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1、实验17 动物组织核酸提取与鉴定 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望实验目的实验目的1.掌握动物组织中掌握动物组织中DNA提取的原理和操作过程提取的原理和操作过程2.了解了解DNA的组分，掌握的组分，掌握DNA的定性检测的具体的定性检测的具体方法方法3.掌握掌握DNA纯度检测和浓度测定方法纯度检测和浓度测定方法实验原理实验原理DNA提取提取 动物组织细胞中的核糖核酸(RNA)与脱氧核糖核酸(DNA)大部分与蛋白质结合形成核蛋白。RNA核蛋白和DNA核蛋
2、白在不同浓度氯化钠溶液中的溶解度有显著区别。DNA核蛋白在0.14 mol/L 氯化钠中溶解度低，但在1 2 mol/L氯化钠中溶解度高；RNA核蛋白在0.14 mol/L氯化钠中溶解度仍有相当大的溶解度。调节氯化钠浓度，可使RNA核蛋白和DNA核蛋白分步提取开来。氯仿-异戊醇溶液可以使核蛋白变性沉淀，将核酸物质萃取出来；再向萃取液中加入适量乙醇，可使DNA析出。氯仿异戊醇抽提和乙醇沉淀方法在DNA纯化研究中非常常用，氯仿-异戊醇抽提的原理是，氯仿可使蛋白质变性并加速有机相与液相分层；异戊醇有助于消除抽提过程中产生的气泡。而DNA不溶于乙醇等有机溶剂，因此可以通过乙醇沉淀来纯化和浓缩DNA。实
3、验原理实验原理DNA提取提取实验原理实验原理DNA鉴定鉴定DNA是由脱氧核糖核苷酸单体构成，其组成部分包括磷酸、有机碱（嘌呤与嘧啶）、戊糖（脱氧核糖）。1）磷酸 磷钼酸 钼蓝 （显蓝色）2）嘌呤碱 嘌呤银化合物（灰褐色、絮状）3）脱氧核糖 -羟基-酮基戊醛 蓝色化合物 Vc 或 氨基萘酚磺酸钼酸铵 硝酸银 硫酸 二苯胺1.含有0.14 mol/L NaCl的0.015 mol/L柠檬酸钠溶液2.1mol/L NaCl溶液3.氯仿-异戊醇（24:1,V/V）4.95%乙醇5.氨水溶液6.5%AgNO3溶液实验试剂实验试剂7.2.5%钼酸铵试剂（取蒸馏水400 mL，加入浓硫酸83 mL，将钼酸铵
4、25 g溶于其中，最后稀释至1 L，冰箱放置一个月不变质）8.Vc-钼酸铵溶液（称取还原型抗坏血酸0.53 g溶解于100 mL 2.5%钼酸铵溶液，贮于棕色瓶中，当天配制）9.3,5-二羟基甲苯试剂（取比重1.19的HCl 100mL，加入FeCl36H2O 100 mg及二羟甲苯100 mL，混合溶解后，置于棕色瓶中，临用前新鲜配制）10.二苯胺试剂（取1 g纯的二苯胺溶于10 mL重蒸馏的冰乙酸中，加入2.75 mL浓硫酸，放置于棕色瓶，临用前新鲜配制）实验仪器实验仪器电子天平 匀浆器 电炉离心机 紫外分光光度计 （一）（一）DNA的提取的提取1.取新鲜猪肝组织3 g，加入0.14 mo
5、l/L NaCl，0.015 mol/L柠檬酸纳溶液6 mL，在乳钵中加入少量石英砂仔细研磨成匀浆，或用组织匀浆器匀浆30 s；2.将匀浆倒入离心管，4000 rpm，15 min，弃上清；3.沉淀中加入15 mL 1mol/L NaCl，混匀，搅拌数分钟，4000 rpm，15 min，弃沉淀；4.上清转移至另一离心管，加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1,V/V），剧烈振摇10 min，4000 rpm，10 min；5.取上层，转移至另一离心管，加入等体积95%乙醇，可见白色丝状沉淀，可用玻棒慢慢缠绕取出沉淀，或4000 rpm，10 min，离心取沉淀（DNA粗品），用1 mL蒸馏水稀释
6、溶解DNA。实验步骤实验步骤（二）（二）DNA的鉴定的鉴定1.取部分DNA溶液加入试管，加4 mL5%（m/V）H2SO4，再用带有长玻璃管的软木塞塞紧管口，在沸水浴中加入15 min，静置数分钟水解DNA，取上清进行鉴定分析；2.取DNA水解液1 mL，加二苯胺试剂2 mL，摇匀于沸水浴中加热10 min，观察颜色变化；3.取0.5 mL5%AgNO3溶液，逐滴加入10%氨水，并使沉淀刚好溶解为宜，然后逐滴加入DNA水解液观察并记录现象；4.取0.5 mL DNA水解液，加入Vc-钼酸铵溶液1 mL，摇匀，放置10 min，有何现象？再将溶液加热，又发生什么变化，请解释之。实验步骤实验步骤（三）（三）DNA的纯度测定与定量的纯度测定与定量1.取DNA提取液0.1 mL，用水或缓冲液稀释一定浓度，用紫外分光光度计分别测定同一样品的260 nm和280 nm的吸光值（OD），检测DNA的纯度及浓度。a)若A260 nm/A280 nm 接近于1.8，则说明DNA样品的纯度高；b)DNA浓度（g/mL）=A260 nm 50 稀释倍数 （1/光经）c)DNA得率（mg）=DNA浓度 最终DNA原液（mL）实验步骤实验步骤1.记录DNA提取和鉴定过程中的试验现象，结合实验原理进行分析；2.分析DNA样品的纯度，计算DNA的浓度和得率。思考题思考题谢谢！谢谢！