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1、周俊宜中山医科大学生化教研室 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望A AGGA AA AC CT TT TT TC CT TT TGGA AA AT TC CT TT TGGA AAA AGGA AA AC CT TT T 子代DNA 碱基互补碱基互补 按按半保留复制半保留复制的方式，子代保留了亲代的方式，子代保留了亲代 DNA DNA 的全部遗传信息。的全部遗传信息。亲代 DNAA AGGA AA AC CT TT TT TC CT TT TGGA A
2、A ADNA决定蛋白质的功能 将基因信息代代相传复制转录和翻译生命活动的执行者 生命延续的物质基础5 55 5端粒消耗端粒维持细胞衰老细胞永生化染色体DNA端粒端粒 七十年代：七十年代：端粒分子组成端粒分子组成确定确定 八十年代：八十年代：端粒酶端粒酶的发现的发现 九十年代：端粒酶与细胞九十年代：端粒酶与细胞衰老和癌症衰老和癌症 三十年代：三十年代：端粒端粒概念首次提出概念首次提出研究概况 “端粒和端粒酶的研究历程就象不断伸缩的端粒本身变幻无穷，并且不时带给人们某些惊讶。从三十年代端粒概念首次提出，一直到今天活跃在恶性细胞中的端粒酶研究热潮的兴起，人们眼中的端粒和端粒酶已不仅仅限于它们所形成的
3、染色体的保护帽，它还显现出更加意味深长的内涵”“人体的正常细胞经过有限的分裂次数后即进入衰老阶段，停止增殖而最终走向衰亡。呈恶性生长的癌细胞似乎摆脱了正常衰老过程的约束，在无拘无束地高速生长中获得“永生”。衰老和肿瘤相互对立却又同为人类的“天敌”，两者之间千丝万缕的关联一直以来为人们所关注。近年来端粒酶热点的出现被认为是联结着肿瘤和衰老研究的一条全新纽带，国际权威期刊Cell、Science等逐年递增地刊载相关论文和报道，对端粒和端粒酶这一研究方向予以相当关注，认为有可能对肿瘤、衰老等重大生命课题产生深远影响。”主要内容端粒的结构与功能端粒酶的结构与功能端粒、端粒酶与细胞衰老端粒、端粒酶与恶性
4、肿瘤 二十世纪三十年代，两位著名的遗传学家Barbava McClintock和Hermann J.Muller发现，染色体的末端有一种能稳定染色体结构和功能的特殊成分。如果缺少了这种成分，染色体之间就会互相粘连、出现结构的变化或其它错误的行为，以致影响到染色体的生存和正确复制并进一步威胁到细胞的存亡。于是Muller从希腊文的末端（telos）和部分（meros）二词为这种特殊的成分创造了一个全新的术语端粒（telomere）。1 1 端粒的发现端粒的发现断端降解、断端融合、结构功能破坏断端降解、断端融合、结构功能破坏染色体染色体染色体染色体DNADNADNADNAX X射线射线从希腊字的末
5、端“telos”和部分“meros”创造了一个全新的单词：端粒 telomeretelomere 端粒帽端粒帽 染色体 端粒帽端粒帽 端粒的精确组成则是在七十年代末才首次被提出。1978年，美国科学家Blackburn和Joseph G.Gall发现，单细胞池塘生物四膜虫（Tetrahymena）的端粒是由一种极短的简单重复序列TTGGGG多次重复而成。从那以后，包括动物、植物和微生物在内的多种生物的端粒序列已被确定，它们均是由富含G和T的简单重复序列不断重复而成。正是这些连接在染色体末端的核苷酸重复序列和结合在其上的一些蛋白质共同构成了真核生物染色体的“末端保护帽”。2 端粒的精确组成197
6、8年首次发现四膜虫端粒的分子组成：端粒端粒 染色体染色体DNA DNA 端粒端粒n n n n（CCCCAACCCCAACCCCAACCCCAA）n n n n（GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT）3 3 5 5（TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG）n n n n（AACCCCAACCCCAACCCCAACCCC）n n n nn n n n（CCCCCCCCCCCCT T T TAAAAAAAA）n n n n（GGGGGGGGGGGGA A A ATTTTTTTT）3 3 5 5（TTTTTTTTA A A AGGGGGGGGGGGG）n n n n（AAAAA
7、AAAT T T TCCCCCCCCCCCC）n n n n人端粒的分子组成：端粒末端回折结构端粒末端回折结构5533重复的重复的GGGGTTGGGGTT链链重复的重复的CCCCAACCCCAA链链5-5-CCCCAACCCCAAOHOHCCCAACCCCAACCCCAACCCAACCCCAACCCCAAOHOHCCCAA-3CCCAA-33-GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT-53-GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT-5端粒端粒 染色体染色体DNA DNA 端粒端粒1)GT链的5 3总是指向染色体的末端。2)重复次数不保守。3)链区内有缺口
