1 - O - galloyl - 3 ,6 - ( R) - hexahydroxydiphe
2、noyl - d - glucose) 和 Phy - 16 (1 ,6 - di - O - galloyl - beta - d - glucose) 是否具有抗动 脉粥样硬化作用 。 方法 人脐动脉内皮细胞 ECV - 304 经 ox - LDL (50 mg/ l) 诱导 ,MDA 试剂盒检测 Phy - 13 和 Phy - 16 作用后内皮细胞培养上清液中丙二醛 (MDA) 的水平 ,MTT 法检测动脉血管平滑肌细胞 (VSMC) 的增殖 ,细胞计数仪 计数单核细胞和内皮细胞的黏附 。 结果 Phy - 13 和 Phy - 16 能减少内皮细胞 MDA 的生成 ,减少 ox -
3、 LDL 诱发的单 核细胞和内皮细胞黏附 ,幵能对抗 ox - LDL 诱导的动脉血管平滑肌细胞 (VSMC) 增殖 。 结论 Phy - 13 和 Phy - 16 能 够对抗 ox - LDL 诱导的动脉粥样硬化 ,这可能是余甘子治疗动脉粥样硬化相关疾病的重要机制之一 。 关键词 : 血管内皮细胞 ;血管平滑肌细胞 ; Phy - 13 ; Phy - 16 ;氧化损伤 ;增殖 中图分类号 : R54114 文献标识码 :A Mechanism of Anti - atherogenesis Effect of Soluble Tannins From Fructus Phyllanthi
4、 GUO Ai - xiu , HUAN G Xing - Guo , TAN G Xiang - yun ( Hunan Institute of Environmental & Biological Technology , Hengyang 421001 , Hunan) Abstract : Objective To clarify the mechanism of antiatherogenic effects of Phyllanthus emblica L. , which is widely used in treatment of atherosclerosis - rela
5、ted disease s and associated with ox - LDL by the soluble tannin , Phy - 13 ( beta - 1 - O - galloyl - 3 , 6 - (R) - hexahydroxydiphenoyl - d - glucose) , and its analogue Phy - 16 (1 , 6 - di - O - galloyl - beta - d - glucose) . Methods Human arteria umbilical endothelial cells , ECV - 304 , were
6、incubated with ox - LDL (50 mg/ l) , treated with corilagin or Dgg16 at different dose s , and then incubated with monocyte s. Malondialdehyde (MDA) in the culture media was determined and the number of monocyte s adhering to ECV - 304 cells was counted cytometrically. The rat vascular smooth muscul
7、ar cells (VSMC) were incubated in media with or without ox - LDL (50 mg/ l) , and with Phy - 13 or Phy - 16 at different dose s too , and the proliferation of them was assayed by MTT method. Results Both Phy - 13 and Phy - 16 were able to reduce MDA content , prevented ECV - 304 cells from being adh
8、ered by the monocyte s , and inhibited VSMC prolifera2 tion that induced by ox - LDL. Conclusion The se two compounds are effective in inhibiting the progre ss of atherosclerosis by alleviating oxidation injury or by inhibiting ox - LDL - induced VSMC proliferation , which may be the promising mecha
9、nisms for treating atherosclerosis. Key words : Endothelial cell ; Smooth muscle cell ; Phy - 13 ; Phy - 16 ; Oxidation injury ; Proliferation 动脉粥样硬化是导致心血管疾病的主要基础疾病之一 ,高 血压 、脑中风 、慢性心衰和缺血性心肌病都与其有密切关系 1 。 目前认为动脉粥样硬化的一个重要机制是内皮细胞损伤 ,常常 由自由基损伤引起 ,随后伴随着单核细胞黏附 ,最后导致血管 平滑肌细胞 (vascular smooth muscle cells ,
10、VSMC) 增生 ,其中氧 化型 - 低密度脂蛋白 (ox - LDL , oxidized low - density lipopro2 tein) 引起的内皮细胞损伤最为重要 2 。因而认为清除自由基 或抑制 VSMC 异常增殖是对抗动脉粥样硬化的有效措施 。许 多抗动脉粥样的药物均具有此特性 , 比如普罗布 考 (probu2 col) 3 、维生素 E(vitamin E) 4 和某些多酚化合物 (phenolics) 5 。 作者单位 : 湖南环境生物职业技术学院 (湖南 衡阳 421001) 作者简介 :呙爱秀 (1964 - ) ,女 ,湖南邵东人 ,大学学历 ,讲师 ,主要从事
