药物毒理学讲座.ppt

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1、药物毒理学讲座 一、概述一、概述 (一一)实验设计实验设计 (design of experiment,DOE)良好的设计是顺利进行科学研究和数据统计分析的先决条件，也是获得预期结果的重要保证。设计包括专业设计专业设计和统计设计统计设计两部分：专业设计专业设计是从各专业角度考虑实验的科学安排，是基础。包括选题选题，建立假说建立假说，确定研究对确定研究对象象和技术方法技术方法等；统计设计统计设计则是从统计学角度，考虑设计的科学性和逻辑性，使研究结果具有重现性，更可靠，更科学，经得起时间的考验。(二二)医学科学研究种类医学科学研究种类 临床研究临床研究临床研究临床研究 流行病学研究流行病学研究流行

2、病学研究流行病学研究 动物实验研究动物实验研究动物实验研究动物实验研究 (三三)研究深度广度层次研究深度广度层次 整体整体整体整体系统系统系统系统器官器官器官器官组织组织组织组织 细胞细胞细胞细胞亚细胞亚细胞亚细胞亚细胞分子水分子水分子水分子水平平平平 个体个体个体个体 群体群体群体群体 体外体外体外体外 体内体内体内体内 宏观宏观宏观宏观 微观微观微观微观(四四)医学科学研究的基础学科和方医学科学研究的基础学科和方法学法学 卫生统计学卫生统计学卫生统计学卫生统计学 流行病学流行病学流行病学流行病学 卫生毒理学卫生毒理学卫生毒理学卫生毒理学 (五五)毒理学及其相关术语毒理学及其相关术语 1.1

3、.毒理学毒理学毒理学毒理学(toxicology)是研究化学物质对机是研究化学物质对机体的生物学作用及其机理的学科；体的生物学作用及其机理的学科；研究化学物质对机体的有益作用，即通过影响研究化学物质对机体的有益作用，即通过影响机体器官的生理功能或细胞代谢活动达到防治疾病机体器官的生理功能或细胞代谢活动达到防治疾病的目的，属的目的，属药物学药物学药物学药物学范畴；范畴；研究化学物质对机体的有害作研究化学物质对机体的有害作用及其防护措施，属用及其防护措施，属预防医学预防医学预防医学预防医学范畴。范畴。2.外源化学物外源化学物(xenobiotics)：以前叫外来化合物外来化合物，指存在于人类生活的

4、外界环境中、可能与机体接触并进入机体的化学物质；它们并非人体的组成成分，也非人体所需的营养物质，也不是维持正常生理功能和生命所必需的物质，但可由外界环境经一定环节和途径与机体接触并进入机体，在体内呈现一定的生物学作用。确切地说，应称为“外来生物活性外来生物活性物质物质”。须强调：包括“药物药物”。外源化学物外源化学物包括：包括：医药医药 农药农药 工业化学物工业化学物 环境污染物环境污染物 食品添加剂食品添加剂 产业性化学物：如产业性化学物：如化妆品、洗涤剂等化妆品、洗涤剂等 与外源化学物外源化学物相对应的概念是内源活性化合物内源活性化合物：指机体代谢过程中所形成的产物或中间产物。3.3.毒物

5、毒物毒物毒物(poison)poison)指在一定条件下，以较指在一定条件下，以较小剂量进入机体就能干扰正常的生化过程或生小剂量进入机体就能干扰正常的生化过程或生理功能，引起暂时或永久性的病理改变，甚至理功能，引起暂时或永久性的病理改变，甚至危及生命的化学物质。危及生命的化学物质。“毒物”与“非毒物”的概念是相对的。4.4.毒性毒性毒性毒性(toxicity)化学物化学物能够对机体造成对机体造成损害的能力，称为毒性。损害的能力，称为毒性。在同等剂量下，化学物质对机体损害能力越大，其毒性越高。相对于同一损害指标，需要剂量越小的化学物质，其毒性越大。如同“毒物”和“非毒物”是相对的一样，化学物质的

6、毒性高低毒性高低毒性高低毒性高低具有具有相对相对相对相对意义意义。对于毒性，一定要强调对于毒性，一定要强调“量量量量”的概念。的概念。任何化学物质，只要达到一定的剂量，对机体都具有毒性，对机体都具有毒性，而低于某一剂量水平时，则不具有毒性。如人体必需的微量元素如人体必需的微量元素SeSe、食盐等；食盐等；毒性大的非人体必需化学物，在某一剂量范围毒性大的非人体必需化学物，在某一剂量范围内对机体不呈现损害作用，有的反而对某种疾病有内对机体不呈现损害作用，有的反而对某种疾病有治疗作用，如治疗作用，如AsAs、PbPb。因此，剂量剂量(dose)dose)是化学物质毒性化学物质毒性的决定因素决定因素。

