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1、常用分子标记技术原理及常用分子标记技术原理及应用应用知识框架知识框架生化标记分子标记细胞学标记形态学标记遗传遗传标记标记RFLPRAPDAFLPSSRISSRSNP常见分子标记主要内容：一、分子标记的相关概念及分类 二、几种常见分子标记的原理及方法 三、分子标记技术的应用分子标记技术分子标记分子标记来源于来源于DNADNA水平的突变水平的突变l l突变突变突变突变(Mutation)(Mutation)(Mutation)(Mutation)：是指是指是指是指DNADNADNADNA水平的水平的水平的水平的可遗传的变异，可遗传的变异，可遗传的变异，可遗传的变异，不管这种不管这种不管这种不管这种
2、DNADNADNADNA变异能不能导致可检测的表型或生化变异能不能导致可检测的表型或生化变异能不能导致可检测的表型或生化变异能不能导致可检测的表型或生化改变。突变产生的变异是自然选择的基础。改变。突变产生的变异是自然选择的基础。改变。突变产生的变异是自然选择的基础。改变。突变产生的变异是自然选择的基础。可遗可遗可遗可遗传的突变在群体中扩散从而产生多态性。传的突变在群体中扩散从而产生多态性。传的突变在群体中扩散从而产生多态性。传的突变在群体中扩散从而产生多态性。l l多态性多态性多态性多态性(Polymorphism)(Polymorphism)(Polymorphism)(Polymorphi
3、sm)：群体内群体内群体内群体内同一同一同一同一DNADNADNADNA序列序列序列序列的的的的两种或两种或两种或两种或多种变异形式多种变异形式多种变异形式多种变异形式，统计表明：群体内任何两，统计表明：群体内任何两，统计表明：群体内任何两，统计表明：群体内任何两个生物个体平均每个生物个体平均每个生物个体平均每个生物个体平均每100010001000100010000100001000010000个碱基对有一对有个碱基对有一对有个碱基对有一对有个碱基对有一对有差别，这种差别就是多态性。差别，这种差别就是多态性。差别，这种差别就是多态性。差别，这种差别就是多态性。l l 1.1.1.1.广义的分
4、子标记广义的分子标记广义的分子标记广义的分子标记(molecular marker)(molecular marker)(molecular marker)(molecular marker)是指可遗传的是指可遗传的是指可遗传的是指可遗传的并可检测的并可检测的并可检测的并可检测的DNADNADNADNA序列或蛋白质。序列或蛋白质。序列或蛋白质。序列或蛋白质。l leg:eg:eg:eg:蛋白质标记如种子贮藏蛋白同工酶（指由一个以上基蛋白质标记如种子贮藏蛋白同工酶（指由一个以上基蛋白质标记如种子贮藏蛋白同工酶（指由一个以上基蛋白质标记如种子贮藏蛋白同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形
5、式）因位点编码的酶的不同分子形式）因位点编码的酶的不同分子形式）因位点编码的酶的不同分子形式）2.2.2.2.狭义的分子标记狭义的分子标记狭义的分子标记狭义的分子标记（DNA marker)DNA marker)DNA marker)DNA marker)概念只是指概念只是指概念只是指概念只是指DNADNADNADNA标记标记标记标记l l 能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNADNADNADNA片段，它直接反映基因组片段，它直接反映基因组片段，它直接
6、反映基因组片段，它直接反映基因组DNADNADNADNA间的差异。间的差异。间的差异。间的差异。一一.分子标记相关概念分子标记相关概念 分分分分子子子子标标标标记记记记的的的的概概概概念念念念：是是是是以以以以直直直直接接接接检检检检测测测测DNADNADNADNA核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸序序序序列列列列的的的的差差差差异为基础的遗传标记，又叫异为基础的遗传标记，又叫异为基础的遗传标记，又叫异为基础的遗传标记，又叫DNADNADNADNA分子标记。分子标记。分子标记。分子标记。分子标记（分子标记（DNA DNA markermarker）分子标记的特点：分子标记的特点：(相对形态，细胞，生化标
