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1、内源性逆转录病毒专题讲座1 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望绵羊肺腺瘤病绵羊肺腺瘤病 的病原是绵羊肺腺瘤病毒（jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV），其主要临床症状为咳嗽、呼吸困难、虚弱、渐进性消瘦、大量浆液性鼻漏；主要病变为肺泡型上皮细胞（type pneumocytes）和无纤毛细支气管上皮细胞（clara cells）腺泡样肿瘤性增生。绵羊肺腺瘤病毒绵羊肺腺瘤反转录病毒的基因组RNA为线性单股正链RNA，全长7642
2、bp。该病毒基因组RNA的编码区内有相互重叠的gag、pro、pol和env基因的典型结构。gag基因编码病毒的衣壳蛋白（capsid protein，CA）、核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，NC）和基质蛋白（matrix protein，MA），而gag基因编码区的第5131400bp段主要编码衣壳蛋白，衣壳蛋白构成病毒粒子双层壳的内壳，与病毒的抗原性有关。JSRV 的 pro 基因所编码的蛋白以聚合多肽蛋白前体Gag-pro 形式表达。pro 基因的 5端和 3端分别编码 dUTP 酶和羧基蛋白酶PR，dUTP酶可以防止反转录酶误装配三磷酸脱氧尿苷，而 PR 负责裂解
3、前体多肽蛋白。二者在病毒粒子的反转录、成熟与包装等病毒生活周期中起关键作用。pol基因主要编码病毒的反转录酶（reverse transcriptase，RT）和整合酶（integrase，IN），RT负责把病毒RNA反转录为病毒cDNA，IN负责将前病毒DNA基因组整合至宿主细胞的染色体DNA中。env基因主要编码病毒的囊膜蛋白，蛋白质部分由二条肽链组成，较小的一条链贯穿病毒的囊膜，称为跨膜蛋白（transmembrane protein，TM），较大的链通过二硫键和氢键与TM相连，称为表面蛋白（surface protein，SU）。Endogenous Retroviruses in T
4、rophoblast Differentiation and Placental Development在滋养层分化和胎盘发育过程中的内源性逆转录病毒Sarah G.Black1,Fredrick Arnaud2,3,Massimo Palmarini2,Thomas E.Spencer1 得克萨斯大学 一、前言一、前言 二、方法二、方法 三、结果三、结果 四、结论四、结论一、前言(Introduction)内源性病毒内源性病毒是指病毒在初次感染机体是指病毒在初次感染机体或细胞后，其基因组被或细胞后，其基因组被整合整合到宿主细到宿主细胞的胞的DNADNA中，并成为宿主细胞基因组的中，并成为宿主
5、细胞基因组的一部分，即以前病毒的形式存在，前一部分，即以前病毒的形式存在，前病毒病毒DNADNA可通过细胞分裂传递给子可通过细胞分裂传递给子代代细细胞。胞。内源性逆转录病毒（ERV）ERVs存在于所有脊椎动物的基因组中并遵照孟德尔法则遗传给下一代。ERVs在宿主基因组中大量存在，例如人的基因组中大约有810%ERVs。一个完整的ERVs前病毒和外源性逆转录病毒有同样的基因结构。如果ERVs表达产物对宿主有害的话，宿主将会消灭它们。ERVs存在于宿主基因组中，是长期进化的结果。通常由于突变、缺失、重排和甲基化的积累给予了ERVs不健全的复制机制。现代内源性逆转录病毒现代内源性逆转录病毒是指在物种