7、化学物质化学物质的毒性毒性除主要取决于剂量外，还与，还与化学化学物对机体的物对机体的作用条件作用条件作用条件作用条件(如如接触途径接触途径接触途径接触途径、接触方式接触方式接触方式接触方式：包括：包括接触次数、时间、间隔等接触次数、时间、间隔等)、理化特性理化特性理化特性理化特性(如溶解度、分如溶解度、分散度、挥发度、比重、硬度散度、挥发度、比重、硬度)、环境因素环境因素环境因素环境因素(如气温、气如气温、气湿湿)、宿主因素宿主因素宿主因素宿主因素(如物种、品系、性别、年龄、遗传素如物种、品系、性别、年龄、遗传素质、免疫水平、健康状况、营养状况质、免疫水平、健康状况、营养状况)等有关。等有关。

8、因此，探讨化学物对机体的生物学作用，关键是因此，探讨化学物对机体的生物学作用，关键是作用剂量作用剂量作用剂量作用剂量和和作用条件作用条件作用条件作用条件。即在严格控制条件下通过实验。即在严格控制条件下通过实验研究研究(动物实验动物实验)观察药物对机体及其组成部分的作用观察药物对机体及其组成部分的作用规律及其原理。规律及其原理。5.5.半数致死剂量半数致死剂量半数致死剂量半数致死剂量 (median lethel dose,median lethel dose,LDLD5050)，或或半数半数半数半数致死浓度致死浓度致死浓度致死浓度(LCLC5050)：指化学毒物能够引起受试对象死亡一半指化学毒

9、物能够引起受试对象死亡一半所需要的剂量或浓度。又称所需要的剂量或浓度。又称致死中量致死中量致死中量致死中量。为一统计量。为一统计量。毒物的毒性大小，通常用动物急性毒性试验所得出的毒物的毒性大小，通常用动物急性毒性试验所得出的LDLD5050或或LCLC5050来表示。化学毒物的急性毒性与来表示。化学毒物的急性毒性与LDLD5050呈反比，呈反比，即急性毒性越大，即急性毒性越大，LDLD5050的数值越小。的数值越小。经口、经皮毒性用经口、经皮毒性用LDLD5050表示表示，单位单位单位单位mg/kgmg/kg BW)BW)；吸入毒性或对水生动物的毒性用吸入毒性或对水生动物的毒性用LCLC505

10、0表示，表示，单位单位单位单位mg/mmg/m3 3或或mg/Lmg/L。LDLD5050或或LCLC5050是评价化学毒物急性毒性大小最是评价化学毒物急性毒性大小最重要的参数，也是对不同化学毒物进行急性毒性重要的参数，也是对不同化学毒物进行急性毒性分级的基础标准。分级的基础标准。我国农药的急性毒性分级我国农药的急性毒性分级级 别经口LDLD50 50(mg/kgWB)经皮LDLD5050(mg/kgWB)4h吸入LCLC50 50(mg/m3)2h剧 毒52020高 毒52020中等毒5050020020002002000低 毒5002000 2000化学物质急性毒性分级化学物质急性毒性分级

11、级级 别别大鼠口服大鼠口服LDLD50 50(mg/kgWB)相当于人的致死剂量相当于人的致死剂量(mg/kgWB)(g/人人)极极 毒毒1稍尝 0.05剧剧 毒毒1505004000 0.5中等毒中等毒51500400030000 5低低 毒毒501500030000250000 50实际无毒实际无毒500115000250000500000 500无无 毒毒 15000 500000 2500 反映化学物质急性毒性大小的指标还有：反映化学物质急性毒性大小的指标还有：最大无作用剂量最大无作用剂量最大无作用剂量最大无作用剂量(NOEL)NOEL)；最小有作用剂量最小有作用剂量最小有作用剂量最小

12、有作用剂量(minimal effct levelminimal effct level，MELMEL)，又叫又叫中毒阈剂量中毒阈剂量中毒阈剂量中毒阈剂量(threshold dose)threshold dose)，或，或中毒阈值中毒阈值中毒阈值中毒阈值，或或毒性阈值毒性阈值毒性阈值毒性阈值；最大耐受剂量最大耐受剂量最大耐受剂量最大耐受剂量(maximal tolerance dose,maximal tolerance dose,MTD,MTD,LDLD0 0)最小致死剂量最小致死剂量最小致死剂量最小致死剂量(LDLD1 1)；绝对致死剂量绝对致死剂量绝对致死剂量绝对致死剂量(LDLD10

13、0100)。6.6.剂量剂量剂量剂量反应关系反应关系反应关系反应关系(dose-response relationshipdose-response relationship)表示化学毒物的剂量与某一群体中质效应的发生率表示化学毒物的剂量与某一群体中质效应的发生率之间的关系。之间的关系。7.7.剂量剂量剂量剂量效应关系效应关系效应关系效应关系(dose-effect relationship)dose-effect relationship)表示化学毒物的剂量与个体表示化学毒物的剂量与个体或群体中发生的量效应强度或群体中发生的量效应强度之间的关系。之间的关系。安全系数安全系数安全系数安全系数