7、记具有的优点相对形态，细胞，生化标记具有的优点)（1 1）直直接接以以DNADNA的的形形式式表表现现，在在生生物物体体的的各各个个组组织织、各各个个发发育育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题；阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题；（2 2）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限；）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限；（3 3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造；）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造；（4 4）表现为中性，不影响目标性状的表达；）表现为中性，不影响目标性状的表达；（5 5）许多标记表现为共显性的特
8、点，能区别纯合体和杂合体。）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。在遗传学研究中广泛应用的在遗传学研究中广泛应用的在遗传学研究中广泛应用的在遗传学研究中广泛应用的DNADNADNADNA分子标记已经发展了很分子标记已经发展了很分子标记已经发展了很分子标记已经发展了很多种，一般依其所用的分子生物学技术大致可以分为多种，一般依其所用的分子生物学技术大致可以分为多种，一般依其所用的分子生物学技术大致可以分为多种，一般依其所用的分子生物学技术大致可以分为三大类：三大类：三大类：三大类：第一类：第一类：是是以分子杂交为核心以分子杂交为核心的分子标记，包括的分子标记，包括RFLPRFLP、DN
9、ADNA指纹技术等，这类分子标记被称为指纹技术等，这类分子标记被称为第一代分子标记；第一代分子标记；第二类：第二类：是是以以PCRPCR为核心为核心的分子标记，包括随机扩增多态性的分子标记，包括随机扩增多态性RAPDRAPD、简单序列重复、简单序列重复SSRSSR、扩增片段长度多态性、扩增片段长度多态性AFLPAFLP、序列、序列标签位点标签位点STSSTS等，为等，为第二代分子标记；第二代分子标记；第三类：第三类：是一些是一些新型的分子标记新型的分子标记，如：，如：SNPSNP标记、表达序列标记、表达序列标签标签ESTEST标记等，也以标记等，也以PCRPCR技术为基础，为技术为基础，为第三
10、代分子标记第三代分子标记。分子标记的分类英文缩写英文缩写英文缩写英文缩写英文名称英文名称英文名称英文名称中文名称中文名称中文名称中文名称RFLPRFLPRestriction fragment Iength Restriction fragment Iength polymorphismpolymorphism限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性STSSTSSequence tagged siteSequence tagged site序列标签位点序列标签位点序列标签位点序列标签位点RAPDRAPDRandom amplified polymor-R
11、andom amplified polymor-phic DNAphic DNA随机扩增多态性随机扩增多态性随机扩增多态性随机扩增多态性DNADNAAFLPAFLPAmplified frangment lengthAmplified frangment lengthPolymorphismPolymorphism扩增片断长度多态性扩增片断长度多态性扩增片断长度多态性扩增片断长度多态性SSRSSRSimple sequence repeatSimple sequence repeat简单序列重复简单序列重复简单序列重复简单序列重复SNPSNPSimple mucleotide polymor-
