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1、植物功能基因组研究技术进展植物功能基因组研究技术进展学生李大红学生李大红 导师梁建生教授导师梁建生教授引言引言结构基因组学代表基因组分析的早期阶段，以建立生物体高分辨率遗传、物理和转录图谱为主功能基因组学代表基因分析的新阶段，是利用结构基因组学提供的信息系统地研究基因功能，它以高通量、大规模实验方法以及统计与计算机分析为特征基因的功能基因的功能 生物学功能，如作为蛋白质激酶对特异蛋白质进行磷酸化修饰；细胞学功能，如参与细胞间和细胞内信号传递途径；发育上功能，如参与形态建成等。研究方法研究方法突变体，突变体，反义反义RNARNA，RNAiRNAi，基因表达的系统分析，基因表达的系统分析，DNAD
2、NA芯片等。芯片等。突变体是研究基因功能的传统方法 promotorexoninonT-DNA插入突变机理插入突变机理terminator获得突变体的方法获得突变体的方法物理因素；指某些射线，如Y射线、X射线、B射线和中子流等；化学诱变剂:指某些烷化剂，碱基类似物，抗生素等化学药物。由重组DNA技术衍生出的插入突变:它是人为地造成某一待研究基因的突变体，并根据由此带来的表型特征的改变来分析该基因的功能，然后再进行基因等分子水平上的研究，水稻突变体多柱头巨胚米双胚苗水稻突变体无穗锈斑叶盆景稻水稻突变体库研究进展1998年，国际水稻遗传协会报告了571个定位的突变体基因2005年6月，Gramen
3、e网站报道了1488个水稻突变体，Oryzabase 网站公布了约1698个水稻突变体和基因(含数量性状基因)，突变体的缺陷突变体的缺陷这主要表现在突变必须被测序或者做图以证明他们的位置，并且突变材料的大规模收集必须要通过对整个基因组进行筛选。这些限制也就意味着基因组规模上的突变：技术含量底，工作量过大。而且突变具有很大的随机性，经常给实验带来不便，反义RNA反义RNA作用机理反义反义RNA在基因功能鉴定的应用在基因功能鉴定的应用A A、在研究植物胚的发育，使用了反义在研究植物胚的发育，使用了反义RNARNA技术技术。Bicoid 是调控果蝇胚胎极性及以后分节发生过程的重要基因。从水稻cDNA
4、 文库中分离了一个同果蝇Bicoid 有相当同源性的克隆-Rb24 基因。为进一步了解它在水稻中的功能,将Rb 的反义基因片段通过农杆菌的介导转入水稻中。结果表明细胞和组织的分化在胚的发育过程中被阻断了。因此Rb 基因同控制水稻胚的发育有关。B B、光合作用的光合作用的Lhca4 Lhca4 基因功能的研究基因功能的研究Lhca1 和Lhca4 编码LHC 蛋白,该蛋白是光合系统PS 的叶绿素aPb 结合蛋白。通过反义技术,Zhang等 研究Lhca4 的功能。实验表明,在转基因株系中,Lhca4 蛋白的减少并未引起Lhca1 蛋白的降低,由于Lhca4 蛋白的减少,低温荧光发射光谱明显地改变
5、了,而且发射最大值向蓝光偏移了6nm,说明与Lhca4 相关的叶绿素分子与长波长荧光发射光谱有关。C C、番茄的、番茄的pTOM5pTOM5基因功能鉴定基因功能鉴定利用反义RNA 技术对基因表达部分抑制可以产生转基因株系。pTOM5 基因是番茄果实成熟过程中类胡萝卜素的合成基因。pTOM5 反义基因转入番茄中,果实呈黄色,花呈淡黄色,类胡萝卜素合成受阻,含量减少了97%。由此推测pTOM5 是控制果实成熟及类胡萝卜素合成的一个基因。RNAiRNAi作用机理RNAi技术在鉴定植物基因功能中的应用RNAi 技术应用于植物功能基因组研究最初是在土豆中通过PTGS 诱导产生抗RNA 病毒抗性能力及在水
6、稻中使报告基因GUS 沉默的能力来比较正义链、反义链及dsRNA 诱导RNAi 效率的高低。接着Chuang 等在花发育研究中采用RNAi 技术进一步验证AG、CLV3、AP1、PAN 等已知功能基因,并开创了RNAi 在植物功能基因组学中的应用(Chuang CF,et al,2000)。Gong 等（2002)克隆了拟南芥SOS家族样的蛋白激酶基因PKSes的一个成员PKS18,构建了PKS18的RNAi载体,研究其转基因植株,发现由于PKS18 表达在转录水平上受抑制,并表现对ABA 不敏感,证实PKS18 与ABA 信号转导有关。由于拟南芥是目前植物基因组资源研究最深入的植物种类,所以
7、RNAi 技术在植物功能基因组中的研究主要体现在拟南芥功能基因组的研究上,CATMA(Complete Arabidopsis transcrip2tiome microarray)计划以及AGRIKOLA(Arabidopsis genomic RNAi knock-out line analysis)都在应用RNAi 进行大规模的拟南芥功能基因组的分析。除此之外,RNAi 技术在其它植物功能基因分析中也得到尝试.例如Kenichi 等(2004)应用RNAi 技术分析并证实phEIN2 基因在牵牛花中乙烯信号传导中具有重要作用,Senthil 等(2005)用RNAi 技术分析了异黄酮合成