14、种属差异种属差异,动物实验动物实验,外推到人。外推到人。试验组试验组试验组试验组 不同剂量组不同剂量组 阴性对照组阴性对照组阴性对照组阴性对照组 阳性对照组阳性对照组阳性对照组阳性对照组 为何设阴性、阳性对照组为何设阴性、阳性对照组？样本含量样本含量样本含量样本含量 原则原则原则原则：既符合统计学要求：既符合统计学要求,又不致又不致人力、物力、财力、时间的浪费。人力、物力、财力、时间的浪费。统计学处理统计学处理统计学处理统计学处理 计量资料计量资料;计数资料计数资料医医医医 药药药药药效学药效学药效学药效学农农农农 药药药药研究研究研究研究产业性产业性产业性产业性化学物化学物化学物化学物毒理学

15、毒理学毒理学毒理学(五五)药物研究药物研究 药效学研究药效学研究药效学研究药效学研究 毒理学研究毒理学研究毒理学研究毒理学研究 两者均须通过动物实验、流行病学、临床研究方两者均须通过动物实验、流行病学、临床研究方法进行研究，但毒理学研究主要采用动物实验。法进行研究，但毒理学研究主要采用动物实验。(六六)毒理学安全性评价毒理学安全性评价 我国现有的毒理学安全性评价程序我国现有的毒理学安全性评价程序：食品安全性毒理学评价程序食品安全性毒理学评价程序 农药安全性毒理学评价程序农药安全性毒理学评价程序 新药新药(农药农药)毒理学研究指导原则毒理学研究指导原则 化妆品安全性毒理学评价程序化妆品安全性毒理

16、学评价程序 化学品毒性鉴定管理规范化学品毒性鉴定管理规范(入世为与国际接轨颁布入世为与国际接轨颁布)实验室研究质量规范实验室研究质量规范(good laboratory practice,GLP)，对毒性鉴定机构的认证、实验室要求作出明确规定。对不同化学品(食品添加剂、药物、农药、化妆品、工业化学物等)，由于接触方式、途径、剂量不同，按照不同的国家标准国家标准，采用不同行业规范程序不同行业规范程序进行评价。毒理学安全性评采用分阶段试验分阶段试验的的原则原则(考虑急性危害、慢性危害、远期危害)。各阶段试验之间有关联，要按顺序进行按顺序进行。如急性毒性实验是所有毒理学实验的基础；慢性毒性实验的剂量

17、、观察指标的选择要参考亚慢性毒性实验的结果。根据前一阶段的实验结果，判断是否进行下一阶段的实验。不同阶段的毒理学试验项目不同阶段的毒理学试验项目 我国现有毒理学评价程序多数现有毒理学评价程序多数为4个阶段个阶段。化妆品安全性毒理学评价程序化妆品安全性毒理学评价程序为5个阶段个阶段。新药新药研究分为全身用药的毒性试验全身用药的毒性试验、局部用局部用药的毒性试验药的毒性试验、特殊毒理研究特殊毒理研究，三部分三部分。化学物的种类不同，用途不同，试验方法和先后顺序不同(如化妆品、食品，口皮急毒顺序不同)。第一阶段第一阶段，包括包括：急性毒性试验急性毒性试验；局部毒性试验局部毒性试验。目的目的目的目的：

18、主要是测定LD50或LC50，并进行急性毒性分急性毒性分级级，为其它试验提供剂量参考依据，并推测靶器官推测靶器官。农药农药、化装品化装品要进行 皮肤皮肤、黏膜刺激试验黏膜刺激试验；眼刺激试验眼刺激试验；皮肤致敏试验皮肤致敏试验；皮肤光毒试验皮肤光毒试验；光变态反应试验光变态反应试验。第二阶段第二阶段，一般包括包括包括包括：蓄积试验蓄积试验；致突变试验致突变试验。目的目的目的目的：了解与受试物多次接触后体内的蓄积蓄积情况情况以及可能可能的危害危害，并判断是否具有致突变性致突变性进而估计致癌性致癌性。蓄积试验，以死亡为指标，有一定局限性，目前有些评价程序已经去掉。致突变试验，包括多种组合，以观察不

19、同的遗传终点。某些受试物在第一、第二阶段试验后，可决定是否进行下一阶段的试验。如引进产品、生产工艺，国外已经登记注册，毒性资料全面，其质量规格、生产工艺、与国外产品一致，进行第一阶段和第二阶段结果与国外一致，可以不进行第三、第四阶段试验。第三阶段第三阶段，包括包括包括包括：亚慢性毒性试验亚慢性毒性试验；生殖生殖及发育毒性试验发育毒性试验；代谢试验代谢试验。亚慢性毒性试验亚慢性毒性试验目的目的目的目的：确定反复接触受试物所引起的毒性效应毒性效应、强度强度、靶器官靶器官，初步估计NOAEL或LOAEL，为慢性慢性毒性试验和致癌致癌试验提供剂量剂量、指标参考指标参考依据。生殖发育毒性试验生殖发育毒性

