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1、实验二 DNA的酶切、电泳与Southern杂交 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望实验目的学习并掌握DNA酶切、电泳技术学习掌握Southern杂交的原理和技术实验原理限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。它可分为三类：类和类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于ATP的存在。类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而类酶在识别位点上切割DNA分子，
2、然后从底物上解离。类由两种酶组成：一种为限制性内切核酸酶（限制酶）,它切割某一特异的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoR识别六个核苷酸序列：5-GAATTC-3)，有少数酶识别更长的序列或简并序列。类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如Sma：5-CCCGGG-3);有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘
3、性未端，如EcoR切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5GCTTAA pAATTCG5 p5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5GCTTAA pAATTCG5 p5 5AGCTTCGAAlu I5AGTC pCTGA5 pAGCTTCGA酶切后平末端酶切后粘性末端DNADNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受大部分限制性内切酶不受RNARNA或单链或单链DNADNA的影响。当微量
4、的污染的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸管头。吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各自的最适盐如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓则可同时水解。若需要不同的盐浓度度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用，随后调节盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在
5、第一个酶切反应完成再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚后，用等体积酚/氯仿抽提，加氯仿抽提，加0.10.1倍体积倍体积3mol/L NaAc3mol/L NaAc和和2 2倍体积倍体积无水乙醇，混匀后置无水乙醇，混匀后置-70-70低温冰箱低温冰箱3030分钟，离心、干燥并重新溶分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。于缓冲液后进行第二个酶切反应。酶切过程中的注意事项在酶切过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般在酶切过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNADNA用量约用量约为为0.5-1g0.5-1g。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相
6、同限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度切缓冲液和最适反应温度(大多数为大多数为37)37)。对质粒对质粒DNADNA酶切反应而言酶切反应而言,限制性内切酶用量可按标准体系限制性内切酶用量可按标准体系1g 1g DNADNA加加1 1单位酶单位酶,消化消化1-21-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加一般增加2-32-3倍倍,甚至更多甚至更多,反应时间也要适当延长。反应时间也要适当延长。酶切过程中的注意事项DNADNA限限制制性性内内切切酶酶酶酶切切图图谱谱又又称称DNADNA的的物物理
7、理图图谱谱，它它由由一一系系列列位位置置确确定定的的多多种种限限制制性性内内切切酶酶酶酶切切位位点点组组成成，以以直直线线或或环环状状图图式式表表示示。在在DNADNA序序列列分分析析、基基因因组组的的功功能能图图谱谱绘绘制制、DNADNA的的无无性性繁繁殖殖、基基因因文文库库的的构构建建等等工工作作中中，建建立立限限制制性性内内切切酶酶图图谱谱都都是是不不可可缺缺少少的的环环节节，近近年年来来发发展展起起来来的的限限制制性性片片段段长长度度多多态态性性(RFLP)RFLP)技术更是建立在它的基础之上。技术更是建立在它的基础之上。技术应用技术应用 DNADNA限制性内切酶酶切图谱限制性内切酶酶
8、切图谱目标目标DNADNA片段分析片段分析基因工程中外源基因工程中外源DNADNA与载体的连接与载体的连接目标目标DNADNA片段分析片段分析基因工程中外源基因工程中外源DNADNA与载体的连接与载体的连接DNADNA限制性内切酶酶切图谱限制性内切酶酶切图谱SouthernSouthern杂交杂交建立酶切反应体系建立酶切反应体系适量适量DNADNA2ul 10 x2ul 10 x限制性内切酶缓冲液限制性内切酶缓冲液2 2ul 40 mmol/L spermidineul 40 mmol/L spermidine1ul 100 mmol/L DTT1ul 100 mmol/L DTT限制性内切酶
9、限制性内切酶 2 2/ug DNA/ug DNA加加ddH2OddH2O定容至定容至2020ul ul注意：酶、缓冲液等需置于冰上；反应中酶应该是最后注意：酶、缓冲液等需置于冰上；反应中酶应该是最后一个加入的试剂。一个加入的试剂。3737摄氏度保温摄氏度保温1 1小时小时SouthernSouthern杂交技术原理与流程杂交技术原理与流程SouthernSouthern印迹杂交（印迹杂交（Southern blotSouthern blot）是）是19751975年由英国人年由英国人southernsouthern创建，创建，是研究是研究DNADNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、图谱的基本技术
