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1、微生物发酵工程案例教学微生物发酵工程案例教学背景背景实验方法实验方法一、材料：一、材料：PCRPCR试剂、限制酶、小牛碱性磷酸酶、试剂、限制酶、小牛碱性磷酸酶、凝胶提取盒、尼龙膜等凝胶提取盒、尼龙膜等二、培养基和生长条件二、培养基和生长条件实验方法实验方法四种培养基四种培养基：发酵条件发酵条件：有氧环境、摇床有氧环境、摇床250rev/min30250rev/min30。LB培养基YPD培养基B培养基CM培养基实验方法实验方法用于这项研究的菌株、质粒和引物：实验方法实验方法DNA片段的PCR扩增分别构建包含yqhD基因的pZR1质粒和dahB基因的pZR2质粒分别构建包含yqhD基因的pZR1
2、质粒和dahB基因的pZR2质粒土壤农杆菌介导的转化啤酒酵母染色体上的yqhD和dhaB基因的PCR与印迹杂交分析气相色谱法测定1,3-丙二醇实验方法实验方法 分别构建包含yqhD基因的pZR1质粒和dahB基因的pZR2质粒；构建pZR3质粒；构建包含yqhD和dhaB基因的质粒pZR4实验方法实验方法土壤农杆菌介导的转化土壤农杆菌介导的转化在本研究通过农杆菌介导的转化方法将yqhD基因和dhaB基因整合到啤酒酵母的染色体上。第一步，质粒pZR4通过电穿孔转染到农杆菌LBA4404，形成LBA4404-ZR4.农杆菌LBA4404-ZR4在含有博来霉素的B培养基上培养过夜，收菌，在B培养基上
3、重悬培养（含或不含100umol/l乙酰丁香酮），生长到1x1011cell ml-1，再孵化培养6h。与此同时，啤酒酵母W303-1在摇床30下培养过夜，稀释20倍到新鲜的YPD培养基上，培养6h。细胞通过离心收集，用不含乙酰丁香酮的B培养基清洗，然后重悬，接种到相同培养基上，最后生长到1x109cells ml-1.随后，50ul啤酒酵母W303-1A和50ul农杆菌LBA4404-ZR4做好前期混合准备，储存在高压蒸汽过的胶膜纸上（直径25mm），上面有固体CM培养基，添加乙酰丁香酮，孵育在28，72h。然后，胶膜纸被移到固体YPD培养基（含150ug/ml博来霉素），孵育30，3-4d
4、ays。为了预防供体农杆菌过生长，在培养基中添加了200ug/ml头孢噻肟。啤酒酵母指定的W303-1A-ZR，在30，YEPD（含150ug/ml博来霉素）培养基中进一步纯化。实验方法实验方法 啤酒酵母染色体上的yqhD和dhaB基因的PCR与印迹杂交分析：实验方法实验方法酶试验酶试验细胞粗提物通过细胞糊状物声波破碎和离心获得，细胞粗提物含各种酶。丙三醇脱水酶活性通过使用3-甲基-2-苯并噻唑方法评估。由于3-羟基丙醛的不稳定性，1,3-丙二醇氧化还原同工酶活性通过逆反应（1,3-丙二醇转化到3-羟基丙醛）来断定。1,3-丙二醇同工酶的浓度通过Gerlind方法断定。所有酶试验在30度中进行
5、。一个酶活单位定义成：30度下，催化1umol底物到产物所需的酶数量。特殊的酶活力显示的单位/mg蛋白。所有酶试验重复两次，报道的数值是两次实验的均值。细胞提取物中的蛋白浓度是通过Bradford法断定的。实验方法实验方法气相色谱法测定气相色谱法测定1,3-1,3-丙二醇丙二醇：1,3-丙二醇和丙三醇是通过气相色谱法测定的。本研究使用的圆柱体是2m X 5mm不锈钢圆柱体，包装的色谱载体是101.氮气，流速40 ml min-1.检测温度定在220，圆柱体温度定在210。实验结果实验结果工程化啤酒酵母关键质粒的构建基因yqhD和dhaB整合到啤酒酵母的染色体工程化啤酒酵母W303-1A-ZR能够利用D-葡萄糖生产1,3-丙二醇实验结果实验结果工程化啤酒酵母 关键质粒的构建实验结果实验结果实验结果实验结果基因yqhD和dhaB整合到啤酒酵母的染色体：实验结果实验结果实验结果实验结果工程化啤酒酵母W303-1A-ZR能够利用D-葡萄糖生产1,3-丙二醇实验结果实验结果Thank you!