最新微工第四章PPT课件.ppt

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1、微工第四章微工第四章菌种选育菌种选育工业化生产自然选育自然选育诱变育种诱变育种杂交育种杂交育种原生质体融合原生质体融合DNA重组重组抗噬菌体菌株抗噬菌体菌株自自自自然然然然状状状状态态态态下下下下，碱碱碱碱基基基基对对对对发发发发生生生生自自自自然然然然突突突突变变变变的的的的机机机机率率率率为为为为10101010-8-8-8-810101010-9-9-9-9自然突变自然突变正突变正突变负突变负突变生产上希望看到的，对生产生产上希望看到的，对生产有利。有利。一种是我们生产上所不希望一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降。和生产质量的下降。多

2、因素低剂量的诱变效应：多因素低剂量的诱变效应：自然环境中存在着低剂量的宇宙射线、各种短波辐射、低剂量的诱变物质和微生物自身代谢产生的诱变物质等的作用引起的突变。互变异构效应互变异构效应:指四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构，会引起碱基的错配。例如，T和G可以酮式或烯醇式出现，C和A可以氨基式或亚氨基式出现。工厂应用：工厂应用：简单易行，最大缺点：效率低、进展慢最大缺点：效率低、进展慢。制备单孢子（单细胞）悬液制备单孢子（单细胞）悬液 适当稀释适当稀释在固体平板上分离在固体平板上分离挑取部分单菌落进行生产能力测定挑取部分单菌落进行生产能力测定经反复筛选以确定生产能力更高的菌株替代原来的菌株经

3、反复筛选以确定生产能力更高的菌株替代原来的菌株一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。自然选育操作步骤：自然选育操作步骤：美丽的诱变之花美丽的诱变之花42 诱变选育421 诱变育种的原理诱变育种的原理 诱变育种：诱变育种：指用指用诱变剂诱变剂处理微生物细胞，提高基因突处理微生物细胞，提高基因突变频率，通过适当的筛选方法获得所需高产优质菌种变频率，通过适当的筛选方法获得所需高产优质菌种的育种方法。的育种方法。诱变剂：诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂 诱变剂种类：诱变剂种类：物理诱变剂物理诱变剂 化学诱变剂化学诱变剂 生物诱变剂生物诱变剂诱变剂的

4、共性原则：诱变剂的共性原则：1)1)化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比正比.2)2)超过超过95%95%的致癌物质对微生物有诱变作用的致癌物质对微生物有诱变作用.3)90%3)90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用.n n 目前发酵工业中应用的生产菌株大部分目前发酵工业中应用的生产菌株大部分是诱变育种得来的。以青霉素为例，是诱变育种得来的。以青霉素为例，1943年年开始生产时的效价仅为开始生产时的效价仅为40U/ml，通过多次，通过多次诱变育种现已达诱变育种现已达50000-100000U/ml。n

5、n 虽然遗传工程等新的育种方法迅速发展，虽然遗传工程等新的育种方法迅速发展，但诱变育种仍是目前广泛使用的育种手段。但诱变育种仍是目前广泛使用的育种手段。一）一）422诱变育种的一般步骤诱变育种的一般步骤原始菌株（出发菌株）原始菌株（出发菌株）细胞或孢子悬液制备细胞或孢子悬液制备活细胞计数活细胞计数诱变剂处理诱变剂处理活细胞计数活细胞计数中间培养中间培养突变株分离突变株分离初筛初筛复筛复筛生产性能试验生产性能试验诱变预备处理诱变预备处理诱诱 变变 育育 种种 的的 工工 作作 程程 序序(一)出发菌株的选择1 1自自自自然然然然界界界界新新新新分分分分离离离离的的的的野野野野生生生生型型型型菌菌