20、试验包括包括包括包括：致畸试验致畸试验；繁殖试验繁殖试验。目目目目的的的的：观察对生殖过程生殖过程的影响。代谢试验代谢试验目的目的目的目的：了解受试物在体内的吸收吸收、分布分布、消除消除情况，判断蓄积性蓄积性。第四阶段，第四阶段，包括包括包括包括：慢性毒性试验慢性毒性试验；致癌试验致癌试验。目的目的目的目的：获得NOAEL或LOAEL，为制订卫生标准制订卫生标准提供参考数据。特点特点：时间长、费人力物力。(七)药物毒理学研究的发展 随着医学科学和医药工业的进步和发展，研制和开发了随着医学科学和医药工业的进步和发展，研制和开发了大量新药，对医治人类疾病大量新药，对医治人类疾病,保障人类健康起到了

21、巨大作用。保障人类健康起到了巨大作用。但由于但由于19611961年年反应停反应停反应停反应停(thalidomide)thalidomide)药害事件药害事件药害事件药害事件发生，使发生，使2828国家中出生了国家中出生了80008000多短肢畸形儿，引起世界各国极大关注，多短肢畸形儿，引起世界各国极大关注，使医学界首次认识到对母体安全的化学药物对胎儿产生不可使医学界首次认识到对母体安全的化学药物对胎儿产生不可逆损伤。由此揭开药物和其它环境化学毒物致畸的研究序幕。逆损伤。由此揭开药物和其它环境化学毒物致畸的研究序幕。人们在要求药效的同时，更注意其安全性。人们在要求药效的同时，更注意其安全性。

22、一种药物的药理概况，决定于临床前的药理一种药物的药理概况，决定于临床前的药理和毒性研究，在供使用前必需了解预期药效、药和毒性研究，在供使用前必需了解预期药效、药理性质、毒性作用，有助于显示其使用安全性。理性质、毒性作用，有助于显示其使用安全性。药物的安全性，是保证药品质量的重要环节，随药物的安全性，是保证药品质量的重要环节，随着新药的国际化，国际间相互利用安全性试验数着新药的国际化，国际间相互利用安全性试验数据也日益增加。据也日益增加。为此，英国为此，英国19681968年颁布药品法，年颁布药品法，19711971年成年成立了药物检定机构和药物安全委员会。此后，在立了药物检定机构和药物安全委员

23、会。此后，在药物市场经济推动下，许多发达国家开始重视药药物市场经济推动下，许多发达国家开始重视药物和其它化学品对人类生殖的影响，首先是物和其它化学品对人类生殖的影响，首先是致畸致畸致畸致畸性性性性(teratogenicity)teratogenicity)，WHOWHO于于19671967年在国际疾年在国际疾病分类中把先天缺陷列为第病分类中把先天缺陷列为第1414项，分项，分2020大类、大类、133133小类。同时，研究怀孕至出生之间胚胎小类。同时，研究怀孕至出生之间胚胎/胎儿胎儿异常发育的异常发育的畸胎学畸胎学畸胎学畸胎学(teratology)teratology)创立。创立。1981

24、1981年年OECDOECD(经济合作和发展组织经济合作和发展组织)制定了制定了“化学物质化学物质化学物质化学物质毒性试验指导原则毒性试验指导原则毒性试验指导原则毒性试验指导原则”，该指导原则不仅对药品也，该指导原则不仅对药品也包括一般产业性化学物质，使毒性试验规范化。包括一般产业性化学物质，使毒性试验规范化。(七七)新药研究过程新药研究过程 大致可分三步：即大致可分三步：即临床前研究临床前研究临床前研究临床前研究、临床研究临床研究临床研究临床研究和和售后调研售后调研售后调研售后调研。1.临床前研究临床前研究 用动物试验进行系统药理研究和急慢性毒理观察，对于用动物试验进行系统药理研究和急慢性毒

25、理观察，对于具有选择性药理效应的药物，在进行临床试验前，还需测定具有选择性药理效应的药物，在进行临床试验前，还需测定该药物在动物体内的吸收、分布及消除过程该药物在动物体内的吸收、分布及消除过程(药代动力学药代动力学药代动力学药代动力学)，故临床前研究目的是弄清新药的作用谱，故临床前研究目的是弄清新药的作用谱(药效药效药效药效)及可能发生及可能发生的毒性反应的毒性反应(毒作用特点毒作用特点毒作用特点毒作用特点)。2.临床研究临床研究 首先从首先从10103030名志愿者中找出安全剂量名志愿者中找出安全剂量(依据动物试验依据动物试验结果，安全系数结果，安全系数)，再选有特异特征病人随机分组，设立，

26、再选有特异特征病人随机分组，设立已已已已知有效药物知有效药物知有效药物知有效药物及及空白安慰剂空白安慰剂空白安慰剂空白安慰剂双重对照双重对照(阳、阴性对照阳、阴性对照),),对治疗对治疗结果统计分析，判断其疗效。结果统计分析，判断其疗效。3.售后调研售后调研 重点了解长期使用后出现的重点了解长期使用后出现的不良反应不良反应不良反应不良反应和和远期疗效远期疗效远期疗效远期疗效(流行流行流行流行病学研究病学研究病学研究病学研究)。(八八)新药药理毒理研究的技术要求新药药理毒理研究的技术要求 新药的药理毒理研究包括新药的药理毒理研究包括主要药效学主要药效学主要药效学主要药效学、一般一般一般一般药理学