6、形成后才整合到宿主基因组中的，而且非常接近具有传染性的外源性逆转录病毒。这些现代内源性逆转录病毒包括绵羊肺腺瘤病毒、小鼠乳腺癌病毒、猫白血病病毒、鸡白血病病毒。许多现代内源性逆转录病毒能够产生感染性病毒粒子，因为它们缺乏钝化突变。ERVs在过去被认为是垃圾DNA，但最近研究表明ERVs对其宿主有重要的生物学作用。因为完整的开放阅读框和转录活性支持了之一观点。ERVs大量存在于多种动物的生殖道和胎盘内。完整的ERVs的env基因在胎盘的巨核细胞内表达且维持了数千年。此基因的表达产物可引起体外培养的细胞发生融合。二、ERVs in the human,mouse,and rabbit placen
7、ta在人类、小鼠、兔子和绵羊的胎盘内的反转录病毒n 人类人类n 小鼠小鼠n 兔子兔子n 绵羊绵羊 2.1人类HERV-W、HERV-FRD和ERV-3是3个人类的内源性反转录病毒。他们完整的env基因在人类胎盘中表达。2.1.1 HERV-WHERV-W不以完整的前病毒存在与人类的基因组当中，然而他的env基因编码的蛋白叫做syncytin1,在核胞体滋养层细胞中优先表达。syncytin1是一种糖蛋白且具有反转录病毒囊膜蛋白的特点，例如：前导肽、弗林蛋白酶切割位点、融合肽样序列、公认的免疫抑制区和跨膜区。这些大量的体外信息都暗示了，syncytin1与人类胎盘当中的单核滋养层细胞融合成双核滋
8、养呈细胞有关。有人通过转染HERV-W-env诱导了许多细胞系发生融合，当用抗HERV-W-env的抗体处理细胞后细胞融合的数量减少了。通过高表达syncytin1和forskolin共同诱导BeWo细胞融合，当抑制滋养层细胞中syncytin1的表达时，培养的双核滋养层细胞数量减少。2.1.2 HERV-FRDHERV-FRD囊膜蛋白被称为syncytin2，它的结构与syncytin1类似。然而syncytin2要比syncytin1整合到人类基因组上要早得多。当瞬时转染syncytin2时也能引起细胞融合。2.1.3 ERV-3ERV-3的囊膜蛋白也出现在滋养层当中，但在他的开放阅读框中
9、提前出现了终止密码子，导致他失去了跨膜区等多个功能区。ERV-3囊膜蛋白不能引起细胞的融合即使在BeWo细胞当中高表达ERV-3囊膜基因且同时用forskolin处理，也不能引起细胞融合。ERV-3在滋养层细胞中稳定表达，它可诱导滋养层细胞分化、人绒毛膜促性腺激素分泌量增加、形态改变。研究认为ERV-3-env在许多正常组织中表达，尤其在产生激素的器官中包括肾上腺、皮脂腺和睾丸当中表达。他可能在激素分泌的过程中扮演了重要角色。但150个健康的白种人当中有1.5个人的ERV-3-env基因提前终止（理论上没有功能）。所以人们争论ERV-3是否具有生物学功能。2.2小鼠在小鼠胎盘迷路滋养层细胞中表
10、达的两种内源性反转录病毒的囊膜蛋白syncytinA和syncytinB。syncytinA和syncytinB是同源基因且高度保守。syncytinA在小鼠滋养层的发育扮演了重要的角色，因为缺失syncytinA的小鼠胎盘里单核细胞不能融合形成多核细胞而发生流产。兔子最近，Heidmannet et al.发现兔子反转录病毒囊膜基因且命名为syncytinOry，他与人类的syncytin特征相似。通过生物信息学研究发现在兔子胎盘中特定表达的syncytinOry在兔子基因组当中具有完整的开放阅读框。syncytinOry被发现在兔子胎盘连接处即胎儿组织侵入母体子宫兑膜后形成的迷路滋养层中高
11、表达。这与syncytin在滋养层形成过程中有重要作用观点一致！绵羊绵羊基因组当中至少有个拷贝的ERVs，因为它们与外源性绵羊肺腺瘤（JSRV）非常相似，故命名为enJSRVs。JSRV是绵羊肺腺瘤的病原，具有传染性。JSRV不同于其他致癌反转录病毒是因为他的致癌基因是囊膜蛋白。尽管JSRV囊膜蛋白引起细胞转化过程中与促细胞分裂蛋白激酶（Ras-MEK-MAPK）、Rac和磷酸次黄苷酸激酶（PI3K-AKT-MTOR）信号转导通路有关，但具体机制还没有完全弄清楚。个enJSRV前病毒中有大部分由于缺失突变导致不完整。然而有个enJSRV前病毒具有完整的开放阅读框。JSRV和enJSRV相似性非