8、即游离的3-端羟基存在。4)DNA的最末端不能进行末端标记，推测其分子是一个回折结构。端粒结构的特征：端粒结构的特征：n n n n（CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAA）n n n n（GGGATTGGGATTGGGATTGGGATT）3 3 3 3 5 5 5 5（TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG）n n n n（AATCCCAATCCCAATCCCAATCCC）n n n n35DNA聚合酶-32P-dNTP端粒DNA缺口平移缺口平移5-5-CCCCACCCCAA AOHOHC CCCAACCCCAACCCCACCAACCCCAACCCCAA AOHOHC C
9、CCAA-3CCAA-33-GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT-53-GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT-5DNA聚合酶5 3聚合酶5 3外切酶555-5-CCCCAACCCCCCCAACCC 3-GTTGGG 3-GTTGGG末端标记物-3232P-dNTPP-dNTP5-5-CCCCAACCCCCCCAACCC3-3-GGGGGGGTTGGGGTTGGG 端粒帽端粒帽 染色体染色体DNA DNA 端粒帽端粒帽n n n n（CCCCAACCCCAACCCCAACCCCAA）（TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG）n n n n
10、n n n n（GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT）（AACCCCAACCCCAACCCCAACCCC）n n n n3 3 5 5 3 3 端粒结合蛋白端粒结合蛋白保护端粒不受核酸酶或化学修饰的作用一般是紧密的非共价键结合人类纤毛虫类 随着对端粒分子组成结构的阐明，端粒对维护染色体完整性的功能已不是一个笼统的概念。活跃在细胞中枢并当担着延续生命重任的染色体DNA其实面临的是一个“危机四伏”的境界，它对外要抵御核酸酶等各种因素袭击，对内则有一个难以“自圆其身”的所谓“末端复制问题”。端粒的存在正是扮演了一个卫士的角色，它就象是一个尽忠职守的“生命卫士”，不但避免了外界因素的入侵，
11、而且在复制过程中，把基因组序列包裹在内部，以牺牲自身而避免染色体结构基因被侵蚀，从而防止了遗传信息的丢失，维护了染色体结构和功能的完整性。4 端粒的功能 对外:抵御核酸酶等外界 对内:染色体DNA的 因素的袭击 末端复制问题保护染色体结构和功能的完整性染色体染色体染色体DNADNA的末端复制问题的末端复制问题：3 3 3 3 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 RNARNARNARNA引物引物引物引物 3 3 3 3 3 3 3 3 RNARNA引物水解引物水解 即DNA复制过程不能自始至终完整地复制整个线性染色体，而是每次都在其5末端留下一个空缺未能填补（即RNA引物降解），如果
12、细胞没有办法添补这些空隙，染色体DNA将随着每一次的细胞分裂而不断缩短，直至这种缺隙侵蚀到染色体的结构基因而使细胞消亡。33555533RNARNA引物水解引物水解端粒 染色体DNA 端粒1)1)纤毛原虫动物纤毛原虫动物四膜虫：其巨核形成过程中，经历了端粒从无到有的发育过程。2)2)酵母酵母外源DNA转化酵母细胞后，在其末端形成新端粒的效率很高。5 5 端粒的研究体系端粒的研究体系1）早期的原始复制模型2）端粒酶模型3）重组模型6 6 端粒的复制模型端粒的复制模型酵母细胞 酵母细胞酵母酵母TSTS四膜虫四膜虫TSTSShampay的加尾实验1 端粒酶的发现 Blackburn的实验的实验加热或
13、加热或蛋白酶蛋白酶孵育孵育四四GTGT酵酵GTGTpBR322pBR322四四CACA孵育孵育四膜虫抽提物四膜虫抽提物553 31）端粒的加尾方向是按GT链从5端 3端。2）每次加一个重复单位。3）似为无模板复制。4）被加尾的末端序列具有特异性。5）催化加尾的应是细胞抽提物中一种具有酶活性的物质。实验推论：2 端粒酶的结构1987年，Blackburn 柱层析 RNP结构四膜虫端粒酶RNP含有RNA组分和蛋白质组分，两者均为酶活性所必需。对RNA酶极为敏感。RNARNA组分组分ProteinProteinProteinProtein CAACCCCAA CAACCCCAACAACCCCAACA