10、，在遗传病诊断、DNADNA图谱分析及图谱分析及PCRPCR产物分析等方面有重要价值。产物分析等方面有重要价值。基本原理基本原理：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由核酸分子碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切酶的的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切酶的分析结果，便可绘制出分析结果，便可绘制出DNADNA分子的限制图谱。但为了进一步构建出分子的限制图谱。但为了进一步构建出DNADNA分子的遗
11、传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必需掌握特殊要求，还必需掌握DNADNA分子中基因编码区的大小和位置。这类分子中基因编码区的大小和位置。这类数据资料均可应用数据资料均可应用SouthernSouthern杂交技术获得。杂交技术获得。SouthernSouthern印迹杂交技术包括两个主要过程：印迹杂交技术包括两个主要过程：1 1、将待测定、将待测定核酸核酸分子通过一定的方法转移并结合到分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（印迹
12、（blottingblotting）；）；2 2、固定于膜上的核酸、固定于膜上的核酸同位素同位素标记的探针在一定的温标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。度和离子强度下退火，即分子杂交过程。SouthernSouthern印迹杂交印迹杂交基本方法及主要步骤一、待测核酸样品的制备（一）制备待测DNA（二）DNA限制酶消化二、琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品三、电泳凝胶预处理四、转膜五、探针标记六、预杂交（prehybridizafion）七、Southern杂交八、洗膜九、放射性自显影检测1 1天天1 1天天1 1天天1 1天天2 2天天1 1天天3-73-7天天琼脂糖凝胶电泳
13、分离待测DNA样品0.9%琼脂糖凝胶电泳建议大家使用大胶进行电泳20-30V电泳(过夜电泳)慢！慢！Southern印迹杂交是先将DNA样品(含不同大小的DNA片段)先按片断长短进行分离，然后进行杂交。这样可确定杂交靶分子的大小。因此，制备DNA样品后需要进行电泳分离。在恒定电压下，将DNA样品放在0.81.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，标准的琼脂糖凝胶电泳可分辨7080000bp的DNA片段，故可对DNA片段进行分离。转 膜DNADNA样品在制备和电泳过程中始终保持双链结构。为了进行有效地实现样品在制备和电泳过程中始终保持双链结构。为了进行有效地实现SouthernSouthern印迹转移，对电
14、泳凝胶做预处理十分必要。超过印迹转移，对电泳凝胶做预处理十分必要。超过10kb10kb的较大的的较大的DNADNA片段与较短的小分子量片段与较短的小分子量DNADNA相比，需要更长的转移时间。所以为了相比，需要更长的转移时间。所以为了使使DNADNA片段在合理的时间内从凝胶中移动出来，必须将最长的片段在合理的时间内从凝胶中移动出来，必须将最长的DNADNA片段片段控制在大约控制在大约2kb2kb以下。以下。DNADNA的大片段必须被打成缺口以缩短其长度。因此，的大片段必须被打成缺口以缩短其长度。因此，通常是将电泳凝胶浸泡在通常是将电泳凝胶浸泡在0.25mol/L 0.25mol/L 的的HCl
15、HCl溶液短暂的脱嘌呤处理之后，移溶液短暂的脱嘌呤处理之后，移至于碱性溶液中浸泡，使至于碱性溶液中浸泡，使DNADNA变形并断裂形成较短的单链变形并断裂形成较短的单链DNADNA片段，再片段，再用中性用中性PHPH的缓冲液中和凝胶中的缓冲液。的缓冲液中和凝胶中的缓冲液。探针标记预杂交（prehybridizafion）Southern杂交用于用于SouthernSouthern印迹杂交的探针可以是纯化的印迹杂交的探针可以是纯化的DNADNA片段片段或寡或寡核苷酸核苷酸片段。探针可以用放射性物质标记或用地片段。探针可以用放射性物质标记或用地高辛标记，放射性标记灵敏度高，效果好；地高辛标高辛标记，
16、放射性标记灵敏度高，效果好；地高辛标记没有，安全性好。人工合成的短寡核苷酸可以用记没有，安全性好。人工合成的短寡核苷酸可以用T4T4多聚核苷酸激酶进行末端标记。探针标记的方法有随多聚核苷酸激酶进行末端标记。探针标记的方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法。机引物法、切口平移法和末端标记法。将固定于膜上的将固定于膜上的DNADNA片段与探针进行杂交之前，必须先进行一个预杂交的过程。片段与探针进行杂交之前，必须先进行一个预杂交的过程。因为能结合因为能结合DNADNA片段的膜同样能够结合探针片段的膜同样能够结合探针DNADNA，在进行杂交前，必须将膜上，在进行杂交前，必须将膜上所有能与所有能与DN
17、ADNA结合的位点全部封闭，这就是预杂交的目的。结合的位点全部封闭，这就是预杂交的目的。转印后的滤膜在预杂交液中温育转印后的滤膜在预杂交液中温育4-6h4-6h，即可加入标记的探针，即可加入标记的探针DNADNA（探针（探针DNADNA预预先经加热变性成为单链先经加热变性成为单链DANDAN分子），即可进行杂交反应。杂交是在相对高离子分子），即可进行杂交反应。杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行。杂交过夜，然后在较高温度下用盐溶液洗膜。离子强度的缓冲盐溶液中进行。杂交过夜，然后在较高温度下用盐溶液洗膜。离子强度越低，温度越高，杂交的严格程度越高，也就是说，只有探针和待测顺序强度越低，温度越
18、高，杂交的严格程度越高，也就是说，只有探针和待测顺序之间有非常高的同源性时，才能在低盐高温的杂交条件下结合。之间有非常高的同源性时，才能在低盐高温的杂交条件下结合。采用核素标记的探针或发光剂标记的探针进行杂交还需注意的关键一步就是洗膜。在洗膜过程中，要不断振荡，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时，即停止洗膜。洗完的膜浸入2SSC中2min，取出膜，用滤纸吸干膜表面的水分，并用保鲜膜包裹。注意保鲜膜与NC膜之间不能有气泡。洗 膜放射性自显影检测1 将滤膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏）。2 在暗室内，将2张X光底片放入曝光暗盒，并用透明胶代固定，合上暗盒。3 将暗盒置-70低温冰箱中使滤膜对X光底片曝光（根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天）。4 从冰箱中取出暗盒，置室温1-2h，使其温度上升至室温，然后冲洗X光底片（洗片时先洗一张，若感光偏弱，则在多加两天曝光时间，再洗第二张片子）。Thank you!