27、药理学药理学药理学、药代动力学药代动力学药代动力学药代动力学及及毒理学研究毒理学研究毒理学研究毒理学研究等。等。新药的药效研究药效研究，以医药理论为指导，运用现代科学方法，制定具有医药特点的试验方案，根据新药的功能主治，选用或建立相应的动物模型和试验方法，其目的是对新药的有效性评价提供科学依据。新药的毒理研究毒理研究包括急性毒性急性毒性、长期毒性长期毒性和特殊毒性试验特殊毒性试验等，其目的是对新药的安全性评价安全性评价提供科学依据。基本要求基本要求 1.试验主要负责人主要负责人应具有药理毒理专业高级技术职称和有较高的理论水平、工作经验与资历。确保试验设计合理，数据可靠，结果可信，结论判断准确。

28、试验报告应有试验负责人签字及单位盖章。2.受试药物受试药物应处方固定、制备工艺及质量基本稳定。3.从事新药安全性研究的实验室实验室应符合国家药品监督管理局药品非临床研究质量管理规范(GLP)的要求，药理研究也可参照实行。全身性用药的毒理试验全身性用药的毒理试验 1急性毒性试验急性毒性试验 观察一次给药后，动物产生的毒性反应并测定其半数致死量(LD50)。要用两种以上给药途径(包括推荐临床研究的给药途径，溶于水的药应当测定iv的LD50)。给药后至少观察7d，观察到动物有毒性反应时应进行肉眼尸检，记录所有病变。存活24h或更长时间的处理动物，当尸检发现有病变组织时，应对该组织进行镜检。2长期毒性

29、试验长期毒性试验 观察动物因连续用药而产生的毒性反应、中毒时首先出现的症状及停药后组织和功能损害的发展和恢复情况。(1)动物动物：至少两种动物(包括啮齿类和非啮齿类)，啮齿类常用大白鼠，年龄为6W，饲养观察1W后使用，动物数按毒性试验时间的长短决定，如毒性试验时间90d，每剂量组为雌雄各10只。如毒性试验时间90d，每剂量组为雌雄各20只。非啮齿类常用狗，年龄为46月，每剂量组为雌雄各2只。对照组和试验组的动物数要相等。(2)剂量剂量：常用三个剂量，大动物也可用两个剂量。在试验过程中，高剂量组应有部分动物出现毒性反应或死亡(20)，低剂量组应当略高于药物对动物的有效量或临床试验用的剂量而不出现

30、任何观察指标的异常。(3)给药途径给药途径：注射用药的给药途径应与推荐临床试验的给药途径相同，口服给药最好采用灌胃法。(4)试验周期试验周期：一般参考推荐临床试验的用药持续时间考虑，即动物试验连续给药期必须为临床试验给药期的34倍。例如，临床试验给药期为13d者，毒性试验给药期为2W。7d者，为4W。30d者，为3月。30d者，毒性试验给药期至少半年。试验周期在半年以上的新药，可在长期毒性试验进行3个月后、未发现明显毒性反应的情况下，申请进行第期临床试验。(5)观察指标观察指标：一般体征、体重、外观、行为、尿常规、血常规、肝肾功能及重要器官的肉眼观察和病理检查，必要时作骨髓检查，血液生化，大动

31、物应检查心率和心电图变化。凡有可能引起眼、耳毒性的药物，应增加眼、耳毒性检查指标。有些药物尚需研究对酸碱平衡、水盐代谢的影响。产生毒性反应的新药至少应对高剂量组和对照组的动物在给药期结束后继续进行观察，对引起不可逆性功能损害和组织病变的药物，要慎重考虑临床试验问题。对毒性较高、安全范围较小的特殊品种新药，如拟进行临床试验，最好通过研究找出一种解救药，以备过量中毒时使用。有的新药还应根据其药理性质和用途，观察对注射部位(皮下、肌肉、血管)的刺激性，注射用生化制品应进行热原、异性蛋白及过敏试验。(二二)局部用药毒性试验局部用药毒性试验 局部用药(如呼吸道吸入以及粘膜、皮肤用药等)，大都可以被吸收。

32、因此，局部用药应先进行局部吸收试验，根据药物从局部吸收的程度，考虑进行全身性用药的各项试验。根据用药方法，对用药部位要进行局部刺激性试验，用肉眼观察及组织切片的镜检，测试刺激性(即炎症)的发展和恢复情况。1皮肤用药皮肤用药 进行完整和破损皮肤的毒性试验以及皮肤致敏试验，除婴儿皮肤用药应使用刚成年动物外，其余均用成年动物。可选用家兔、豚鼠或大鼠。至少应设三个剂量组，每组动物数3只，以观察与剂量相关的毒性反应。观察期一般在停止敷用后不超过14d。2滴鼻剂和吸入剂滴鼻剂和吸入剂 进行呼吸道(包括肺部)的局部刺激性和毒性试验。大鼠或豚鼠。每一个浓度组至少10只动物(雌雄各半)，至少设3个浓度组。接触吸

