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1、专题三专题三-课题课题2 2月季的花药月季的花药培养培养(绝对经典绝对经典)单倍体育种单倍体育种花药花药ABABAbAbaBaBabab离体培养离体培养二倍体植物二倍体植物AaBbAaBb单倍体幼苗单倍体幼苗ABABAbAbaBaBabab秋水仙素秋水仙素纯合二倍体纯合二倍体AABBAABBAabbAabbaaBBaaBBaabbaabb特点：明显缩短育种年限特点：明显缩短育种年限花药离体培养：花药花药离体培养：花药 单倍体幼苗单倍体幼苗单倍体育种：花药单倍体育种：花药 单倍体幼苗单倍体幼苗 纯合二倍体纯合二倍体花丝花丝花药：花药：囊状结构，内有很多花粉囊状结构，内有很多花粉雄蕊雄蕊一、被子植
2、物的花粉发育一、被子植物的花粉发育被子植物花粉的发育过程被子植物花粉的发育过程四分体时期单核居中期 单核靠边期双核期减数减数分裂分裂四分体四分体时期时期有丝有丝分裂分裂营养细胞营养细胞2个精子个精子有丝分裂有丝分裂 花粉母花粉母细胞细胞（小孢子母细胞）（小孢子母细胞）4 4个小孢子个小孢子减数分裂减数分裂1 1个小个小孢子孢子 花粉粒花粉粒（双核）（双核）有丝分裂有丝分裂花粉管细胞核花粉管细胞核营养细胞营养细胞生殖细胞核生殖细胞核2个精子个精子1小孢子母细胞小孢子母细胞4小孢子小孢子花粉囊花粉囊花药花药 4花粉粒花粉粒（双核期）（双核期）成熟成熟花粉花粉8个精子个精子花粉花粉是小孢子母细胞经过
3、减数分裂而形成是小孢子母细胞经过减数分裂而形成的，因此，的，因此，花粉是单倍体的生殖细胞。花粉是单倍体的生殖细胞。1 1花花粉母粉母细胞细胞4 4个小个小孢子孢子减分减分有分有分4 4个花粉管细胞核个花粉管细胞核4 4个生殖细胞核个生殖细胞核有分有分8 8个精子个精子花粉的发育要经历：花粉的发育要经历：四分体时期、单核期、四分体时期、单核期、双核期双核期（二）产生花粉植株的两种途径（二）产生花粉植株的两种途径移栽移栽花药中花药中的花粉的花粉胚状体胚状体脱分化脱分化 愈伤组织愈伤组织 花药中花药中的花粉的花粉脱分化脱分化 分化分化 丛芽丛芽 再分化再分化 丛芽丛芽 诱导诱导生根生根体细胞胚（胚状
4、体）：在组织培养过程中，某些细胞在形态上转体细胞胚（胚状体）：在组织培养过程中，某些细胞在形态上转变为与变为与合子发育成的胚非常相似的结构合子发育成的胚非常相似的结构，发育过程亦与合子胚类，发育过程亦与合子胚类似似这两种途径之间没有绝对的界限，这两种途径之间没有绝对的界限，主要取主要取决于培养基中激素的种类及浓度配比。决于培养基中激素的种类及浓度配比。胚状体胚状体 在组织培养过程中，某些细胞在形态上转在组织培养过程中，某些细胞在形态上转变为与变为与合子发育成的胚合子发育成的胚非常相似的结构非常相似的结构，发育，发育过过程程亦与合子胚类似；亦与合子胚类似；神奇的人工种子神奇的人工种子:通过通过胚
5、状体胚状体途径形成小植株途径形成小植株烟草花药培养烟草花药培养胚状体发育途径胚状体发育途径愈伤组织转接种到再生培养基愈伤组织转接种到再生培养基愈伤组织分化形成再生植株愈伤组织分化形成再生植株水稻花药培养水稻花药培养愈伤组织发育途径愈伤组织发育途径部分花药产生愈伤组织部分花药产生愈伤组织接种在平板上的水稻花药接种在平板上的水稻花药胚状体：胚状体：离体培养的某些体细胞在形态上转变为与合子发育成的胚非常相似的结构，胚芽，胚轴，胚根等结构完整，就像一颗种子，这种结构叫体细胞胚，或胚状体。愈伤组织：愈伤组织：离体的组织细胞经过细胞分裂，形成的排列疏松无规则，高度液泡化呈无定形状态的薄壁细胞。不同植物的诱
6、导成功率很不相同，就同一种不同植物的诱导成功率很不相同，就同一种植物来说亲本的生理状况对诱导成功率也有植物来说亲本的生理状况对诱导成功率也有直接影响。直接影响。选择合适的花粉发育时期是提高诱导成功率的选择合适的花粉发育时期是提高诱导成功率的重要因素。重要因素。因为并不是任何时期的花粉都可以经过培养产因为并不是任何时期的花粉都可以经过培养产生愈伤组织或胚状体，花粉发育的过程中，只生愈伤组织或胚状体，花粉发育的过程中，只有某一个时期对离体刺激敏感。有某一个时期对离体刺激敏感。选材是否成功是花药培养成功的关键。选材是否成功是花药培养成功的关键。选材选材三、影响花药培养的因素三、影响花药培养的因素一般