12、Simple mucleotide polymor-phismphism单核苷酸多态性单核苷酸多态性单核苷酸多态性单核苷酸多态性几种主要的分子标记几种主要的分子标记1.RFLP1.RFLP2.RAPD2.RAPD3.AFLP3.AFLP ()4.SSR4.SSR5.ISSR5.ISSR ()6.SNP6.SNP二、几种常见分子标记的原理及方法二、几种常见分子标记的原理及方法 AFLPAFLP扩增片段长度多态性标记扩增片段长度多态性标记(Amplified Fragment Length PolymorphismAmplified Fragment Length Polymorphism)起源：
13、起源：起源：起源：19921992年由荷兰科学家年由荷兰科学家年由荷兰科学家年由荷兰科学家ZabeauZabeau和和和和VosVos发展起来的一种检发展起来的一种检发展起来的一种检发展起来的一种检测测测测DNADNA多态性的新方法。多态性的新方法。多态性的新方法。多态性的新方法。定义定义定义定义:由于单核甘酸突变或插入及缺失突变导致增加或减少限由于单核甘酸突变或插入及缺失突变导致增加或减少限由于单核甘酸突变或插入及缺失突变导致增加或减少限由于单核甘酸突变或插入及缺失突变导致增加或减少限制性酶切位点，这种差异可通过选择性的制性酶切位点，这种差异可通过选择性的制性酶切位点，这种差异可通过选择性的
14、制性酶切位点，这种差异可通过选择性的PCRPCR扩增而检测。扩增而检测。扩增而检测。扩增而检测。AFLPAFLP是在是在是在是在RFLPRFLP的基础上发展起来的，差别在于检测手段。的基础上发展起来的，差别在于检测手段。的基础上发展起来的，差别在于检测手段。的基础上发展起来的，差别在于检测手段。核心技术：核心技术：核心技术：核心技术：AFLPAFLP的关键是设计选择性扩增引物以及不同引物的关键是设计选择性扩增引物以及不同引物的关键是设计选择性扩增引物以及不同引物的关键是设计选择性扩增引物以及不同引物组合。组合。组合。组合。AFLPAFLP的原理的原理Principle of AFLPPrinc
15、iple of AFLPl l基本原理：基本原理：基本原理：基本原理：对基因组对基因组对基因组对基因组DNADNADNADNA用两种限制性内切酶用两种限制性内切酶用两种限制性内切酶用两种限制性内切酶进行消化，连上相应的双链人工接头，根据接进行消化，连上相应的双链人工接头，根据接进行消化，连上相应的双链人工接头，根据接进行消化，连上相应的双链人工接头，根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物，并在头的核苷酸序列和酶切位点设计引物，并在头的核苷酸序列和酶切位点设计引物，并在头的核苷酸序列和酶切位点设计引物，并在3333端添加端添加端添加端添加1-21-21-21-2个随机碱基对酶切连接后的个随机碱基
16、对酶切连接后的个随机碱基对酶切连接后的个随机碱基对酶切连接后的DNADNADNADNA进行进行进行进行选择性扩增。此后再进行第二次选择性扩增。此后再进行第二次选择性扩增。此后再进行第二次选择性扩增。此后再进行第二次PCRPCRPCRPCR扩增，所用扩增，所用扩增，所用扩增，所用的引物是在第一次的引物是在第一次的引物是在第一次的引物是在第一次PCRPCRPCRPCR中使用的选择中使用的选择中使用的选择中使用的选择性性性性引物的引物的引物的引物的3333端又附加了端又附加了端又附加了端又附加了1-31-31-31-3个随机碱基。扩增产物用聚个随机碱基。扩增产物用聚个随机碱基。扩增产物用聚个随机碱基