33、入剂的时间不少于4h。观察期一般为14d。3滴眼剂滴眼剂 观察对眼结合膜和眼球的刺激作用。家兔为首选，至少用3只家兔。液体制剂的剂量一般每次用0.1ml，软膏等制剂每次100mg。观察期一般在停止给药后21d内，以观察出现反应的可逆性和不可逆性。4局部作用于直肠、阴道的制剂局部作用于直肠、阴道的制剂，进行对作用部位的刺激及局部毒性试验。(三三)特殊毒理研究特殊毒理研究 1致突变试验致突变试验 根据受试物的化学结构、理化性质及对遗传物质作用终点(基因突变和染色体畸变)的不同。要求新药必须做以下三项试验：(1)微生物回复突变试验微生物回复突变试验 菌株菌株：组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌四株(TA97、

34、TA98、TA100、TA102)，亦可采用大肠杆菌(E.Coli)WP2若干株(大肠杆菌试验)。剂量选择剂量选择：决定受试物最高剂量的标准是细菌毒性和溶解度。一般最大剂量可达5mg/皿。受试物至少应有5种不同的剂量，否则应说明选择剂量的理由。代谢活化代谢活化：应有诱导剂处理后的哺乳动物肝脏微粒体(S9)进行体外代谢活化试验，即在加S9混合物和不加S9混合物平行的条件下测试。对照组对照组：用溶媒作阴性对照，用已知突变原作阳性对照。结果判定结果判定：受试物的回复突变菌落数的增加与剂量相关并有统计学意义，或至少某一测试点呈现可重复的并有统计学意义的阳性反应时记为阳性。(2)哺乳动物培养细胞染色体畸

35、变试验哺乳动物培养细胞染色体畸变试验 细胞细胞：哺乳动物原代或传代培养细胞。剂量剂量：至少应有三种不同剂量，高剂量以50细胞生长抑制浓度为基准，否则应说明选择剂量的理由。标本制作时间标本制作时间：药物与细胞接触后应有适当时间，最好包括整个细胞周期，通常在药物处理后24和48h制作染色体标本。代谢活化代谢活化：应用适当的代谢活化法。对照组对照组：用溶媒作阴性对照，已知突变原作阳性对照。镜检镜检：每种浓度至少观察100个中期分裂相细胞的染色体结构的异常及多倍体的出现率。结果判定结果判定：受试物诱发的染色体畸变出现率较阴性对照有统计学意义的增加，并有剂量反应关系时记为阳性，同时标明异常细胞出现的频率

36、和种类。(3)体内试验体内试验：一般选用微核试验，但作用于生殖系统的药物进行显性致死试验等。1)啮齿类动物微核试验啮齿类动物微核试验 动物动物：一般用小鼠，每组10只性成熟动物(各半)或至少6只性成熟动物。给药剂量及途径给药剂量及途径：至少采用三种剂量，最高剂量以1/2LD50为基准，腹腔和/或口服一次给药，必要时可连续给药、否则应说明选定剂量的理由。对照组对照组：用溶媒作阴性对照，已知能诱发微核阳性的物质作阳性对照。标本制作标本制作：给药后1830h或1272h处死动物，取骨髓，离心，涂片，Giemsa染色或吖啶橙染色。镜检镜检：每只动物至少观察计数1000个多染红细胞和正染红细胞的比率。结

37、果判定结果判定：微核细胞出现的频度与对照组相比有统计学意义的增加，并有剂量反应关系时，或同一剂量有重复性并有统计学意义时记为阳性。2)啮齿类动物显性致死试验啮齿类动物显性致死试验 动物动物：性成熟的啮齿类动物，一般采用小鼠。每组至少15只鼠。给药剂量及途径给药剂量及途径：至少采用三种剂量，但在初期评价中单剂量或二种剂量即可。高剂量以30d连续给药使100动物生存的最大耐受量为基准。口服或腹腔注射可采用一次给药，每天给药一次，连续给药5d或连续给药6W的方法之一。交配方法交配方法：给药的动物以适当的时间间隔依次与未给药的动物交配，交配时间取决于给药方式，一般一次或连续给药5d的动物，以最后给药后

38、6W内为交配时间；连续给药6W的动物以最后给药后1W内为交配时间。对照组对照组：用溶媒作阴性对照，已知能诱发显性致死阳性物质作阳性对照。但在同一实验室，对同一品系的动物，可不设阳性对照。观察指标观察指标：交配的动物在妊娠后期剖腹，观察子宫内胚胎着床数，生存胎仔数，死亡胎仔数及未着床数。显性致死率以DL表示：DL(100)1(试验组妊娠鼠的平均生存胎仔数/阴性对照组妊娠鼠的平均生存胎仔数)100 结果判定结果判定：死亡胎仔数的增加，胚胎着床总数的减少，或未着床胚胎数的增加，生存胎仔总数减少，这些结果有统计学意义并有剂量反应关系时记为阳性显性致死效应。当上述三项致突变试验结果难以下结论时，可选择其

