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1、实验三 食品中金黄色葡萄球菌的检验 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望o实验目的：实验目的：1、了解金黄色葡萄球菌检验原理；、了解金黄色葡萄球菌检验原理；2、掌握金黄色葡萄球菌鉴定要点和检验方法、掌握金黄色葡萄球菌鉴定要点和检验方法 金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属的一个种，可引金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属的一个种，可引起皮肤组织炎症，还能产生肠毒素，如果在食品中起皮肤组织炎症，还能产生肠毒素，如果在食品中大量生长繁殖并产生毒素，可引起食物中毒，故食大量生长繁
2、殖并产生毒素，可引起食物中毒，故食品中存在金黄色葡萄球菌对人的健康是一种潜在的品中存在金黄色葡萄球菌对人的健康是一种潜在的危险，检查食品中金黄色葡萄球菌及数量具有实际危险，检查食品中金黄色葡萄球菌及数量具有实际意义。意义。o金黄色葡萄球菌性质及培养特征金黄色葡萄球菌性质及培养特征1 1、革兰氏阳性球菌，排列为葡萄状，无芽、革兰氏阳性球菌，排列为葡萄状，无芽孢、无荚膜。孢、无荚膜。金黄色葡萄球菌的金黄色葡萄球菌的扫描电镜照片扫描电镜照片 经经1824小时培养后形成圆形隆起、边小时培养后形成圆形隆起、边缘整齐、表面光滑、湿润、缘整齐、表面光滑、湿润、不透明不透明的菌落，直径的菌落，直径为为12mm
3、，不同菌株可产生不同色素，出现不同菌株可产生不同色素，出现金黄色、白色、柠檬色金黄色、白色、柠檬色。大肠杆菌在普通营养琼脂上的菌落特征：中大肠杆菌在普通营养琼脂上的菌落特征：中等大小、圆形、表面光滑、等大小、圆形、表面光滑、无色半透明无色半透明、边缘整、边缘整齐齐2 2、在普通营养琼脂平板上的菌落特征：、在普通营养琼脂平板上的菌落特征：金黄色葡萄球菌在普通营养琼脂平板上的菌落金黄色葡萄球菌在普通营养琼脂平板上的菌落3 3、具有高耐盐性，在、具有高耐盐性，在7.5%7.5%氯化钠肉汤中呈现浑浊生氯化钠肉汤中呈现浑浊生长；长；4 4、在在BPBP平板上菌落特征平板上菌落特征：圆形、光滑凸起，湿润，
4、：圆形、光滑凸起，湿润，直径为直径为2 23mm3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围有一浑浊带，外层有一透明圈；周围有一浑浊带，外层有一透明圈；5 5、在血平板上菌落特征在血平板上菌落特征：呈金黄色，有时也呈白色，：呈金黄色，有时也呈白色，大而凸起，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶大而凸起，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈；血圈；BPBP培养基上的菌落培养基上的菌落血平板上的菌落血平板上的菌落6、血浆凝固酶试验、血浆凝固酶试验 致病性菌株可以产致病性菌株可以产生血浆凝固酶，使血浆生血浆凝固酶，使血浆发生凝固。发生凝固。o原理：原理：鉴定食品中金黄色葡萄球
5、菌：根据以上性质逐步确鉴定食品中金黄色葡萄球菌：根据以上性质逐步确定。定。鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标：金黄：金黄色葡萄球菌能产生凝血浆酶，使血浆凝固；多数金色葡萄球菌能产生凝血浆酶，使血浆凝固；多数金黄色葡萄球菌致病菌株能产生溶血毒素，使血琼脂黄色葡萄球菌致病菌株能产生溶血毒素，使血琼脂平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。o实验材料：实验材料：1 1、样品：、样品：（1 1）含有大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的水）含有大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的水样样 （2 2）鲜奶）鲜奶2 2、培养基与试剂：、培养基与
6、试剂：7.5%7.5%氯化钠肉汤、血琼脂平板、氯化钠肉汤、血琼脂平板、Baird-ParkerBaird-Parker氏培养基、无菌水、革兰氏染色剂氏培养基、无菌水、革兰氏染色剂3 3、器具及其他用品：、器具及其他用品：显微镜、恒温培养箱、无菌吸显微镜、恒温培养箱、无菌吸管、无菌试管、无菌平皿、载玻片、涂布器、酒精管、无菌试管、无菌平皿、载玻片、涂布器、酒精灯、接种环等灯、接种环等流流程程1 1、增菌培养法、增菌培养法1.11.1检样处理：检样处理：无菌操作取样无菌操作取样25g25g（mLmL）加入）加入225mL225mL灭灭菌生理盐水，固体样品研磨或均质制成混悬液。菌生理盐水，固体样品研
7、磨或均质制成混悬液。1.21.2增菌及分离培养：增菌及分离培养：吸取吸取5mL5mL上述混悬液，接种于上述混悬液，接种于7.5%7.5%氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤50mL50mL培养基内，培养基内，361361培养培养24h24h，转种血平板和，转种血平板和BPBP平板，平板，361361培养培养24h24h，挑取血平板上金黄色（有时，挑取血平板上金黄色（有时为白色）菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶为白色）菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶实验。实验。1.3兔血浆凝固酶试验：兔血浆凝固酶试验：吸取吸取1 1：4 4新鲜兔血浆新鲜兔血浆0.5mL0.5mL，放入小试管
