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1、实验八DNA重组子的构建与鉴定 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望获获得得目目的的基基因因片片段段，选选择择好好适适当当的的载载体体，并并确确定定重重组组方方案案后后，接接下下来来要要进进行行的的就就是是片片段段之之间间的的体体外外连连接接了了（即即DNA重重组组），从而从而获获得得DNA重重组组体体又叫又叫DNA重重组组子子。DNA重重组组子子需需转转移移入入相相应应的的受受体体细细胞胞中中用用于于对对目的基因的目的基因的扩扩增及目的基因的蛋白表达。
2、增及目的基因的蛋白表达。原理原理DNA重组技术的操作过程重组技术的操作过程3 A-A 3 PCR productT-A cloning3 A-A 3 PCR productMCSPCR productT-A cloning重组体导入受体细胞可能的情况重组体导入受体细胞可能的情况由由于于重重组组体体DNA分分子子导导入入受受体体细细胞胞的的比比例例通通常常较较低低，只只有有极极少少数数受受体体细细胞胞接接受受到到重重组组体体DNA分分子子，能能实实现现目目的的基基因因的的转转移移；绝绝大大部部分分仍仍是是原原来来的的受受体体细细胞胞，或或者者是是不不含含目目的的基基因因的的转转化化子子。所所以以
3、必必须须从从大大量量的的培培养养细细胞胞中中初初步步筛筛选选出出含含有有目目的的基基因因重重组组体的受体体的受体细细胞并作胞并作进进一步的一步的鉴鉴定定。重组体导入受体细胞的效率较低重组体导入受体细胞的效率较低重组体导入受体细胞后的筛选培养重组体导入受体细胞后的筛选培养大部分是含空大部分是含空载载体的体的转转化子（化子（非重非重组组子子）少部分是含目的基因少部分是含目的基因的的转转化子（化子（重重组组子子）少数是不含少数是不含载载体的受体的受体体细细胞（胞（非非转转化子化子）常用鉴定方法常用鉴定方法n小规模制备质粒小规模制备质粒DNA进行限制酶切分析进行限制酶切分析n 互补互补n杂交筛选杂交筛
4、选酶切和电泳方法酶切和电泳方法琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段：32P标记的DNA分子探针杂交放射自显影法DNA杂交直接鉴定杂交直接鉴定Ampr抗性筛选和互补(蓝白斑)筛选n本实验所使用的载体质粒DNA为pUCm-T载体，由于其上带有Ampr 和lacZ基因，故重组子的筛选采用Amp抗性筛选与-互补现象筛选相结合的方法。Ampr抗性筛选n因pUCm-T载体带有Ampr基因，而外源片段上不带该基因，故转化受体菌后只有带有pUCm-T的受体菌（转化子）才能在含有Amp的LB平板上存活；只带有自身环化外源片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。-互补互补-互补的插入失活互补的插入失活pU
5、C载体上LacZ基因的5端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ（-片段）片段）的合成，但插入外源目的基因后就会阻止LacZ的合成，使不能互补 lacZ 5 3 肽互补MCS肽移码突变lacZ 5 3 不互补外源DNA 蓝白斑筛选示意图蓝白斑筛选示意图互补互补(蓝白斑蓝白斑)筛选筛选npUCm-T上带有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），但并没有破坏lacZ的阅读框架，不影响其正常功能。E.coli DH5菌株带有-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下，pUCm-T和DH5编码
6、的-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pUCm-T重组子和DH5融为一体时形成具有酶活性的蛋白质。n这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫-互补。n由-互补产生的Lac+细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)存在下被IPTG(异丙基-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。n当外源片段插入到pUCm-T质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变，表达蛋白失活，产生的氨基酸片段失去-互补能力，因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。此为-互补现象筛选。实验材料试剂实
7、验材料试剂n外外源源DNA片片段段:带带A粘粘性性末末端端的的purified PCR productnT-载载体体DNA:pUCm-T质质粒粒(Ampr，lacZ)nT 4 DNA ligase,5U/uln T4 DNA ligase buffernSterilized ddH2On宿主菌宿主菌:具有具有-互互补补能力的能力的E.coli DH5菌株菌株nAmp/X-gal LB plate操作步骤操作步骤T-vector+PCR product Ligationn1.取新的0.5ml eppendorf管，编号。n2.依次加入：n ddH2O 2ln T-vector 1 l n PCR
8、 product 5l n 10T4 DNA ligase buffer 1ln T4 DNA ligase 1ln3.混匀后将液体全部甩到管底,at RT for 0.5h转化、涂板转化、涂板及及培养培养取取5l连连接接产产物物 加入置于冰上的加入置于冰上的100l感受感受态态细细菌（在菌（在1.5 ml管）中管）中 置冰上置冰上30分分钟钟 42oC热热休克休克90秒秒 置冰上置冰上2分分钟钟 加入加入0.5ml LB液液体体 在在37oC 于于120rpm复复苏苏40分分钟钟 5000rpm离离心心2分分钟钟 除去除去400l 上清，留下的上清，留下的200l上清上清轻轻轻轻与与细细菌沉淀混匀菌沉淀混匀 将混匀的将混匀的200l细细菌菌悬悬液全液全部涂于部涂于Amp/X-gal板上板上 37oC培养培养过过夜（夜（14-16小小时时）观观察察细细菌菌落菌菌落.结结 果果