14、ACCCCAA端粒酶RNA1）CAACCCCAA结构，有碱基修饰。2）反义RNA封闭，能抑制酶活性。反义反义RNARNA3 3）GreiderGreider的点突变实验：的点突变实验：点突变点突变端粒酶端粒酶RNARNA序列序列CA端粒端粒酶端粒酶A A CT T GCGC ATCAA端粒酶蛋白质 1995年，Collins K等首次从四膜虫克隆到端粒酶蛋白质组分：p80p80p95p95p95p95遗传密码遗传密码碱基互补碱基互补人类端粒酶蛋白质？同源序列核酸探针核酸探针重组重组DNADNA分子分子TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG55TTGGGGTTG
15、GGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGCCAACCCCCCAACCCC 35oH35 5 CCAACCCCCCAACCCC35TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGCCAACCCCCCAACCCC2.2.聚合聚合 1.1.结合结合3.3.移位移位 爬行模式3 3 端粒酶的功能端粒酶的功能TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGCCAACCCCCCAACCCC末端补齐机制：末端补齐机制：5GGGGTTGGGGTT（GGGGTTGGGGTT）n n端粒酶端粒酶端粒酶端粒酶5G-G配对回折35DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶4 4 端粒酶
16、活性的测定端粒酶活性的测定1994年，Kim首创端粒重复扩增法（TRAPTRAP）。TRAP的电泳检测梯梯形形条条带带加样孔TSTS引物引物引物引物CXCX引物引物引物引物细胞提取物细胞提取物端粒重复序列端粒重复序列PCRPCR扩增扩增产物产物 T4g32,RnasinT4g32,RnasinTRAP bufferTRAP bufferdNTPsdNTPsextractextractTS primerTS primerTaq ETaq ECX primerCX primerCX primerCX primer2325 30 minPCR仪染色体染色体端粒端粒端粒与细胞存亡密切相关细胞分裂细胞分
17、裂细胞分裂细胞分裂端粒长短与细胞生命历程密切相关染色体染色体端粒端粒细胞将停止分裂而趋于老化1）培养细胞：端粒长度随分裂次数增多而缩短。端粒长度和细胞分化程度呈反比。2）人体：端粒平均长度随年龄增大而变短。体细胞端粒长度大大短于生殖细胞。相关实验证据端粒酶与细胞存亡端粒酶端粒 端粒酶催化端粒不断延长，从而抵消因染色体复制、细胞分裂导致的DNA缩短，使得染色体DNA完好无损，细胞能够顺利地分裂繁殖。相关实验证据：1）四膜虫：端粒酶改变时端粒缩短、细胞死亡。2）酵母：端粒酶基因突变导致端粒变短、细胞衰老。正常人体细胞缺乏端粒酶活性。与其他有端粒酶活性的生物体细胞相比,人体细胞具有很长的端粒。人的胚
18、胎细胞具有明显可探测的端粒酶活性。人的端粒与端粒酶端粒 染色体DNA 端粒端粒酶端粒酶胚胚胎胎期期 “人体细胞中端粒酶合成和延长端粒的作用是在胚系细胞中完成的，当胚胎发育完成以后，端粒酶活性就被抑制。即在胚胎发育时期获得的端粒，应已足够维系人体的整个生命过程中因细胞分裂所致的端粒缩短。所以，当人体出生以后，染色体端粒就象是一个伴随着细胞分裂繁殖的“生命之钟”，它历数着细胞可分裂的次数同时也见证了细胞由旺盛地生长繁殖到走向衰老死亡的整个生命历程。”正常细胞：正常细胞：细胞分裂细胞分裂细胞分裂细胞分裂 衰衰衰衰老老老老死死死死亡亡亡亡 细胞年轻化细胞年轻化细胞年轻化细胞年轻化 端粒酶端粒酶端粒酶端
19、粒酶 重新引入重新引入重新引入重新引入抗衰老细胞分裂细胞分裂细胞分裂细胞分裂细细胞胞衰衰老老端粒酶永永生生化化抗肿瘤靶抗肿瘤靶点点 1 端粒酶活性特异表达于恶性细胞TRAPTRAP（-）TRAP TRAP（-）正常细胞正常细胞 良性肿瘤良性肿瘤 恶性肿瘤恶性肿瘤1994年，Kim 创立“TRAP”法检测端粒酶活性。2 端粒酶特异性表达于恶性细胞的成因解释性研究：衰老死亡诱导蛋白端粒极度缩短，细胞死亡细胞永生化P53基因、基因、Rb基因基因介导细胞衰老P53基因、基因、Rb基因突变基因突变细胞继续分裂至“危象期”大量细胞死亡 少量细胞“永生化”（端粒酶活化端粒酶活化）（端粒缩短）（端粒缩短）3 端粒酶抑制剂-抗癌治疗的新靶点1）端粒酶靶点的优势A 特异性：B 广谱性：存在于各类恶性肿瘤细胞中 85%85%以上的恶性细胞中以上的恶性细胞中TRAPTRAP（+）正正常常细细胞胞癌癌细细胞胞2）抗癌策略反义核酸突变RNA的引入端粒酶蛋白抑制剂端粒酶生物学抑制剂A 针对人端粒酶RNA组分反反义义核核酸酸核核酶酶突变突变RNARNA的的引入引入B 针对端粒酶蛋白质 HTERT TP1同源序列分析同源序列分析同源序列分析同源序列分析P230-240P230-240p12713001300KuKu