17、。扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶检测，银染显色。丙烯酰胺凝胶检测，银染显色。丙烯酰胺凝胶检测，银染显色。丙烯酰胺凝胶检测，银染显色。l l多态性源自限制性酶切位点的变异。多态性源自限制性酶切位点的变异。多态性源自限制性酶切位点的变异。多态性源自限制性酶切位点的变异。AFLPAFLP的实验操作的实验操作Procedures for AFLPProcedures for AFLPl lAFLPAFLPAFLPAFLP技术技术技术技术主要包括模板主要包括模板主要包括模板主要包括模板DNADNADNADNA制备、引物设计、酶切制备、引物设计、酶切制备、引物设计、酶切制备、引物设计、酶切片段扩增及凝胶电泳分析
18、片段扩增及凝胶电泳分析片段扩增及凝胶电泳分析片段扩增及凝胶电泳分析4 4 4 4个步骤。个步骤。个步骤。个步骤。各步骤具体的各步骤具体的各步骤具体的各步骤具体的过程有：过程有：过程有：过程有：1.1.1.1.DNADNADNADNA模板酶切和接头连接（模板酶切和接头连接（模板酶切和接头连接（模板酶切和接头连接（EcoRI/MseIEcoRI/MseIEcoRI/MseIEcoRI/MseI）2.2.2.2.在在在在TaqTaqTaqTaq聚合酶的作用下，完成聚合酶的作用下，完成聚合酶的作用下，完成聚合酶的作用下，完成AFLPAFLPAFLPAFLP的选择性扩增。的选择性扩增。的选择性扩增。的选
19、择性扩增。3.3.3.3.PCRPCRPCRPCR产物变性后在含尿素的聚丙烯酰胺变性胶上产物变性后在含尿素的聚丙烯酰胺变性胶上产物变性后在含尿素的聚丙烯酰胺变性胶上产物变性后在含尿素的聚丙烯酰胺变性胶上电泳电泳电泳电泳。4.4.4.4.多态性比较分析，特异片段回收克隆分析。多态性比较分析，特异片段回收克隆分析。多态性比较分析，特异片段回收克隆分析。多态性比较分析，特异片段回收克隆分析。基基基基本本本本步步步步骤骤骤骤AFLPAFLPDNADNA提取提取提取提取两种限制性内切酶酶切两种限制性内切酶酶切两种限制性内切酶酶切两种限制性内切酶酶切DNADNA寡聚核苷酸接头的连接寡聚核苷酸接头的连接寡聚
20、核苷酸接头的连接寡聚核苷酸接头的连接对限制性酶切片段的选择性扩增对限制性酶切片段的选择性扩增对限制性酶切片段的选择性扩增对限制性酶切片段的选择性扩增扩增产物的电泳分析扩增产物的电泳分析扩增产物的电泳分析扩增产物的电泳分析AFLP技术路线l l1.1.基因组基因组基因组基因组DNADNA被酶切成小片段：被酶切成小片段：被酶切成小片段：被酶切成小片段：通常用一个四个通常用一个四个碱基识别位点的限制性内切酶如碱基识别位点的限制性内切酶如MseIMseI和一个六个和一个六个碱基识别位点的酶如碱基识别位点的酶如EcoRIEcoRI，其中，其中MseIMseI确保产生确保产生合适大小的合适大小的DNADN
21、A片段，这些片段能在序列胶上进片段，这些片段能在序列胶上进行有效的分离；而六碱基识别位点酶行有效的分离；而六碱基识别位点酶EcoRIEcoRI能够能够限制扩增片段数目，确保限制扩增片段数目，确保DNADNA多态性的正常检测；多态性的正常检测；l l2.2.接头与酶切片段的连接：接头与酶切片段的连接：接头与酶切片段的连接：接头与酶切片段的连接：接头序列包括：一个接头序列包括：一个核心序列和酶切位点特异序列，核心序列和酶切位点特异序列，MSEMSE接头和接头和ECORIECORI接头，核心序列是一段已知的接头，核心序列是一段已知的2020核甘酸的核甘酸的DNADNA序列；序列；l l3.3.预扩增
22、：预扩增：预扩增：预扩增：应用一对引物对酶切片段进行第一轮应用一对引物对酶切片段进行第一轮扩增，目的是富聚目标片段，减少本底，扩增引扩增，目的是富聚目标片段，减少本底，扩增引物序列为接头序列加一个选择核甘酸。只有一端物序列为接头序列加一个选择核甘酸。只有一端为为EcoRIEcoRI切点，一端为切点，一端为MseIMseI切点的切点的DNADNA酶切片段，酶切片段，同时也与选择核甘酸配对的同时也与选择核甘酸配对的DNADNA序列才能被扩增。序列才能被扩增。1 13 3步的产物可以通过步的产物可以通过AgaroseAgarose胶检测。胶检测。l l4.4.选择扩增：选择扩增：选择扩增：选择扩增：
