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1、ICS 11.220 CCS B 41 62 甘肃省h巴TA 方析、准0862/T 4634-2022 牛结节性皮肤病血清学诊断技术Serodiagnostic technology for lumpy skin disease 2022-09-16发布2022-10-20实施甘肃省市场监督管理局发布牛结节性皮肤病血清学诊断技术范围本文件规定了牛结节性皮肤病的血清学诊断方法及其综合判定。本文件适用于牛结节性皮肤病的快速诊断、检疫和流行病学调查。2 规范性引用文件0862/T 4634-2022 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应
2、的版本适用于本关件;不注日期的引用文件，其最新版炼U包括所有的修改单)适用于本文件。GB 19489 实验室生物安全通用要求GB/T 39602 牛结节性皮肤病诊断技术NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存和运输技术规范3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 牛结节性皮肤病Jumpyskmdmse(LSD)又名牛疙瘩皮肤痛，是由症病毒科脊椎动物亚科山羊症病毒属的牛结节性皮肤病病毒(LSDV)感染牛引起的种气染病主要由吸血节肢动物传播，其|脂床特征主要为发热，皮肤、数膜和内脏器官表面的广泛性结节，淋巴结肿大，动物消瘦，产奶量降低，不孕、不育和流产，以及无症状的隐性损伤和继发感染等表现
3、。4 样品采集与生物去全管理LSDI自床病例检查与剖检，诊断检测样品的采集、运输和处理按照GB/T39602和NY/T541执行;实负(验室血清学试验以及待检样品、培养物和废弃物处理中的生物安全管理均按GB19489的相关规定执行。5 病毒中和试验CVNT)5.1 材料MEM培养液，绵羊羔辜丸细胞(LTc),MDBK细胞，LSDV抗原及标准阳性、阴性血清，待检血i肯。5.2 方法5.2.1 样品处理1 0862/T 4634-2022 将待检血i育，包括标准阳性血清、阴性血请各l份，用E咯les!HEPES液5倍稀释，56C土0.5C灭活30mm后备用。5.2.2 标准毒株与处理将loglO6
4、 TCID，o/mL的山羊症病毒属病毒参考毒株或LSDV标准毒株在小瓶中用E咯les!HEPES液进行系列稀释，毒价分别为loglO5.0 TCIDso/mL、loglO4.0 TCIDso/mL、loglO3.5 TCIDso/mL、loglO3.0 TCIDso/mL、loglO 2.5 TCID，o/mL、loglO2.0 TCID，o/mL和loglO1.5 TCID，o/mL。5.2.3 加血清与病毒5.2.3.1 将第l份灭活的待检血清50L分别加到微量j商定板A到H行的第l、第2列孔中，第2份血清加到第二第4列孔中，第3份血清加到J第三第6列孔中，第4份血清加到第7、第8列孔中，
5、阴性对照血清加到第9、第10列孔中，50L不含血清的Eagles!HEPES液分别加到第11、第12列以及H行的所有孔中。5.2.3.2 从G行开始用最大稀释度的病毒液50L.加到该行的每个孔中。依此将每个稀释度的病毒加入到相应行的各孔中，直到最小病毒稀释物加到UA 行。5.2.4 感作中和摇匀后，微量;商定板加盖，置3TC土0.5C温箱中，中和孵育lh，期间每15min振摇l次。5.2.5 细胞感染取生长良好的单层MDBK细胞或LTc1瓶，按常规方法消化，用Eagles培养基调整细胞浓度至105个/mL.将lL细胞悬液加到除培养基对照孔Hll和H12以外的所有孔中，H行的其余孔作为细胞和血清
6、对照。接种后，微量j商定板加盖，置3TC土0.5C、5%CO，培养箱条件下培养。5.2.6 细胞病变观察从培养第3d开始，在倒置显微镜下每天观察单层细胞的细胞病变效应CCPE)情况，直至第判，H行细胞应无CPE。以待检血清最高稀释度50%保护为该待检lIl育中和效价，以能保护细胞免受感染的最高稀释度为该血洁的抗体滴度。5.3 结果判定用Krber方法计算病毒中和指数，即病毒在标准阴性血洁和待检血清间的log商度差。若指数去1.5表示为LSDV阳性。6 Western-blot试验6.1 材料6.1.1 浓缩胶:由5%聚丙股股Tris(125mM,pH 6.8)和SDS(0.1%)组成，6.1.