12、常高，所以enJSRV侵入绵羊基因组当中时间不长，甚至现在还一直在侵入。蒙古绵羊在不同妊娠时期（30d、50d、70d、90d、110d和130d）子宫和胚胎组织中均有enJSRV mRNA表达。通过统计学分析得出：胎盘组织中enJSRV基因的表达于90d时达到高峰，然后开始下降，直至妊娠130d时表达量达到最低；子宫内膜组织中enJSRV mRNA的表达于30d和50d相对较高；绒毛膜组织中enJSRV mRNA的表达于妊娠50d时表达量最低，70d和110d相对较高。（徐萌杰博士论文）、绵羊的胎盘和孕体的发育过程受精卵的发育与运行 由于输卵管管壁肌肉的蠕动及输卵管粘膜纤毛的摆动，受精卵渐渐
13、向子宫腔方向移动，在受精后34天到达宫腔，在运行过程中进行有丝分裂，受精卵到达输卵管子宫端时已成为一个实心细胞团，形如桑椹，故称桑椹胚。桑椹胚一面前行，一面继续进行细胞分裂，外层细胞分裂较快，形成囊壁，称为滋养层，是受精卵接触母体的部分，它将形成胎盘及其它胚外结构。内层细胞分裂较慢，形成内细胞团，是胚胎发育的始基。此时的受精卵称为囊胚或胚泡。约在受精后78天，滋养层细胞与子宫内膜接触时分化出合体细胞。子宫内膜被合体细胞的蛋白分解酶破坏，囊胚即侵入子宫内膜的致密层，子宫内膜表面迅速修复，囊胚即埋于子宫内膜中。约在受精后910天，内细胞团很快增殖与分化，分裂成两层，即外胚层与内胚层。两层细胞分裂都
14、很快，并各形成一空腔，即羊膜腔与卵黄囊，二者之间的组织称为胚盘。第12天使形成卵圆形的孕体，且之后开始慢慢变长。在胚胎发育成桑椹胚后，桑椹胚进一步发育，细胞开始出现分化。聚集在胚胎的一端，个体较大的细胞，称为内细胞团（inner cell mass，ICM），将来发育成胎儿的各种组织，而沿透明带内壁扩展和排列的，个体较小的细胞，称为滋养层细胞，它们将来发育成胎膜和胎盘。绒毛膜的滋养细胞在妊娠中期可分成两种类型：合体滋养细胞和细胞滋养细胞。细胞滋养细胞有丝分裂活跃，形成新的滋养细胞，新滋养细胞膜消失，融合形成合体滋养细胞。合体滋养细胞是人体正常细胞中唯一具有侵袭能力的细胞，类似于肿瘤细胞，具有一
15、定的侵袭能力，这种能力对胚泡着床及胎盘的形成均有十分重要的意义。BNC的形成绵羊单核滋养外胚层细胞（mononuclear trophoblastic cell，MTC）从妊娠第14天开始分化、移行，之后通过核内复制或融合作用形成滋养外胚层巨型双核细胞（trophoblastic giant binucleated cell，BNC），BNC继而移行并与子宫内膜的腔上皮细胞（luminal epithelium，LE）融合为三核细胞，三核细胞与BNC融合，形成多核合胞体，多核合胞体融聚成多核合胞体小半鞘翅（multinucleated syncytia plaques）（2025个核），最终形
16、成胎盘的子叶。在母羊的生殖道不同组织上皮中大量表达enJSRV。尤其在子宫内膜腔上皮和腺上皮当中可检测到enJSRV的mRNA和蛋白。有趣的是，HYAL2(是JSRV和enJSRV的受体)被专一的检测到在胎盘的BNC和小半鞘翅中表达。有研究者通过在妊娠8天的母羊子宫内注射吗啉代，抑制enJSRV 囊膜蛋白的翻译。结果单核滋养层细胞的数量减少且BNC的分化也减弱了。这让许多科学家提出了绵羊多核合胞体形成假说。目前，绵羊胎盘和孕体的发育过程中enJSRV和HYAL2所起的作用和具体机制还没有完全弄清楚。由于enJSRV Env与exJSRV Env高度相似。因此人们猜测enJSRV Env与exJSRV Env一样利用相同的机制诱导绵羊绒毛膜滋养层细胞融合，因为胎盘滋养层细胞是正常机体内唯一类似肿瘤细胞的正常细胞。的确，JSRV囊膜蛋白引起细胞转化是通过促细胞分裂蛋白激酶（Ras-MEK-MAPK）、Rac和磷酸次黄苷酸激酶（PI3K-AKT-MTOR）信号转导通路。然而这些通路是人类和啮齿类动物滋养层细胞生长和分化的调节器。四、结论内源性逆转录病毒存在于所有的脊椎动物的基因组内，能够被当做DNA化石来解释，在数百万年前反转录病毒与其宿主共同进化的过程。绵羊成为研究内源性逆转录病毒的强大的动物模型。