6、菌菌株株株株，对对对对诱诱诱诱变变变变处处处处理理理理较较较较敏敏敏敏感感感感，容容容容易达到好的效果。易达到好的效果。易达到好的效果。易达到好的效果。2 2在在在在生生生生产产产产中中中中经经经经生生生生产产产产选选选选种种种种得得得得到到到到的的的的菌菌菌菌株株株株与与与与野野野野生生生生型型型型较较较较相相相相像像像像，也也也也是良好的出发菌株。是良好的出发菌株。是良好的出发菌株。是良好的出发菌株。3 3每每每每次次次次诱诱诱诱变变变变处处处处理理理理都都都都有有有有一一一一定定定定提提提提高高高高的的的的菌菌菌菌株株株株，往往往往往往往往多多多多次次次次诱诱诱诱变变变变能能能能积累较多

7、的提高。积累较多的提高。积累较多的提高。积累较多的提高。4 4出出出出发发发发菌菌菌菌株株株株开开开开始始始始时时时时可可可可以以以以同同同同时时时时选选选选2 23 3株株株株，在在在在处处处处理理理理比比比比较较较较后后后后，将更适合的出发菌株继续诱变。将更适合的出发菌株继续诱变。将更适合的出发菌株继续诱变。将更适合的出发菌株继续诱变。5 5根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会使细胞产生择诱变剂，因为同一诱变剂的重复

8、处理会使细胞产生择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会使细胞产生择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂是作用于营养细抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂是作用于营养细抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂是作用于营养细抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞：有的作用于休止期，就可胞，就要选对数期的细胞：有的作用于休止期，就可胞，就要选对数期的细胞：有的作用于休止期，就可胞，就要选对数期的细胞：有的作用于休止期，就可选用孢子。选用孢子。选用孢子。选用孢子。(二)处理菌悬液的制备n n这这这这一一一一步步步步骤骤骤骤的的的的关关关关键键键键

9、是是是是制制制制备备备备单单单单细细细细胞胞胞胞和和和和单单单单孢孢孢孢子子子子状状状状态态态态的的的的、活活活活力力力力类类类类似似似似的的的的菌菌菌菌悬悬悬悬液液液液，为为为为此此此此要要要要进进进进行行行行合合合合适适适适培培培培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。因为因为 1）分散状态的细胞可均匀地接触诱变剂）分散状态的细胞可均匀地接触诱变剂 2）可避免长出不纯的菌落。）可避免长出不纯的菌落。带带玻璃珠玻璃珠的的三角瓶三角瓶内，加无菌水内，加无菌水如如紫外线紫外线、X-射线、射线、-射线

10、、快中子、射线、快中子、超声波、超声波、微波微波等等 硫酸二乙酯硫酸二乙酯(DES)、亚硝基胍亚硝基胍(NTG)、亚硝酸亚硝酸(NA)、氮芥、氮芥(NM)、羟胺、羟胺、ICR类类等等诱变剂诱变剂物理诱变剂物理诱变剂化学诱变剂化学诱变剂(三)诱变处理单一诱变剂处理单一诱变剂处理复合处理复合处理1）两种或多种诱变剂先后使用）两种或多种诱变剂先后使用2）同一诱变剂重复处理）同一诱变剂重复处理3）两种或多种诱变剂同时使用）两种或多种诱变剂同时使用 菌种菌种菌种菌种 单独处理单独处理单独处理单独处理 诱变剂诱变剂诱变剂诱变剂 突变率突变率突变率突变率（%）复合处理复合处理复合处理复合处理 诱变剂诱变剂诱

11、变剂诱变剂 突变率突变率突变率突变率（%）土曲霉土曲霉紫外线紫外线X-X-射线射线21.321.319.719.7紫外线紫外线+X-+X-射线射线42.842.8土曲霉土曲霉氮芥氮芥（0.1%0.1%）紫外线紫外线不明显不明显4.74.7氮芥氮芥+紫外线紫外线11.011.0链霉菌链霉菌紫外线紫外线-射线射线31.031.035.035.0紫外线紫外线+-射线射线43.643.6金色链霉菌金色链霉菌二乙烯三胺二乙烯三胺硫酸二乙酯硫酸二乙酯紫外线紫外线6.066.061.781.7812.512.5二乙烯三胺二乙烯三胺+紫外线紫外线硫酸二乙酯硫酸二乙酯+紫外线紫外线26.626.635.935.