23、应用含有接头序列和三个选择核甘应用含有接头序列和三个选择核甘酸序列的引物进行选择扩增。通过这一轮扩增，酸序列的引物进行选择扩增。通过这一轮扩增，进一步降低扩增片段数量，同时一个引物被同位进一步降低扩增片段数量，同时一个引物被同位素或荧光染料标记（也可用银染），电泳后压片素或荧光染料标记（也可用银染），电泳后压片检测。检测。AFLPAFLP的原理的原理 Principle of AFLPPrinciple of AFLPPrinciple of AFLPPrinciple of AFLPDNADNA提取提取提取提取两种限制性内切酶酶切两种限制性内切酶酶切两种限制性内切酶酶切两种限制性内切酶酶切D
24、NADNA寡聚核苷酸接头的连接寡聚核苷酸接头的连接寡聚核苷酸接头的连接寡聚核苷酸接头的连接对限制性酶切片段的选择性扩增对限制性酶切片段的选择性扩增对限制性酶切片段的选择性扩增对限制性酶切片段的选择性扩增扩增产物的电泳分析扩增产物的电泳分析扩增产物的电泳分析扩增产物的电泳分析 AFLP 结合了 RFLP 和 RAPD两种技术的优点1 1、具有分辨率高、具有分辨率高2 2、稳定性好、稳定性好3 3、效率高的优点、效率高的优点AFLPAFLP特点特点1 1、试验成本高、试验成本高2 2、对、对 DNA DNA 的纯度和内切酶的质量要求很高的纯度和内切酶的质量要求很高缺点：优点：优点：S Simple
25、 imple S Sequence equence R Repeat epeat 基本原理基本原理：微卫星DNA是一种广泛分布于真核生物基因组中的串状简单重复序列，每个重复单元的长度在110bp之间，常见的微卫星如TGTGTG=(TG)n或AATAATAAT=(AAT)n等，不同数目的核心序列呈串联重复排列，而呈现出长度多态性。在基因组中，因每个SSR序列的基本单元重复次数在不同基因型间差异很大，从而形成其座位的多态性。而且每个SSR座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列，据此可设计引物，其关键是首先要了解SSR座位的侧翼序列(Flanking Region)，寻找其中的特异保守区。SSRSSR分
26、分分分子子子子基基基基础础础础SSRSSR基基基基本本本本步步步步骤骤骤骤SSRSSRDNADNA酶切酶切酶切酶切收集酶切片段连接载体收集酶切片段连接载体收集酶切片段连接载体收集酶切片段连接载体合成末端标记的合成末端标记的合成末端标记的合成末端标记的SSRSSR探针探针探针探针筛选含筛选含筛选含筛选含SSRSSR的阳性克隆用于测序的阳性克隆用于测序的阳性克隆用于测序的阳性克隆用于测序根据测序结果设计引物进行根据测序结果设计引物进行根据测序结果设计引物进行根据测序结果设计引物进行PCRPCR扩增扩增扩增扩增SSRSSR优点优点:数量丰富，广泛分布于整个基因 共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子 实
27、验重复性好，结果可靠 所需DNA量少，对DNA质量要求不高缺点：缺点：由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，对于许多物种需构建文库，因此其开发有一定困难，费用也较高。SSRSSRI Inter nter S Simple imple S Sequence equence R Repeat epeat by Zietkiewicz et al.(1994)基本原理基本原理：在SSR的5或 3端加锚 l4个嘌呤或嘧啶碱基，然后以此为引物，对两侧具有反向排列SSR的一段基因组DNA序列进行扩增。在SSR的3端或5端锚定1-4个简并碱基的优点是在基因组上只有那些与锚定的核苷酸匹配的位点才能被靶定，因而避免了SSR在基因组上的滑动大大提高了PCR扩增的专一性。ISSRISSR分分分分子子子子基基基基础础础础ISSRISSR银杏银杏5个群体个群体66个个体进行扩增的个个体进行扩增的13种有效种有效ISSR引物的特点引物的特点 ISSRISSR图图引物引物UBC845扩增群体扩增群体15棵植株基因组棵植株基因组DNA的的ISSR电泳图电泳图 ISSRISSR