11、 中药药理方面的研究及中药学的教学工作。 基于上述理论 ,根据中草药的使用经验 ,我们筛选到一些 具有抗动脉粥样硬化活性的有效部分幵获得了一些化合物 ,其 中从中药余甘子 ( Phyllanthus embolica L . ) 的果实中提取到的 两种水溶性鞣质 Phy - 13 beta - 1 - O - galloyl - 3 ,6 - ( R) - hexahydroxydi - phenoyl - d - glucose 和 Phy - 16 (1 ,6 - di - O - galloyl - beta - d - glucose) 具有较好的活性 ,其结构式见图 1 。 Phy
12、- 13 和 Phy - 16 是余甘子植物中新提取到的鞣质类化学成 分 ,两者含有较多的酚羟基 ,有较强的还原性 ,其中 Phy - 13 有 较强的抗血小板聚集作用和抗炎作用 6 。本文根据内皮氧化 损伤引发动脉粥样硬化的发病机制 7 ,对这两个化合物的抗动 脉粥样硬化作用迚行初步的探讨 。 本实验试图验证 : 1) 通过检测丙二醛 ( malondialdehyde , MDA) 判断两个化合物对内皮细胞氧化损伤的保护作用 ; 2) 这 353 实用预防医学 2007 年 4 月 第 14 卷 第 2 期 Practical Preventive Medicine ,Apr. 2007
13、,Vol 14 ,No. 2 两个化合物能否抑制单核细胞对内皮细胞黏附 ; 3) 能否抑制 VSMC 增殖 。实验中的维生素 E(alfa - tocofecol) 作为一种生物 抗氧化剂在本实验中作为阳性对照药物 。 A DMEM 培养液中 ,置于 37 、 5 % CO2 孵箱中培养 。 24 h 后 , 用含有青霉素 (200 IU/ ml) 和链霉素 (200 IU/ ml) 的培养液再次 清洗 ,然后用符合消化酶 (含 2 g/ l 的胶原酶和 0. 25 g/ l 的弹性 蛋白酶 ) 消化 。当出现一定数量单个细胞后 ,用 20 %的胎牛血 清终止消化反应 。通过过滤离心获得单个
14、VSMC 迚行原代和 传代培养 。 1. 2. 2 MDA 检测和单核细胞黏附检测 ECV - 304 在含 15 %胎牛血清的 RPMI 1640 培养液中 37 常规培养 ,当细胞 长满 80 %左右将细胞用 0. 5 %的胰酶消化成单个细胞 。控制细 胞浓度为 5. 0 105 / ml ,取 1 ml 加入到 6 - 孔板中积蓄常规培 养 。当细胞贴壁后 ,加入 Phy - 13 、 PHy - 16 或维生素 E 到各 孔 ,浓度按照 0. 0001 、 0. 001 、 0. 01 和 0. 1 mmol/ l 设置 ,同时各 孔均加入 ox - LDL (50 mg/ l) ,再
15、培养 4 h 后收集上清液按照试 剂盒说明书检测 MDA 。 除去培养板中上清液后 ,加入新鲜培养液 ,同时加入单核 细胞 (5. 0 105 ) 200 l ,常规培养 1 h 。同时通过细胞计数仪对 黏附在 ECV - 304 的单核细胞和未黏附的细胞迚行计数 。黏 附程度的计算公式参见公式 (1) 10 。 A ( %) = NtotalMc - Nnon - adhering Mc 100 % (1) NtotalMc B Fig. 1 Structure of corilagin and Dgg16 A : Phy - 13 ( beta - 1 - O - galloyl - 3
16、, 6 - ( R) - hexahydroxy - diphe2 noyl - d - glucose) , B : Phy - 16 ( 1 ,6 - di - O - galloyl - beta - d - glu2 cose) 1 材料与方法 1. 1 材料 Phy - 13 和 Phy - 16 购自中科院上海药物所 。 DMEM 和 RPMI 1640 培养液购自美国 Gibco BRL 公司 。胎牛 血清 ( Fetal bovine serum) 购自杭州四季青公司 ( Hangzhou Si2 jiqing Bio - material Co. , Ltd. ) 。 ox
17、- LDL 、胶原酶 、弹性蛋白酶 和维生素 E (alfa - tocofecol) 购自美国西栺玛公司 。 MDA 试剂 盒购自南京建成生物工程研究所 。人脐静脉内皮细胞 ( Human umbilical vein endothelial cell) ECV - 304 购自中科院上海药物 所 。 CO2 孵箱由德国 Hereaus 公司生产 , 酶标仪 ( Ridmodei - 3550 型 ) 由意大利生产 。临床生化检测仪 ( CL - 770 型 ) 由日本 岛津公司生产 。其他试剂为国产分析纯 。 1. 2 方法 1. 2. 1 人单核细胞和大鼠主动脉 VSMC 制备 人单核细
18、胞 来源于健康人静脉血 ,由衡阳中心血站通过梯度密度离心法分 离得到 , 培养方 法 参 照 Yin Rajesh et al. 8 的 方 法 。主 动 脉 VSMC 来 源 于 健 康 Sprague - Dawley 大 鼠 ( 动 物 合 栺 证 号 2001034) ,按照文献 9 方法制备 ,简述如下 。取大鼠胸主动脉 , 经分离 、清洗 ,然后去除动脉内膜和外膜 ,将动脉在 DMEM 培 养液 中 剪 碎 。将 剪 碎 的 小 动 脉 块 置 于 含 10 % 胎 牛 血 清 的 A :adhesion ; Ntoal Mc : Mumber of total monocytes
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