12、9 诱变剂的复合处理及其协同效应诱变剂的复合处理及其协同效应 剂剂 量量 对一般微生物而言，诱变率往往随诱变剂剂量的增高而对一般微生物而言，诱变率往往随诱变剂剂量的增高而增高，但达到一定程度后，再提高剂量，反而会使诱变率增高，但达到一定程度后，再提高剂量，反而会使诱变率下降。下降。目前的处理剂量已从以前采用的死亡率目前的处理剂量已从以前采用的死亡率90-99.9%降低到降低到70-80%，甚至更低的剂量，特别是对于经过一再诱变的高，甚至更低的剂量，特别是对于经过一再诱变的高产菌株。产菌株。凡既能增加变异幅度，又能促使变异向正变范围移动的凡既能增加变异幅度，又能促使变异向正变范围移动的剂量就是合

13、适剂量。剂量就是合适剂量。(四)中间培养 由由由由于于于于在在在在发发发发生生生生了了了了突突突突变变变变尚尚尚尚未未未未表表表表现现现现出出出出来来来来之之之之前前前前，有有有有一一一一个个个个表表表表现现现现延延延延迟迟迟迟的的的的过过过过程程程程 (生生生生理理理理延延延延迟迟迟迟)，需需需需3 3 3 3代代代代以以以以上上上上的的的的繁繁繁繁殖殖殖殖才才才才能能能能将将将将突突突突变变变变性性性性状状状状表表表表现现现现出出出出来来来来。这这这这个个个个过过过过程程程程对对对对今今今今后后后后的的的的筛筛筛筛选选选选和和和和获获获获得得得得稳稳稳稳定定定定菌菌菌菌株株株株都都都都是是

14、是是极极极极为为为为重重重重要的。要的。要的。要的。方法：方法：让让让让变变变变异异异异处处处处理理理理后后后后细细细细胞胞胞胞在在在在液液液液体体体体培培培培养养养养基基基基中中中中培培培培养养养养几几几几小小小小时时时时，以以以以让让让让细细细细胞胞胞胞的的的的遗遗遗遗传传传传物物物物质质质质复复复复制制制制，让让让让细细细细胞胞胞胞繁繁繁繁殖殖殖殖几几几几代代代代，以以以以得得得得到到到到纯纯纯纯的的的的变变变变异异异异细细细细胞胞胞胞。这这这这样样样样，隐隐隐隐性性性性的的的的变变变变异异异异就会显现出来。就会显现出来。就会显现出来。就会显现出来。若若若若不不不不经经经经液液液液体体体

15、体培培培培养养养养基基基基的的的的中中中中间间间间培培培培养养养养，直直直直接接接接在在在在平平平平皿皿皿皿上上上上分分分分离离离离就就就就会会会会出出出出现现现现变变变变异异异异和和和和不不不不变变变变异异异异细细细细胞胞胞胞同同同同时时时时存存存存在在在在于于于于一一一一个个个个菌菌菌菌落落落落内内内内的的的的可可可可能能能能，形形形形成成成成混混混混杂杂杂杂菌菌菌菌落落落落，以以以以致致致致造造造造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。A 不经液体后培养不经液体后培养 B 经液体后培

16、养经液体后培养(五)分离和筛选由于经诱变处理后提高产量的变异株仍属少数，所以必由于经诱变处理后提高产量的变异株仍属少数，所以必须经过大量的筛选工作，才能得到需要的菌株。须经过大量的筛选工作，才能得到需要的菌株。初筛初筛 和和 复筛复筛 在初筛过程中，一般采用观察初筛菌落在平板上的生在初筛过程中，一般采用观察初筛菌落在平板上的生理效应所呈现的变色圈、透明圈、生长圈或抑菌圈的大理效应所呈现的变色圈、透明圈、生长圈或抑菌圈的大小来进行初步测定。小来进行初步测定。初初 筛筛 要求迅速地从大量菌株中挑选出较好的一些菌，主要求迅速地从大量菌株中挑选出较好的一些菌，主要应着眼于尽量扩大挑选范围。要应着眼于尽