7、来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养的成功率最高。即：最一侧的时期，花药培养的成功率最高。即：最适合花药培养的小孢子发育时期为适合花药培养的小孢子发育时期为单核靠边期单核靠边期。选择单核期以前的花药接种，选择单核期以前的花药接种，质地幼嫩，极易质地幼嫩，极易破碎破碎；选择单核期之后的花药接种，花瓣已有些松动，选择单核期之后的花药接种，花瓣已有些松动，又给又给材料的消毒带来困难，且难以挑选到单核材料的消毒带来困难，且难以挑选到单核期的花药期的花药。花药培养时期的选择花药培养时期的选择其它其它时期选择的缺点时期选择的缺点为了挑选到单核期的
8、花药，为了挑选到单核期的花药，通通常选择完全未开放的花蕾。常选择完全未开放的花蕾。盛盛开的或略微开放的花，都不宜开的或略微开放的花，都不宜选作实验材料。选作实验材料。选择完全未开放花蕾的选择完全未开放花蕾的原因原因 完全未开放的花蕾，可挑完全未开放的花蕾，可挑选到单核期的花药，菌少、选到单核期的花药，菌少、易消毒易消毒单核期花药的挑选单核期花药的挑选为什么花瓣松动会给材料的消毒带来困难？为什么花瓣松动会给材料的消毒带来困难？花瓣松动后，微生物就可能侵入到花药，花瓣松动后，微生物就可能侵入到花药，给材料的消毒带来困难。给材料的消毒带来困难。花药培养时间花药培养时间一般月季的花药培养时间选在一般月
9、季的花药培养时间选在5 5月初到月初到5 5月的中月的中旬，即旬，即月季的初花期月季的初花期。初花期的花蕾营养状态。初花期的花蕾营养状态及生理状态会比较好，可提高花粉的诱导成功及生理状态会比较好，可提高花粉的诱导成功率。率。2、培养基的组成、培养基的组成（MS培养基培养基+不同比例的植物生长调节激素）不同比例的植物生长调节激素）（一）材料选取（一）材料选取 从花药看从花药看：月季的初花期：月季的初花期 从花粉看：从花粉看：单核期单核期 从花蕾看从花蕾看：完全未开放的：完全未开放的 四、实验操作四、实验操作1.我们怎样选择想要的花粉呢？我们怎样选择想要的花粉呢？镜检镜检 方法：方法：醋酸洋红法醋
10、酸洋红法(将染色体染成红色将染色体染成红色)焙花青焙花青-铬矾法铬矾法(花粉细胞核染成蓝黑色花粉细胞核染成蓝黑色)。花药（载玻片上）花药（载玻片上）1%的醋酸洋红的醋酸洋红1滴滴用镊柄将花药捣碎，用镊柄将花药捣碎，盖上盖玻片盖上盖玻片镜检（花粉粒的细胞核被染成红色）镜检（花粉粒的细胞核被染成红色）花药（在卡诺氏固定液中处理花药（在卡诺氏固定液中处理20min）取出，置于载玻片上取出，置于载玻片上焙花青铬矾溶液染色焙花青铬矾溶液染色盖上盖玻片盖上盖玻片镜检（花粉粒的细胞核镜检（花粉粒的细胞核被染成蓝黑色）被染成蓝黑色）2.我们怎样保证所选的材料处于单核期？我们怎样保证所选的材料处于单核期？（一）
11、材料选取（一）材料选取 2、通过、通过镜检镜检来确定是否处于适宜的发育期来确定是否处于适宜的发育期。方法：方法：醋酸洋红法醋酸洋红法(将染色体染成红色将染色体染成红色)焙花青焙花青-铬矾法铬矾法(花粉细胞核染成蓝黑色花粉细胞核染成蓝黑色)。1、从花药看从花药看：月季的初花期：月季的初花期 从花粉看：从花粉看：单核期单核期 从花蕾看从花蕾看：完全未开放的：完全未开放的 四、实验操作四、实验操作（二）材料的消毒（二）材料的消毒5 5、无菌水冲洗、无菌水冲洗3 35 5次次 花药的外面有花萼、花瓣保护，通常处于无菌状态花药的外面有花萼、花瓣保护，通常处于无菌状态1、花蕾用、花蕾用体积分数为体积分数为
12、70%的酒精的酒精浸泡浸泡30秒秒2、无菌水清洗、无菌水清洗3、无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分、无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分4、放入、放入质量分数为质量分数为0.1%的氯化汞的氯化汞溶液中溶液中24分钟分钟 （质量分数为质量分数为1%的的次氯酸钙溶液次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液或饱和漂白粉溶液）在无菌条件下除去萼片和花瓣用镊子取出花药在无菌条件下除去萼片和花瓣用镊子取出花药要彻底去除花丝，要彻底去除花丝，因为与花丝相连的花药因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成。不利于愈伤组织或胚状体的形成。立即将花药接种于培养基上，通常每瓶立即将花药接种于培养基上，通常每瓶接种花接种花药药7-107
