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1、实验二分离以尿素为氮源的微生物(最新)二、实验目的二、实验目的1 1 1 1、使用以尿素为、使用以尿素为、使用以尿素为、使用以尿素为唯一唯一唯一唯一氮源的培养基分离细菌氮源的培养基分离细菌氮源的培养基分离细菌氮源的培养基分离细菌(有有有有脲酶脲酶脲酶脲酶)2 2 2 2、通过指示剂、通过指示剂、通过指示剂、通过指示剂（酚红）颜色的变化（酚红）颜色的变化（酚红）颜色的变化（酚红）颜色的变化检知培养基检知培养基检知培养基检知培养基pHpHpHpH的变化的变化的变化的变化(脲酶催化的化学反应脲酶催化的化学反应脲酶催化的化学反应脲酶催化的化学反应)问：有脲酶的细菌在生态稳态上起什么作用？问：有脲酶的细
2、菌在生态稳态上起什么作用？土壤中的尿素在较高温度下会被水解成氨，氨土壤中的尿素在较高温度下会被水解成氨，氨使土壤碱化，氨还与使土壤碱化，氨还与SOSO4 42-2-等离子形成化合物，等离子形成化合物，使土壤板结。而脲酶的细菌不仅使动植物尸体使土壤板结。而脲酶的细菌不仅使动植物尸体降解，而且利用了所形成的氨，降解，而且利用了所形成的氨，有利于自然界有利于自然界中氮的循环。中氮的循环。实验步骤(1)灭菌灭菌：将配制好的：将配制好的150mlLB用用 法灭菌的固法灭菌的固体培养基和用体培养基和用 法灭菌的法灭菌的 培养基分别培养基分别装入两个装入两个250ml的三角瓶中，加上封口膜。的三角瓶中，加上
3、封口膜。(2)制平板制平板：在：在 旁将固体培养基分别倒旁将固体培养基分别倒12个平板，待凝，使之形成平面。个平板，待凝，使之形成平面。(3)制备一定浓度梯度的细菌悬液制备一定浓度梯度的细菌悬液(4)涂布分离法分离细菌涂布分离法分离细菌：将：将0.1ml的不同浓度稀释液分的不同浓度稀释液分别加到两种培养基上，再将保存在别加到两种培养基上，再将保存在 酒精中的酒精中的 在在酒精灯上引燃、冷却后涂布，培养皿酒精灯上引燃、冷却后涂布，培养皿 ，放在，放在 恒温培养箱中进行培养恒温培养箱中进行培养 h。观察。观察 。三三.实验步骤实验步骤.倒平板倒平板倒平板倒平板.制备一定浓度梯度的细菌悬液制备一定浓
4、度梯度的细菌悬液制备一定浓度梯度的细菌悬液制备一定浓度梯度的细菌悬液g g g g土壤土壤土壤土壤mlmlmlml无菌水，振荡，为无菌水，振荡，为无菌水，振荡，为无菌水，振荡，为-2-2-2-2稀释液，依次制备稀释液，依次制备稀释液，依次制备稀释液，依次制备-3-3-3-3、-4-4-4-4、-5-5-5-5的土壤稀释液。的土壤稀释液。的土壤稀释液。的土壤稀释液。.稀释涂布分离法分离细菌稀释涂布分离法分离细菌稀释涂布分离法分离细菌稀释涂布分离法分离细菌.制备无菌的固体培养基和尿素固体培养基制备无菌的固体培养基和尿素固体培养基制备无菌的固体培养基和尿素固体培养基制备无菌的固体培养基和尿素固体培养
5、基P26P26P26P26.培养观察培养观察培养观察培养观察（倒置，（倒置，（倒置，（倒置，37 24-48h37 24-48h37 24-48h37 24-48h）（无菌，（无菌，0.1ml0.1ml，玻璃刮刀），玻璃刮刀）（一）配制培养基（一）配制培养基尿素培养基尿素培养基 葡萄糖葡萄糖 0.025g0.025g NaCl 0.12g NaCl 0.12g K K2 2HPO4 0.12g HPO4 0.12g 琼脂糖琼脂糖 0.5g0.5g 酚红酚红 0.25g0.25g 尿素尿素 10ml10mlLBLB培养基培养基 蛋白胨：蛋白胨：0.25g0.25g 酵母提取液：酵母提取液：0.1
6、2g0.12g NaCl NaCl：0.25g0.25g 琼脂糖琼脂糖：0.5g 0.5g 对照组对照组选择培养基选择培养基选择培养基选择培养基实验组实验组为什么用琼脂糖代替琼脂？怎么获得无菌的尿素溶液？为什么用琼脂糖代替琼脂？怎么获得无菌的尿素溶液？因为琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的因为琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物。琼脂糖是琼脂纯化的产物。含氮化合物。琼脂糖是琼脂纯化的产物。（固化作用）（固化作用）（作为氮源）（作为氮源）（二）倒平板（二）倒平板需要倒需要倒3个个LB平板，平板，9个尿素平板个尿素平板LB(对照)尿素10-210-310-4每个稀释度每个稀释度 1个个