39、他补充试验予以确证。2生殖毒性试验生殖毒性试验 所用药物至少应有23种剂量并设对照组。高剂量可产生轻度毒性反应，低剂量应为人临床拟用剂量的若干倍。给药途径原则上与推荐临床应用的给药途径相同，口服制剂应用灌胃法。(1)一般生殖毒性试验一般生殖毒性试验 动物动物：一种或一种以上试验动物，如用小鼠或大鼠每组各20只以上。给药时期给药时期：选择性成熟的动物，交配前动物连续给药60d以上，动物连续给药14d。动物在确定已经交配后继续给药至多数胚胎器官发生期。检查检查：给药的动物与给药的动物同笼饲养期限最多2W。必要时给药动物可以和非给药动物分别交配。已交配的雌性动物，推定其妊娠末期及时解剖，观察妊娠的确

40、立、胎儿的吸收和死亡及子宫内活胎的发育情况，并进行形态学检查(性别、外表及内部器官的形态学观察及骨骼透明标本的检查)，必要时进行组织学和组织化学的详细检查。给药的动物及未交配上的鼠均作剖检，必要时进行病理组织学检查。(2)致畸胎试验致畸胎试验 动物动物：至少一种动物。一般采用小鼠或大鼠，每组1520只孕鼠，家兔每组812只孕兔。剂量剂量：至少有23种剂量。并另设对照组，高剂量可有轻度毒性反应，低剂量应以拟议中的治疗量的某些倍量。给药途径给药途径：与推荐临床应用的给药途径相同，口服制剂应用灌胃法。给药时期给药时期：胚胎的器官形成期。检查检查：全部动物在妊娠末期剖检，观察妊娠的确立，有无死胎和吸收

41、胎及子宫内活胎的发育情况，并进行形态学检查(性别、外表及内部器官的形态学观察及骨骼透明染色标本的检查)，必要时进行组织学和/或组织化学的详细检查。某些新药需要观察其对子代的影响。动物数相应增加孕鼠10只，使其自然分娩，观察下一代直至成年。检查新生动物的存活、生长及发育情况，包括行为、生殖功能和其他异常症状。必要时还可对给药的动物长期观察其生殖、受孕、分娩及次子代的情况。结果处理结果处理：将数据汇总成表，尽量将全部观察的结果采用适当的统计学方法分析及评价。(3)围产期毒性试验围产期毒性试验 动物动物：小鼠或大鼠，每组1520只孕鼠，家兔每组820只孕兔。给药时期给药时期：妊娠后期及整个泌乳期。检

42、查检查：所有动物自然分娩，观察下一代直至成年，检查其新生后存活、生长和发育情况，其中包括行为、生殖功能及其他异常症状。必要时还可对给药的动物长期观察其生殖、受孕、分娩及次子代的情况。3致癌试验致癌试验 在选择动物的种系时，应考虑其对感染疾患的抵抗性、寿命、自发肿瘤的频度系对致癌物的敏感性。同一药物的致癌性预备试验及致癌试验应该用同一饲养场饲养的同一种和系的动物。啮齿动物的给药时间，最好在断乳后尽早开始。(1)致癌试验的预备实验致癌试验的预备实验：应由急性毒性试验决定亚急性毒性试验的最高剂量，由亚急性毒性试验决定致癌试验的最高剂量，此剂量应具有：实验和对照组之比，体重增长抑制10；无中毒死亡动物

43、；一般形态变化不大。啮齿类动物每组各10只，设三个试验组及一个对照组。给药途径应与进行致癌试验时准备采用的途径一致，连续给药90d。对有慢性蓄积性效应的药物，需延长给药期。药物混入饲料或饮水中给药的方式，要定期测定饲料或饮水的消耗量，以推算出药物的摄取量。每天观察动物的一般情况，每周测量动物体重，对死亡动物及试验期末的动物均需作大体解剖，并作病理解剖记录。肉眼观察后，认为有病变或可疑病变的脏器进行病理组织学检查。(2)致癌试验致癌试验 动物动物：试验组和对照组动物各50只以上。剂量：至少应有三种以上剂量，一定要有溶媒或赋形剂对照组。给药期给药期：大鼠为24月以上，小鼠、地鼠为18月以上。观察指

44、标观察指标：对所有动物每天应观察一般症状，开始时每周测一次体重和摄食量，第13W后，至少每4W测一次。应尽量减少肿瘤以外的死亡率。大鼠在试验24个月，小鼠、地鼠18个月时，各组的存活率不小于50。试验期末解剖或怀疑有血液疾患时，最好做末梢血液白细胞及红细胞计数。如果在试验组和对照组肉眼观察到有肿瘤性病变或可疑肿瘤病变时，则应对以下器官进行病理组织学检查：皮肤、乳腺、淋巴结、唾液腺、胸骨、脊椎及大腿骨(含有骨髓)、胸腺、气管、肺及支气管、心、甲状腺及副甲状腺、舌、食管、胃、十二指肠、大肠、小肠、肝、胰、脾、肾、肾上腺、睾丸、卵巢、性腺及其附属器官、眼球、脑下垂体、脊髓及其它。如果试验组和对照组均