13、-10个个。1 1、剥取花药、剥取花药勿损伤花药，否则接种后容易从受伤部位产勿损伤花药，否则接种后容易从受伤部位产生愈伤组织。生愈伤组织。2 2、接种、接种注意：注意：（三）接种和培养（三）接种和培养培养条件：温度控制在培养条件：温度控制在2525左右，不需要左右，不需要光照。光照。幼小植株形成后才需要光照。幼小植株形成后才需要光照。3 3、培养、培养培养：一般经过培养：一般经过20-3020-30天培养后，会发现花药天培养后，会发现花药开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体。开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体。长出愈伤组织则将愈伤组织及时转移到分化培养长出愈伤组织则将愈伤组织及时转移到分化培养基上，
14、以便进一步分化出再生植株。基上，以便进一步分化出再生植株。注意：如果花药开裂释放出胚状体，则一个注意：如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，花药内就会产生大量幼小植株，必须在花药开必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。养基上，否则这些植株将很难分开。在花药培养中，特别是通过愈伤组在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的花粉植株，常常会出现染织形成的花粉植株，常常会出现染色体倍性的变化（主要原因是色体倍性的变化（主要原因是营养营养细胞核和生殖细胞核融合细胞核和生殖细胞核融合造成的）。造成的）
15、。4 4、鉴定和筛选、鉴定和筛选课题成果评价课题成果评价选材是否恰当选材是否恰当选材是否恰当选材是否恰当 选材是否成功是花药培养成功的关键。应学会选材是否成功是花药培养成功的关键。应学会选材是否成功是花药培养成功的关键。应学会选材是否成功是花药培养成功的关键。应学会 通过显微镜观察处于适宜发育期的花粉。通过显微镜观察处于适宜发育期的花粉。通过显微镜观察处于适宜发育期的花粉。通过显微镜观察处于适宜发育期的花粉。无菌技术是否过关无菌技术是否过关无菌技术是否过关无菌技术是否过关 如果出现了污染现象，说明某些操作步骤，如如果出现了污染现象，说明某些操作步骤，如如果出现了污染现象，说明某些操作步骤，如如
16、果出现了污染现象，说明某些操作步骤，如 培养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。培养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。培养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。培养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。接种是否成功接种是否成功 如果接种的花药长出愈伤组织或释放出胚状如果接种的花药长出愈伤组织或释放出胚状体，花药培养的第一步就成功了。要适时转换培养体，花药培养的第一步就成功了。要适时转换培养基，以便愈伤组织或胚状体进一步分化成再生植株。基，以便愈伤组织或胚状体进一步分化成再生植株。课题成果评价课题成果评价植物组织培养技术与花药培养技术的比较植物组织培养技术与花药培养技术的比较项目项目植物组织培养植物组织培养花药培养技术花药培养技术相同点相同点1 1 培养基配制方法、无菌技术及接种操作培养基配制方法、无菌技术及接种操作等基本相同。等基本相同。2 2 都经过了脱分化都经过了脱分化不同点不同点1 1 离体培养的外植离体培养的外植体为体为体细胞。体细胞。2 2 有丝分裂的过程，有丝分裂的过程，染色体数量不变。染色体数量不变。1 1 花粉是花粉是生殖细胞生殖细胞，得，得到的到的单倍体植株单倍体植株，弱小，弱小且高度不育。且高度不育。2 2秋水仙素处理，染色秋水仙素处理，染色体加倍，恢复正常的染体加倍，恢复正常的染色体数，为色体数，为纯种纯种纯种纯种。结束结束