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1、微生物第八章微生物第八章 428.4.1 基因重组l两个DNA分子之间发生分子水平上的重新组合，产生具有不同核苷酸序列的新的DNA分子，这一过程叫做基因重组；位点专一性重组同源重组转座重组不正常重组3456789 转化和转化子的形成l感受态细胞吸收的外源DNA，如果与自身染色体具有同源性，就有一定的几率发生同源重组，产生杂合的DNA区域；l当DNA复制时，产生纯合的新型子代DNA；细胞分裂时，新型子代DNA进入子细胞，形成的具有新的基因型的转化子；10转染（transfection）和广义的转化l用提纯的噬菌体DNA，通过转化的方式转入宿主细胞，结果产生完整的子代病毒颗粒，称为转染；l广义的转
2、化：将游离DNA片段或质粒转入受体细胞的技术手段，是基因工程的基本方法之一：人工感受态转化原生质体转化电转化：击穿细胞壁和细胞膜118.4.3 细菌的转导l转导（transduction）：通过转导噬菌体，借助噬菌体的感染能力，将外源DNA导入受体细胞，而发生基因重组的方式；l转导噬菌体：噬菌体衣壳内全部为外源DNA的完全缺陷型噬菌体，或者衣壳内带有部分外源DNA的部分缺陷型噬菌体；12完全缺陷型噬菌体的形成l子代噬菌体在宿主细胞内装配时，因“误切”和“误包”而将宿主的DNA片段装进噬菌体衣壳，形成只含宿主DNA片段的完全缺陷型噬菌体；l完全缺陷型噬菌体既可以由烈性噬菌体形成，也可由温和性噬菌
3、体形成，自然形成几率约10-610-8；13部分缺陷型噬菌体的形成l整合在溶源化细胞染色体上的原噬菌体，去整合化时可能发生“误切”，自身部分DNA与旁侧的染色体发生了交换而切割下来，形成部分缺陷的噬菌体核酸；l部分缺陷的噬菌体核酸仍然能够正常复制和基因表达，并装配、裂解宿主细胞，产生部分缺陷型的子代噬菌体；几率低于10-6；14完全普遍性转导l完全缺陷型噬菌体感染另外的宿主细胞，而将来自供体菌的一段外源DNA转入受体菌；l如果外源DNA与宿主染色体发生了基因重组，则形成具有新基因型的重组子，叫做转导子（transductant），这种基因重组形成重组子的方式，称为完全转导；l由于完全缺陷型噬菌
4、体能将供体菌的任何一段DNA转入受体菌，由此而发生基因重组，形成重组子的方式，也称完全普遍性转导；15普遍性转导的其它结果l如果由完全缺陷型噬菌体转入的供体菌DNA片段，没有发生基因重组，而被受体菌降解，则称为为转导失败；l如果转入的DNA片段不能与宿主染色体发生基因重组，也没有被降解，而是存在于受体菌中，称为流产转导；16局限性转导l由部分缺陷型噬菌体感染受体菌，将来自供体菌染色体特定位点的核酸片段转入受体菌，如果发生基因重组，则形成具有新的基因型的转导子；l由于部分缺陷型噬菌体只能将供体菌特定的染色体片段（原噬菌体整合位点的旁侧基因）转入受体菌，因此，这种转导称为局限性转导；E.coli
5、l噬菌体介导的局限性转导17低频转导l在溶源菌的诱发裂解物中，部分缺陷型噬菌体的含量极低（低于10-9），称为低频转导裂解物；l用这种低频转导裂解物，在低感染复数下进行转导，只能得到极少量的转导子，称为低频转导；l感染复数（m.o.i）：用噬菌体感染宿主时，所用噬菌体的数量与宿主细胞数量的比值；18高频转导l用高感染复数的低频转导裂解物感染受体菌，可能分离出既被正常噬菌体感染，同时又被部分缺陷型噬菌体感染的双重溶源化细胞；l诱发裂解双重溶源化细胞，正常噬菌体与部分缺陷型噬菌体同样增殖，形成部分缺陷噬菌体含量占50的高频转导裂解物；l用高频转导裂解物感染受体菌，能够高频率的得到转导子，为高频转导