7、LB对照平板对照平板 3个尿素平板个尿素平板(平行重复组平行重复组)（三）制备细菌悬液（三）制备细菌悬液接种取0.1ml菌悬液涂布分离高浓度高浓度低浓度，换枪头低浓度，换枪头低浓度低浓度高浓度，可不用换枪头高浓度，可不用换枪头涂布分离37倒置培养按浓度捆成一摞按浓度捆成一摞恒温恒温37培养培养10-4、10-3,、10-2（四）实验结果（四）实验结果（四）实验结果1全培养基全培养基尿素培养基尿素培养基10-210-310-410-5（四）实验结果2全培养基全培养基尿素培养基尿素培养基10-210-310-4恒温恒温37培养培养LB培养基上培养基上10-2、10-3、10-4、10-5稀释度土样
8、涂布结果稀释度土样涂布结果尿素培养基上对应稀释度土样涂布结果尿素培养基上对应稀释度土样涂布结果尿素培养基上对应稀释度土样涂布结果尿素培养基上对应稀释度土样涂布结果1 1 1 1、有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现、有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现、有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现、有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现？细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中尿素水解，细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中尿素水解，细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中尿素水解，细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中尿素水解，水解后产生氨，氨为碱性，酚酞在酸性环境里水解后产生氨，氨为碱性，酚酞在酸性环境里水解后
9、产生氨，氨为碱性，酚酞在酸性环境里水解后产生氨，氨为碱性，酚酞在酸性环境里呈黄色，碱性里呈红色。培养基中酸碱指示剂呈黄色，碱性里呈红色。培养基中酸碱指示剂呈黄色，碱性里呈红色。培养基中酸碱指示剂呈黄色，碱性里呈红色。培养基中酸碱指示剂产生颜色变化（变红），标志着存在脲酶水解产生颜色变化（变红），标志着存在脲酶水解产生颜色变化（变红），标志着存在脲酶水解产生颜色变化（变红），标志着存在脲酶水解尿素的作用，从而证明这一菌株以尿素为氮源。尿素的作用，从而证明这一菌株以尿素为氮源。尿素的作用，从而证明这一菌株以尿素为氮源。尿素的作用，从而证明这一菌株以尿素为氮源。红色区域大小代表什么？红色区域大小代表
10、什么？思考题：圆形红色区域越大，说明这种菌利用圆形红色区域越大，说明这种菌利用尿素的能力越强。尿素的能力越强。2 2、与全营养培养基上的菌落数比较，为什么、与全营养培养基上的菌落数比较，为什么尿素培养基上只有少数菌落尿素培养基上只有少数菌落？表明能利用尿素的细菌在土壤菌落中只占有极表明能利用尿素的细菌在土壤菌落中只占有极少数。少数。3 3、本实验分离出来的细菌一定都是以尿素为氮、本实验分离出来的细菌一定都是以尿素为氮源的细菌吗？源的细菌吗？不一定，有些细菌能利用其它微生物的代谢产物不一定，有些细菌能利用其它微生物的代谢产物。思考题：练习题练习题1 1、选择培养基：在微生物学中，将允许、选择培养
11、基：在微生物学中，将允许 种类的微生物生种类的微生物生长，同时长，同时 和和 其他种类微生物生长的培养基，称作选其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。择培养基。阻止阻止 特定特定抑制抑制2 2、常用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目。当样品、常用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目。当样品的的 足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个于样品稀释液中的一个 。通过统计平板上的菌落数，。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在一