45、无肉眼可见的肿瘤性病变，则对高剂量组的部分动物(1/21/3)的上述器官进行病理组织学检查，如发现有肿瘤病变则需对全部动物进行病理组织学检查。结果判断结果判断：符合下列情况之一者判断为阳性：试验组肿瘤阳性，对照组阴性；试验组和对照组均有肿瘤发生，但试验组肿瘤发生率高于对照组；试验组肿瘤发生的部位多于对照组；试验组和对照组肿瘤的发生率虽无明显差异，但试验组肿瘤出现早。(3)评价评价：如果在一种动物中发现有明确的致癌作用，预示对人可能有致癌潜力。如果在所有动物中(最好两种)都是阴性结果，则可判为阴性。二、药品临床前毒性试验二、药品临床前毒性试验 (一一)目的目的 剔除毒性大的化学物，找出发生不良反

46、应的剔除毒性大的化学物，找出发生不良反应的靶器官靶器官靶器官靶器官和和靶靶靶靶组织组织组织组织，以便在早期临床试验中注意观察这些器官和组织的，以便在早期临床试验中注意观察这些器官和组织的构构构构造造造造及及功能变化功能变化功能变化功能变化，最好还要找出这些，最好还要找出这些不良反应不良反应不良反应不良反应与与剂量剂量剂量剂量和和疗程疗程疗程疗程间间关系，毒性作用是关系，毒性作用是可逆可逆可逆可逆的，还是的，还是不可逆不可逆不可逆不可逆的，是的，是可以预防可以预防可以预防可以预防的，的，还是还是不可避免不可避免不可避免不可避免的，如果能证实毒作用机制，就可以更精确地的，如果能证实毒作用机制，就可

47、以更精确地预测预测预测预测药品对人体药品对人体毒性毒性毒性毒性(但要考虑其不良反应是否与超剂量但要考虑其不良反应是否与超剂量反应的界限，就会出现与药理作用范围内的剂量缺乏联系的反应的界限，就会出现与药理作用范围内的剂量缺乏联系的毒性反应毒性反应)。(二二)试验原则试验原则 单次给药毒性试验单次给药毒性试验单次给药毒性试验单次给药毒性试验 重复给药毒性试验重复给药毒性试验重复给药毒性试验重复给药毒性试验 生殖、发育毒性试验生殖、发育毒性试验生殖、发育毒性试验生殖、发育毒性试验 致突变试验致突变试验致突变试验致突变试验 致癌试验致癌试验致癌试验致癌试验 皮肤过敏试验皮肤过敏试验皮肤过敏试验皮肤过敏

48、试验 皮肤光敏性试验皮肤光敏性试验 1.单次给药毒性试验单次给药毒性试验 又称又称急性毒性急性毒性急性毒性急性毒性，指一次给药。，指一次给药。目的目的目的目的:一次给予受试物后，从一次给予受试物后，从质质质质与与量量量量两方面两方面证明其毒性。证明其毒性。动物物种选用原则动物物种选用原则 解剖结构、生理生化、化学物解剖结构、生理生化、化学物解剖结构、生理生化、化学物解剖结构、生理生化、化学物 在体内的代谢与人类近似；在体内的代谢与人类近似；在体内的代谢与人类近似；在体内的代谢与人类近似；经济可行；经济可行；经济可行；经济可行；有符合试验要求的寿命长度；有符合试验要求的寿命长度；有符合试验要求的

49、寿命长度；有符合试验要求的寿命长度；便于饲养管理。便于饲养管理。便于饲养管理。便于饲养管理。常用毒理学试验的动物选择常用毒理学试验的动物选择 一般毒性试验一般毒性试验一般毒性试验一般毒性试验常选常选大鼠大鼠大鼠大鼠、小鼠小鼠小鼠小鼠；眼刺激试验眼刺激试验眼刺激试验眼刺激试验常选常选家兔家兔家兔家兔；皮肤刺激试验皮肤刺激试验皮肤刺激试验皮肤刺激试验常选常选家兔家兔家兔家兔、豚鼠豚鼠豚鼠豚鼠；致敏试验致敏试验致敏试验致敏试验和和光敏试验光敏试验光敏试验光敏试验常选常选豚鼠豚鼠豚鼠豚鼠；生殖发育毒性试验生殖发育毒性试验生殖发育毒性试验生殖发育毒性试验常选常选大鼠大鼠；致癌试验致癌试验致癌试验致癌试验

50、常选常选大鼠大鼠大鼠大鼠 动物数量确定原则动物数量确定原则 即统计学中的样本含量问题，即统计学中的样本含量问题，既要符合统计学既要符合统计学要求，又不致人力、物力、财力、时间的浪费。要求，又不致人力、物力、财力、时间的浪费。动物性别确定原则动物性别确定原则 至少一种，至少一种，各半。某些特各半。某些特殊试验例外，如致癌试验可只用殊试验例外，如致癌试验可只用 性性动物。动物。给药途径选择原则给药途径选择原则 与人类实际接触途径一致。药物与人类实际接触途径一致。药物毒理学研究给药途径同临床。毒理学研究给药途径同临床。但：临床但：临床popo、iv iv，动物只动物只iv iv。单次给药毒性试验动物