6、；198.4.4 细菌的接合l“雄性”（F+）菌株：指带有转移质粒（F质粒）的 大肠杆菌菌株，长有几根性菌毛；l“雌性”（F-）菌株：不带转移质粒，没有性菌毛的大肠杆菌株；l接合（conjugation）：F+与F-菌株通过中空的性菌毛连接，并将F质粒的拷贝转移给F-菌株，使F-也变成F+菌株的生理过程；20Hfr菌株与F-菌株的接合lHfr与F-接合后，整合的F质粒从oriT位点断开，一条单链通过性菌毛开始向F转移；同时环状单链为模板，进行滚环复制；l位于 oriT位点后的宿主染色体最先跟随oriT向F-转移；lF质粒整合到宿主染色体上的菌株，称为高频重组（Hfr）菌株，其表型与F完全一致；
7、21中断杂交l在自然条件下，DNA转移过程受环境因素干扰，随时可能终止，完整的转移需要100分钟，常出现不同转移时间的中断杂交；l中断杂交使Hfr菌株的部分染色体转移到F中；22接合子的产生lHfr菌株与F-菌株接合能够高频率的将供体菌的部分DNA转移到受体菌中；l同时，供体DNA与受体菌DNA之间同源性很高，能够高频率的发生基因重组，产生具有新基因型的接合子；23 F质粒的性导lF质粒从染色体上切离时，可能发生“误切”，形成带有一段宿主DNA的质粒，叫做初生F质粒；l初生F菌株仍具有F+菌株的所有表型，与F接合后，初生F质粒转移到F-菌株中，形成带有次生F 质粒的F 菌株；l次生 F质粒带有
8、的供体菌DNA，如果与受体菌染色体发生基因重组，则产生重组子，这种基因重组方式称为F质粒转导，或性导；第五节 菌种的衰退、复壮和保藏25菌种的衰退与复壮l菌种的衰退：对于产量突变型而言，由于自发突变，以及培养条件的选择作用，使得回复突变株逐渐积累，当达到一定数量时，菌种的产量性状开始下降；l菌种的复壮：从已出现衰退的细胞群体中，把未发生回复突变的原种分离出来，恢复原种的典型性状；l防止衰退的措施：采用使细胞彻底休眠的长期菌种保藏方法，减少自发突变几率；短期保藏的菌种，在使用中要尽量减少传代次数，并定期进行纯种分离；26 菌种的保藏l菌种保藏目的：使微生物菌种短期或长期存活，不因衰老而死亡、不因
9、突变而变异、不因染菌而混杂；l菌种保藏的原理：在不损伤细胞的前提下，使细胞或孢子因缺乏一种或多种必要的生长（萌发）条件而处于缓慢代谢的半休眠或彻底休眠的状态：缺乏或无营养、低温（低于最低生长温度）、超低温、隔绝空气（无氧）、干燥（水活度远低于生长要求）；27 超低温条件对细胞的损伤及保护l低于0时，水结冰产生冰晶，会刺破细胞膜；当温度回升而解冻时，细胞死亡；l使用低于0的条件保藏菌种时，需使用保护剂防止冰晶的生成，及保护细胞膜；l常用保护剂：甘油、二甲亚砜、脱脂牛奶、海藻糖、血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮等；28菌种短期保藏法l低温保藏法：健壮的平板或斜面培养物，置于04 冰箱内，可保藏约3个月左
10、右；因细胞没有彻底休眠，及水分逐渐蒸发而影响保藏期；l石蜡油封低温保藏法：在斜面培养物的试管中加入惰性的灭菌石蜡油，防止水分蒸发，置于04 冰箱内，可有限延长保藏时间；l适用于大多数嗜中温微生物和嗜热微生物的保藏；29菌种长期保藏法l超低温保藏法：用于营养细胞保藏；细胞悬液加保护剂，置-70 -80（超低温冰箱）或-196（液氮罐）保藏数年；l冷冻真空干燥保藏法：用于营养细胞保藏；细胞悬液加保护剂，速冻，真空干燥脱水，细胞干粉密封在安瓿管，于4 -20（普通冰箱）保藏数年；l沙土管干燥保藏法：用于孢子保藏；孢子悬液与细砂土颗粒混合，充分干燥后密封于安瓿管，保藏数年；30国际著名微生物菌种保藏机构lATCC：美国典型培养物保藏中心lNRRL：美国农业部北方地区研究实验室lNCTC：英国国家典型培养物保藏所lCBS：荷兰真菌中心保藏所lIFO：日本大阪发酵研究所31中国微生物菌种保藏机构lCGMCC：中国普通微生物菌种保藏管理中心lACCC：中国农业微生物菌种保藏管理中心lCICC：中国工业微生物菌种保藏管理中心 lCCTCC：中国典型培养物保藏中心