17、量扩大挑选范围。降解纤维素产生产透明圈例如，测定突变株淀粉酶活力，可把待测菌株的培养液例如，测定突变株淀粉酶活力，可把待测菌株的培养液以相同大小和条件浸泡的滤纸片点植于淀粉平板上，经以相同大小和条件浸泡的滤纸片点植于淀粉平板上，经培养后滴加碘液再仔细观察并测定其透明圈的大小。培养后滴加碘液再仔细观察并测定其透明圈的大小。部分微生物菌株经过诱变处理后，变异菌株的菌落形态部分微生物菌株经过诱变处理后，变异菌株的菌落形态与生理特性、生产性能变化有一定的相关性，可在初筛时与生理特性、生产性能变化有一定的相关性，可在初筛时加以利用。加以利用。赤霉素产生菌赤霉素产生菌 色素色素 暗红加深，产量上升暗红加深

18、，产量上升红霉素产生菌红霉素产生菌 有颜色有颜色 产量下降产量下降灰黄霉素产生菌灰黄霉素产生菌野生菌株高产菌株碱性脂肪酶产生菌碱性脂肪酶产生菌野生菌株高产变异株复复 筛筛 在初筛缩小了的范围中选出产量最高的在初筛缩小了的范围中选出产量最高的1-2个菌株，主个菌株，主要着眼于在接近生产条件的情况下精确地测定出菌株的生要着眼于在接近生产条件的情况下精确地测定出菌株的生产性状。产性状。复筛一般是将初筛所得到的菌株接种到三角瓶中做复筛一般是将初筛所得到的菌株接种到三角瓶中做摇瓶培养，然后对其培养液进行定量分析测试。摇瓶培养，然后对其培养液进行定量分析测试。第第 一一 轮：轮：1个出发菌株个出发菌株诱变

19、处理诱变处理200个单细胞菌株个单细胞菌株50 株株5 株株初筛初筛每株每株1瓶瓶复筛复筛每株每株4瓶瓶 第第 二轮：二轮：5个出发菌株个出发菌株诱变处理诱变处理40株株40株株40株株40株株40株株50 株株5 株株初筛初筛每株每株1瓶瓶复筛复筛每株每株4瓶瓶 在在诱诱变变育育种种过过程程中中要要正正确确处处理理出出发发菌菌株株，诱诱变变因因素素和和筛筛选选条条件件三三者者的的关关系系。这这三三者者之之间间在在诱诱变变育育种种过程中有紧密的内在联系。过程中有紧密的内在联系。经诱变后，菌种的性能有可能发生各经诱变后，菌种的性能有可能发生各种各样的变异，如种各样的变异，如营养缺陷营养缺陷、抗性

20、突抗性突变变、形态变异、生长温度变异等，这、形态变异、生长温度变异等，这些变异均可用各种方法筛选出来些变异均可用各种方法筛选出来.几种重要突变株的筛选几种重要突变株的筛选1）营养缺陷型突变菌株的筛选）营养缺陷型突变菌株的筛选 机理：机理：底物产物1产物2E1E2E3E4 目的：目的：在分支代谢途径中：解除反馈调节，使另一分支代谢途在分支代谢途径中：解除反馈调节，使另一分支代谢途径中的末端产物积累。径中的末端产物积累。abc1c2 影印培养法影印培养法 夹层培养法夹层培养法 点植法等点植法等影印培养法检出营养缺陷型影印培养法检出营养缺陷型夹层培养法检出营养缺陷型夹层培养法检出营养缺陷型 点植法检

21、出营养缺陷型点植法检出营养缺陷型2）抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株的筛选）抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株的筛选 抗反馈阻遏机理抗反馈阻遏机理：调节基因或操纵基因发生突变，调节基因或操纵基因发生突变，产生的阻遏蛋白不能和终产物结合或结合后不能作产生的阻遏蛋白不能和终产物结合或结合后不能作用于已突变的操纵基因。用于已突变的操纵基因。抗反馈抑制机理：抗反馈抑制机理：结构基因发生突变，变构酶不结构基因发生突变，变构酶不再具有结合终产物的能力，但仍具有催化活性再具有结合终产物的能力，但仍具有催化活性。筛选模型：抗结构类似物突变筛选模型：抗结构类似物突变反馈抑制反馈抑制反馈阻遏反馈阻遏酶的活性酶的合成 结