7、2 分离胶:由1O%12.5%聚丙眈胶Tris(560mM,pH 8.7)和SDS(O.1%)组成;6.1.3 甘氨酸电泳缓冲液250mMTris、2M甘氨酸和O.I%SDS;6.1.4 封闭液3%BSA;f日0.05%Tween 20 PBS，或5%奶粉和0.05%Tween 20 PBS;6.1.5 二氨基联苯胶盐酸盐i自液(在50mL50mm Tris!HCl pH 7.5中加10mg二氨基联苯胶和20L30%v/v过氧化氢);2 0862/T 4634-2022 6.1.6 标准蛋白分子质量marker，硝酸纤维素膜(NCM)，病毒粒子抗原或重组蛋白抗原。6.2 方法6.2.1 样品处
8、理将待检血清，包括阳性血清、阴性血清各l份，用封闭液1，50稀释血清，560土0.50灭活30min后备用。6.2.2 抗原制备当山羊症病毒属病毒感染LT的CPE达到90%时收获细胞，冻融三次，离心，取上请转移到个新.气管，力日病毒裂解液煮沸5min，作为组i只培养的病毒粒子抗原。也可用情外表达的重组蛋白代替病毒粒子抗原。6.2.3 SDS!PAGE分析6.2.3.1 将制备的病毒粒子抗原或重组蛋白抗原与标准蛋白分子质量mark泣同时分别上样，加到SDS!PAGE凝胶孔中，在甘氨酸电泳缓忡液中分离蛋白。6.2.3.2将SDS!PAGE凝胶上分离的蛋白电转移到张硝酸纤维素膜(NOM)上，转移后的
9、NCM用PBS充分冲洗，并用3%牛lIl青白蛋白PBS或5%脱脂奶粉PBS在旋转振荡器上40土050封闭过夜。6.2.4 杂交将NCM按组El剪成数个纸条，用PBS在旋转振荡器上彻底冲洗册，每次飞mm;然后分别放在相应的血清(包括阳性和阴性对照lIl肯)中在室温下震荡l元，再次充分洗涤NCM，并孵育在特定稀释的辣根过氧化酶结合的抗牛免疫球蛋白IgG中，一在室温中进步孵育l元。6.2.5 显色将杂交后的时GM冲洗后，加二氨基联苯胶盐酸盐i窑液和20L30%v/v过氧化氢，然后在室温下震荡孵育3min7mtn，在NCM背景即将变色之前用PBS终止反应。-6.3结果判定阳性对照血请在分子质量67kD
10、a、32kDa、26kDa，19kDa和17kDa处全部显示杂交条带，而阴性血清样品不出现杂交条带，表示试验成立。待检lIl青样品至少出现一条杂交带即为阳性。注抗rJ症病毒(牛丘荡性口炎宦伪牛渲病毒)的高免血清可与LSDV的-EE臼反应，但不与到Da蛋臼反应，以区别之。7 间接ELISA法7.1 材料7.1.1 山羊症病毒属病毒抗原或重组蛋白抗原，兔抗牛辣根过氧化物酶结合物，LSDV标准阳性lIl育、标准阴性血清，TMB底物，ELISA微孔板/条，7.1.2 抗原包被液，0.05mol/碳酸盐缓冲液C075g碳酸纳，1.46g碳酸氢纳，加去离子水定容至500mL，pH9.6)7.1.3 浓缩洗
11、涤缓冲液C25xPBST)C895g Na2HP04 12H20,5g KH2P04,5g KCl,200g NaCl,5mL R士J晶20，30L Proclin 300,700mL水)3 0862/T 4634-2022 7.1.4 封闭缓冲液。但mol!L磷酸盐缓冲液+3%BSAC02g磷酸二氢饵，2.9g磷酸氢二纳，8g氯化纳，30g BSA，加去离子水定容到1000mL)7.1.5 2M终止液ClllmL浓硫酸CH2S04),899mL H20,30L Proclin 300)。7.2 方法7.2.1 抗原处理山羊症病毒属病毒蛋白抗原或重组蛋白抗原，在-20C土O.SC长期保存或2C
12、土0.SC8C土O.SC短期保存备用，使用时用包被液稀释即可。7.2.2 标准阴、阳性血清制备用LSDV新疆毒株感染3月龄4月龄的经病原学、血清学检测为阴性的楼牛，感染21天后，采集全血分离血洁，利用病毒中和试验测定抗体效价，大于1:8为标准阳性血i霄，非疫区的经病原学、血i育学检测为阴性的核牛血清为标准阴性血清。7.2.3 抗原包被将抗原稀释到5吨/mL.每孔100L均匀的包被在酶标板孔上，2C土0.SC8C土05C过夜，甩净孔中液体，每孔加入300L洗涤液清洗l次2次，然后每孔中加入IS0L封闭液，37土05C封闭姐，甩干净孔中的液体，在吸水纸巾上拍干。7.2.4 加血清样品取抗原包被的微
13、孔板条固定在板架上，将待检样品用血清稀释液按1:S0倍稀释，加入稀释好的样品，100LI孔;阳性对照血清加2孔，100LI孔;阴性对照血清加2孔，100LI孔;另留l孔不加样品作为空白对照孔，将加好待检样品的微孔板置于3TC土O.SC恒温箱中孵育30min。7.2.5洗j条取出酶标板甩净孔中液体，用PBST洗i条3次每次各孔加入稀释好的洗涤液300件LI孔，静置3min，最后一次在吸水纸巾上拍干。7.2.6 加酶结合物用稀释液对辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG作1，20000稀释(工作浓度为1:100001:200)，每孔加100L.置湿盒内3TC土05C恒温箱中孵育lh。弃去残留的酶结合物i