12、般选择菌落数在 的平板进行计数。此外，测定的平板进行计数。此外，测定微生物数量的常用方法还有微生物数量的常用方法还有 直接计数。直接计数。显微镜显微镜 稀释度稀释度细菌细菌30-30030-3003 3、在同一稀释度下，至少对、在同一稀释度下，至少对3 3个平板进行重复计数，然后求个平板进行重复计数，然后求出出 ，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。菌的数目。平均数平均数 4 4、用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀、用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为释倍数为10106 6的培养基中得到以下几种统计结
13、果，正确的是的培养基中得到以下几种统计结果，正确的是 A A涂布了一个平板，统计的菌落数是涂布了一个平板，统计的菌落数是230230 B B涂布了两个平板，统计的菌落数是涂布了两个平板，统计的菌落数是215215和和260260，取平均值，取平均值238238 C C涂布了三个平板，统计的菌落数分别是涂布了三个平板，统计的菌落数分别是2121、212212和和256256，取，取平均值平均值163163 D D涂布了三个平板，统计的菌落数分别是涂布了三个平板，统计的菌落数分别是2l02l0、240240和和250250，取，取平均值平均值233233D 5.5.在做分离分解尿素的细菌实验时，在
14、做分离分解尿素的细菌实验时，A A同学从对应同学从对应10106 6培养基上培养基上筛选出大约筛选出大约150150个菌落，而其他同学只选择出大约个菌落，而其他同学只选择出大约5050个菌落。个菌落。A A同学的结果产生原因可能有同学的结果产生原因可能有()()由于土样不同由于土样不同 由于培养基污染由于培养基污染 由于操作失误由于操作失误 没有设置对照没有设置对照 A A B B C C D DA 1 1、为什么要用琼脂糖代替琼脂配置固体培养基、为什么要用琼脂糖代替琼脂配置固体培养基因为琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的因为琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物。如果用琼脂固化培养
15、基，会为细含氮化合物。如果用琼脂固化培养基，会为细菌提供一定量的非尿素类氮源，这样会在尿素菌提供一定量的非尿素类氮源，这样会在尿素固体培养上产生大量以非尿素为氮源的细菌，固体培养上产生大量以非尿素为氮源的细菌，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选，故用纯化不利于以尿素为氮源的细菌的筛选，故用纯化的琼脂糖而不用琼脂做固化剂的琼脂糖而不用琼脂做固化剂思考题：2 2、有脲酶的细菌在生态稳态上起什么作用、有脲酶的细菌在生态稳态上起什么作用土壤中的尿素在较高温度下会被水解成氨，氨土壤中的尿素在较高温度下会被水解成氨，氨使土壤碱化，氨还与使土壤碱化，氨还与SOSO4 42-2-等离子形成化合物，等离子形成化合物
16、，使土壤板结。而脲酶的细菌不仅使动植物尸体使土壤板结。而脲酶的细菌不仅使动植物尸体降解，而且利用了所形成的氨，有利于自然界降解，而且利用了所形成的氨，有利于自然界中氮的循环。中氮的循环。三、实验中涉及到的一些问题：三、实验中涉及到的一些问题：（一）哪些土壤中含有这种以尿素为氮源的微生物多（一）哪些土壤中含有这种以尿素为氮源的微生物多？（选材的问题）？（选材的问题）（二）此实验用到的选择培养基必需含有哪些物质？（二）此实验用到的选择培养基必需含有哪些物质？（三）可用什么指标认定不同土壤中选择出的微生物（三）可用什么指标认定不同土壤中选择出的微生物对尿素分解能力的高低？对尿素分解能力的高低？（四）
17、统计微生物的数量可用哪些方法？（四）统计微生物的数量可用哪些方法？没硬化，腐殖质丰富的土壤没硬化，腐殖质丰富的土壤碳源、尿素、无机盐、水、酚红碳源、尿素、无机盐、水、酚红培养基红色的深浅培养基红色的深浅稀释涂布平板法，显微镜直接计数法稀释涂布平板法，显微镜直接计数法三、实验中涉及到的一些问题：三、实验中涉及到的一些问题：（五）用稀释涂布平板法计数时，菌落数在（五）用稀释涂布平板法计数时，菌落数在30-30030-300计数。计数。重复性原则重复性原则对照原则对照原则（排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验的可信度）做一系列浓度梯度实验，探究合适的稀释度做一系列浓度梯度实验，探究合适的稀释度（六）实验设计要遵循的原则：（六）实验设计要遵循的原则：此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