22、构类似物与末端产物结构相似，能与阻遏蛋白或变构结构类似物与末端产物结构相似，能与阻遏蛋白或变构酶结合，阻止产物的合成，引起反馈调节作用；酶结合，阻止产物的合成，引起反馈调节作用；但不能代替末端产物参与生物合成但不能代替末端产物参与生物合成HD:高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶HT:高丝氨酸转乙酰酶高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶结构类似物抗性结构类似物抗性：Lys的结构类似物的结构类似物AEC黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制3）组成型突变株的筛选）组成型突变株的筛选 机理：机理：改变菌种的遗传特性，解除对诱导物的依改变菌种的遗传特性，解除对诱导物的依赖

23、。赖。筛选模型：筛选模型：设计某种有利于组成型菌株生长，并设计某种有利于组成型菌株生长，并限制诱导型菌株生长的培养条件，造成组成型菌株生限制诱导型菌株生长的培养条件，造成组成型菌株生长的优势或适当的分辨两类菌落的方法，选出组成型长的优势或适当的分辨两类菌落的方法，选出组成型突变菌株。突变菌株。举例说明：培养基中加入诱导酶抑制剂。举例说明：培养基中加入诱导酶抑制剂。例如例如 可在培养基中加入抑制诱导酶合成的物质，使组可在培养基中加入抑制诱导酶合成的物质，使组成型菌株处于选择优势成型菌株处于选择优势以以-半乳糖苷酶为例半乳糖苷酶为例：含有乳糖的培养基中加入抑制物含有乳糖的培养基中加入抑制物邻硝基邻

24、硝基-D-岩藻糖苷岩藻糖苷-半乳糖苷酶的合成被抑制，因此诱导型菌株不能半乳糖苷酶的合成被抑制，因此诱导型菌株不能利用乳糖，故不能生长利用乳糖，故不能生长而组成型菌株能合成该酶，利用乳糖生长，使组成而组成型菌株能合成该酶，利用乳糖生长，使组成型菌株被富集型菌株被富集4）抗性突变株的筛选）抗性突变株的筛选 抗生素抗性突变抗生素抗性突变 抗噬菌体菌株的选育抗噬菌体菌株的选育 条件抗性突变条件抗性突变 敏感突变敏感突变抗生素抗性突变抗生素抗性突变n n例：衣霉素可抑制细胞膜糖蛋白的合成，改变细胞的分泌能力，有助于胞内物质分泌到胞外n n筛选枯草芽孢杆菌的衣霉素抗性突变株，使-淀粉酶的产量比亲株提高了5

25、倍。筛选检出抗药性突变株可用筛选检出抗药性突变株可用梯度培养皿法梯度培养皿法温度敏感突变温度敏感突变 指仅在某个温度范围内显示与野生型不同表型的突变型。指仅在某个温度范围内显示与野生型不同表型的突变型。高温敏感突变型：高温敏感突变型：高温敏感突变型：高温敏感突变型：在某个温度以上显示出和野生型不同表型。在某个温度以上显示出和野生型不同表型。低温敏感突变型：低温敏感突变型：在某个温度以下显示出与野生型不同表型。在某个温度以下显示出与野生型不同表型。菌悬液涂布在完全培养基上，菌悬液涂布在完全培养基上，置于许可温度下培养置于许可温度下培养影印到一个完全培养基和两个基影印到一个完全培养基和两个基本培养基平板上本培养基平板上取基本培养基一皿为一组，置于许可温度下培养；基本培养基一皿为一组，置于许可温度下培养；另取完全培养基和基本培养基各一皿，置于非许可温度下培养另取完全培养基和基本培养基各一皿，置于非许可温度下培养1 1、微生物优良生产菌种的特征微生物优良生产菌种的特征微生物优良生产菌种的特征微生物优良生产菌种的特征2 2、自然选育的定义，原因和操作步骤、自然选育的定义，原因和操作步骤、自然选育的定义，原因和操作步骤、自然选育的定义，原因和操作步骤3 3、诱变育种的方法诱变育种的方法诱变育种的方法诱变育种的方法本章小结本章小结