14、自液，洗涤3次。7.2.7 显色每孔加100L底物缓冲液(TMB)，置入湿盒内3TC土O.SC恒温箱中静置ISmin。7.2.8 终止反应取出微孔板，每孔加终止液。mol!LH2S04)SO件L。7.2.9现IJ定振荡混匀，静置5min后用酶标仪读取每孔4S0mn波长处的光吸收值COD450mn值)。7.3 结果判定4 0862/T 4634-2022 7.3.1 试验成立条件若阴性对照OD450值1.0,P/N值3，则试验成立，结果有效。7.3.2 S/N值计算每份待检样品的OD450值(剖，除以参考阴性对照的OD450值(N)，则得出每份待检样品的S/N值。如果每份待检样品或阴、阳性对照有
15、多孔重复，则应计算平均值后再计算S剧值。7.3.3 判定标准待检样品的S剧三习，则判定该样品为阳性S/N，封闭缓冲液TMB底物，2M终止液。8.2 方法8.2.1 抗原处理同7.2.1的制备方法8.2.2 标准阴/阳性制备同7.2.2的制备方法8.2.3 抗原包被同7.2.3的操作方法8.2.4 竞争抗体制备。1 用PBS将山羊症病毒属病毒抗原或重组蛋白抗原稀释成川问ImL，与弗氏完全佐剂按体积1:1混合，乳化后采用皮下多点注射免疫健康实验家兔每只接种免疫ImL;第一次免疫间隔14d后，用第一次免疫相同的疫苗和剂量进行第2次免疫;第二次免疫再问隔14d后，用力口饱蛋白抗原与弗氏不完全佐剂疫苗进
16、行第3次免疫;用第三次免疫相同的疫苗和剂量进行最后一次免疫，免疫接种后14d从家兔心脏采血，置4C土0.5C过夜后，50rpm离心30min收集血清，过滤除菌公装，-80C土05C保存备用。使用时，1:15000稀释为竞争抗体工作液。8.2.5 加血清样品取己包被抗原的酶标板，每次检测设标准阳性血清对照、阴性血清对照及空白对照孔，其中标准阳性血清对照设2孔，阴性血清对照设2孔，每孔加入相应血清(阳性或阴性对照血清)50LI孔;空白对照设l孔，加lLPBST;其余每孔加入待检血清样品50LI孔。8.2.6 加竞争抗体5 0862/T 4634-2022 除空白对照孔外，其它各孔加入竞争抗体工作液
17、50LI孔后，将酶标板置于3TC土0.5C恒温箱中孵育30mm。8.2.7 洗涤取出酶标板甩净孔中液体，用PBSTl洗涤3次:每次各孔加入稀释好的洗涤液300L/孔，静置3min，最后次在吸水纸巾上拍干。8.2.8 加酶结合物用稀释液(即洗涤液)对辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔IgG作1，8000稀释(工作浓度为1:1O1:100)，每孔加100L，置湿盒内3TC土0.5C恒温箱中孵育Ih。弃去残留的酶结合物j自液，洗i条3次。8.2.9 显色每孔加100L底物缓冲液(TMB)，置入湿盒内3TC土OSC恒温箱中静置15min。8.2.10 终止反应取出试验板，每孔加终止液。mollLH2S04)5
18、0件L。8.2.11 测定振荡混匀，静置5min后用酶标仪读取每孔450mn波长处的光吸收值(OD450mn值)。8.3结果判定8.3.1 试验成立条件阴性血清对照OD4.iOnm值0.9，阳性血清对照PI60%时检测结果成立，否则试验不成立。8.3.2 PI值计算用同一酶标板上测定的阴、阳性对照孔和每份待检血清孔OD4.iOnm值，根据公式计算待检血清的抑制率(p)PI二1-(样本孔的OD4.iOnm值/阴性对照孔的OD4.iOnm值)xl%。8.3.3 判定标准待检血清PI二三55%判定为阳性。9 综合判定9.1 确诊病例符合GB!T39602中的LSD流行病学、临床症状和病理变化的病例特
19、征，经病毒中和试验、Westem-blot试验以及间接/竞争ELISA试验，任一试验为阳性者，可判定为LSD确诊病例。9.2 无症状感染动物不符合GB/T39602中的LSDI!li床症状和病理变化的病例特征，但符合流行病学特征，同时经病毒中和试验、Western-blot试验以及间接/竞争ELISA试验，任试验为阳性，且按照GB/T39602核酸检测为阳性者，可判定为LSD无症状感染动物。6 0862/T 4634-2022 9.3 免疫接种动物不符合GB/T39602中的LSD流行病学、l自床症状和病理变化的病例特征，但经病毒中和试验、Western-blot试验以及间接/竞争ELISA试验，任一试验为阳性，且按照GB/T39602核酸检测为阴性者，可判定为LSD疫苗免疫接种动物。7