8、中，放入小试管中，再加入培养再加入培养24h24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物养物0.5mL0.5mL，振荡摇匀，置，振荡摇匀，置361361温箱或水浴温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察内，每半小时观察一次，观察6h6h，如呈现凝固，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果，同时与已知阳性和阴性葡萄球菌菌株及性结果，同时与已知阳性和阴性葡萄球菌菌株及肉汤作为对照。肉汤作为对照。2.1 2.1 梯度稀释转种梯度稀释转种BPBP平板平板 吸取上述吸取上述1 1：1010混悬液，进行混悬液，进行1010倍
9、第次稀释，倍第次稀释，根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液1mL1mL，分别加入三块，分别加入三块BPBP平板，每个平板接种量分别平板，每个平板接种量分别为为0.3mL0.3mL、0.3mL0.3mL、0.4mL0.4mL，然后用灭菌涂布器涂，然后用灭菌涂布器涂布整个平板，如水分多不易吸收，可将平板放布整个平板，如水分多不易吸收，可将平板放在在3611h3611h，等水分蒸发后反转平皿置，等水分蒸发后反转平皿置361361培养。培养。2、直接计数方法、直接计数方法2.2转种血平板转种血平板 在三个平板上寻找周围有浑浊带的黑在三个平板上寻找周围有浑浊带的黑
10、色菌落，并从中任选五个菌落，分别接种色菌落，并从中任选五个菌落，分别接种血平板，血平板，于于361361培养培养24h24h后进行染后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养方法。养方法。2.3 2.3 菌落计数菌落计数 将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数，色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数，除以除以5 5，再乘以稀释倍数，即可求出每克，再乘以稀释倍数，即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数。样品中金黄色葡萄球菌数。结果结果1.1.根据形态特征、血平板情况以及血浆凝固酶根据形态特征、血平板情况以
11、及血浆凝固酶试验，判别检样中是否含有金黄色葡萄球菌。试验，判别检样中是否含有金黄色葡萄球菌。2.2.估算检样中金黄色葡萄球菌的含量。估算检样中金黄色葡萄球菌的含量。GB 4789.10-2010第第一一法法金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌定定性性检检验验GB 4789.10-2010第二法第二法 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 Baird-Parker平板计数平板计数GB 4789.10-2010第第三三法法 金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌MPN计计数数三法特点及适用性：三法特点及适用性：o第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌的定第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验性检验o第二法适用于金黄色葡萄球菌
12、含量较高的第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数食品中金黄色葡萄球菌的计数o第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的杂菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。计数。实 验 安 排1 1、实验时间：、实验时间：2 2、分组：每、分组：每3 3人一组人一组3 3、评分标准：见附表、评分标准：见附表1 1考核要素考核要素评评分要素分要素评评分分细则细则菌的菌的鉴别鉴别10分分菌落形菌落形态态、色色泽观泽观察察对对菌的特征熟悉、菌的特征熟悉、识别识别正确（正确（10分）分）对对菌的特征菌的特征较较熟悉，基本能熟
13、悉，基本能识别识别（10分）分）不熟悉，不熟悉，识别识别不正确（不正确（5分以下）分以下）菌的菌的分离分离10分分接种操作接种操作5分分操作操作规规范、熟范、熟练练、能分离出、能分离出单单个菌落个菌落45分分基本基本规规范、熟范、熟练练，基本能分离出，基本能分离出单单个菌落个菌落24分分不熟不熟练练，分离差（，分离差（02分）分）分离效果分离效果5分分效果好，有效果好，有单单个菌落（个菌落（45分）分）能基本分离（能基本分离（24分）分）一般（一般（02分）分）染色染色操作操作20分分涂片操作涂片操作10分分熟熟练练、染色效果明、染色效果明显显（910分）分）较较熟熟练练，染色效果尚好（，染色效果尚好（68分）分）染色效果染色效果较较差（差（5分以下）分以下）显显微微镜镜的使的使用用10分分正确、熟正确、熟练练、视视野清晰（野清晰（910分）分）基本正确，基本正确，较较熟熟练练（68分）分）