8、酶基因在大豆子叶及根部的作用效果及其对异黄铜积累的影响,证实大豆子叶对基于RNAi的基因功能分析有效。l李小平等（2006）根据植物中hpRNA(hairpin RNA)的原理，以大豆类受体蛋白激酶基因rlpk2为靶基因，成功敲减(knock-down)rlpk2基因，并且发现敲减大豆叶片中的rlpk2基因表达明显改善大豆叶片的光合能力。lGodfrey等（2005）用RNAi的方法研究了MPK6基因使植物对臭氧比对照敏感，而MPK3对臭氧也有相似的反应，从而推断这两个MAPKs在对臭氧的调节方面的机理是相似的。基因表达的系统分析基因表达的系统分析(原理原理)从转录本的3端特定位置分离出的该转
9、录本特异的标签(tag)包含有足够的能代表该转录本所需之信息,依SAGE 方法之不同,这一标签的长度通常在914个核苷酸之间变化。将多个短序列标签串连在一个克隆中，通过测序以连续的方式同时分析多个标签及其代表的转录子，明显提高了分析效率。根据测序结果，计算某一标签出现的次数来确定相应转录子的拷贝数与表达水平。基因表达的系统分析基因表达的系统分析(步骤步骤)提取提取RNA与生物素与生物素dT相连相连纯化纯化mRNART得双链得双链DNA特异性的特异性的锚定酶酶切锚定酶酶切用链霉素抗生物素用链霉素抗生物素的珠子收集的珠子收集3端端与接口与接口A结合结合与接口与接口B结合结合用标签内用标签内切酶酶切
10、切酶酶切用标签内用标签内切酶酶切切酶酶切连接连接用用p1和和p2为引物为引物PCR再次用锚再次用锚定酶定酶 酶切酶切基因表达的系统分析基因表达的系统分析(步骤步骤)用用PAGE胶分离胶分离把把30-50个这样个这样的标签连接起来的标签连接起来克隆到克隆到pZE1O-1 测序测序锚定酶的性质N la III 是一种非常广泛的限制性内切酶,平均每250bp 就有一个N la III 的识别位点,此酶可识别CA TG 四核苷酸的回文序列,因此经此酶切割后所得之cDNA 的3端含有一个悬垂在外的GTAC 四核苷酸G T A CC A T GC A T GG G G A CC A T GG G G A
11、CA p1B p2接口A、B的结构及其连接与酶切生物素生物素P1P2C A T GSAGE技术在鉴定植物基因功能中的应用水稻和酵母等模式生物的研究中发挥了重要的作用。此外,Matsumura 等(1999)还从水稻秧苗中分离出10 122 个标签并发现其中的23.1%可与1 367个水稻的cDNA、EST 匹配。其中许多高表达的基因均属编码核糖体蛋白、或与新陈代谢和细胞结构有关的管家基因。孙亮先（2006）对水稻幼苗SAGE 文库的构建也进行了探索试验。基因芯片的原理 基因芯片的原理寻找新基因,并推测一些已知基因的功能在植物上构建cDNA 文库,对正常和逆境条件下或野生型与突变体进行杂交筛选,
12、就可以找出差异表达序列。以差异序列设计探针可以从文库中调出相应的克隆,经测序鉴定就可以确定是否为新基因。Aharoni A 等(2000)从草莓中分离了1701个cDNA 片段,与480个矮牵牛植物克隆做对照,构建成微阵列芯片来研究草莓果的不同成熟时期果色与成熟度的关系并证实有两个基因是新基因,草莓乙酰基转移酶基因是其中之一。Guteraman A 等(2002)也利用DNA 芯片从玫瑰花有气味和没有气味的四倍体栽培植株中鉴定了新的与香味相关的基因。寻找新基因,并推测一些已知基因的功能Seki Metal 利用各种发育时期,经不同处理(干旱、冷害及未经胁迫处理)的拟南芥构建cDNA 文库,从中
13、得到了1300 个全长的cDNA,并制作成cDNA 芯片,与特异探针进行杂交,结果1300 种cDNA 中有44 种是受干早诱导,19 种受冷害诱导,其中30 种和10 种是从未报道过的胁迫诱导基因,并且12 种胁迫诱导基因被鉴定为受DREB1 调控的靶基因,其中6 个是未报道过的新基因(Motoaki S,et al,2001)。Arumugam Kathiresan,H.R等（2006）用基因芯片技术研究了水稻在干旱胁迫的条件下，mRNA的表达情况。由于其干旱时有一个或多个基因变化，因此用基因芯片技术有较大的优势。问题与展望物理、化学诱变、基因沉默以及插入突变等方法都可以用来构建突变体库,但每种方法都有各自的优缺点。对于SAGE 技术，虽然其具有其他方法无法比拟的诸多优点,但该方法本身所固有的一些不足及在实验实施过程中的一些困难也着实不容忽视。同任何新技术一样，生物芯片技术也存在着不足 Thank you 欢迎批评指正