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1、精选学习资料 - - - - - - - - - 读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思质粒名称和大小、复制启动子、多克隆酶切位点 MCS、挑选标记基因16 C 连接, 37 C酶切凝胶电泳 pH8.0 带负电1. 基因工程： 又称遗传工程,是通指重组DNA 技术的产业化设计和应用的流程；强调基因克隆、载体构建、遗传转化、性状表达与产品提取及纯化等全部过程；2. 基因操作技术：利用遗传重组技术,在体外通过人工“ 剪切” 和“ 拼接” 等方法,将包含目的基因、特别载体在内的各种必需元件的 体生物细胞内；DNA 分子经过改造和重组后,转入另一受3. 基因： DNA 分子中含有特定遗传信息的一段核苷
2、酸序列；4. 核酸：由很多核苷酸单位通过 长链状化合物；3,5-磷酸二酯键连接起来形成的不含侧链的具有方向性的5. 顺反子（基因同义词） ：在反式构型中不能互补的各个突变型在染色体上所占的一个区域 称为一个顺反子；是一个必需储存完整才具有正常生理功能的遗传物质最小单位；6. 突变子 （muton ）：突变单位, 基因内部有很多突变位点,小的突变单位为 1 个碱基对 bp）突变后产生变异的最小单位； （最7. 重组子（ recon ）：重组单位,基因内部有多个重组单位,不能由重组分开的最小单位；一个基因不是一个突变单位,也不是一个重组单位；8. 断裂基因（ split gene ）：指基因内部被
3、一个或更多不翻译的编码次序即内含子所隔裂；基因都可划分为转录区（转录起始点至转录终止子的区域）和调控区（位于转录起始点 5上游,包括核心启动子、上游启动元件及增强子等序列）结构基因并非都是连续的,原核生物基因是连续的,而真核生物的基因是断裂的9. 内含子（ intron ）：在成熟 mRNA 的片段中未反应出的 DNA 区段；10. 外显子（ extron/exon ）: DNA 序列中被转录成为 mRNA 中的片段；基因中能变成核苷酸序列的是外显子,内含子不能；11. 核小体（ nucleosome ）：在真核生物中,双螺旋的 DNA 分子环绕一蛋白质八聚体进行盘绕,从而形成特别的串珠状结构
4、；核小体结构属于 DNA 的高级结构；核小体是染色体的基本结构单位；12. 重叠基因（ overlapping gene ）：两个或两个以上的基因共有一段 DNA 序列的现象；13. 转座子（ Transposon）：又名转位子、跳动基因（jumping gene ）是一类 DNA 序列,它们能够在基因组中通过转录和逆转录,或在内切酶（显现；Nuclease）的作用下,在其他基因座上转座子的发觉,证明白基因组并不是一个静态的集合,而是一个不断在转变自身构成的动 态有机体；名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页,共 18 页精选学习资料 - - - - - - - - - 读书之法
5、,在循序而渐进 ,熟读而精思14.同源重组：是指发生在DNA 同源序列之间的重组；15.位点特异性重组： 指发生在特异序列之间的重组,仅见于噬菌体的基因组整合到细菌染色体中的过程；16.转座重组： 是指不依靠于序列间的同源性而使一种DNA 次序插入另一种DNA 次序中的重组,因此转座是一种可在染色体的不同区段或不同染色体之间广泛发生的重组；又称为复制重组；17. 基因组 ：是指细胞内遗传信息的携带者 DNA 的总体；18. 组蛋白（ histones）：是指染色体中的碱性蛋白质,其特点是富含二种碱性氨基酸（赖氨酸和精氨酸） ；19. PCR（Polymerase Chain Reaction）
6、：聚合酶链式反应的简称；PCR技术是一种在体外高效快速扩增特定基因或 DNA 序列的方法；20. 电泳 ：带电颗粒在电场作用下向着与其电荷相反的电极移动的过程；21. 载样缓冲液 （ loading buffer ）：待电泳的样品在点样前与之相混合的一种缓冲液；22. 载体（vector）：能携带外源基因进入受体细胞的运载工具,且有完整的复制 （及转录）功能的 DNA 大分子；23. 克隆载体（ cloning vector ）：主要是对目的基因克隆,有复制子即可24. 表达载体（ expression vector ）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体,既有复制子,更要有强启动子25.
7、 穿梭载体（ shuttle vector ）：既可在原核细胞中复制,也可在真核细胞中扩增和表达26. 质粒（plasmid ）：存在于微生物染色体外的小型环状双链 DNA 分子, 基因工程技术中应用最广泛、功能最强大、最易操作的载体；不相容性：同一细胞内不能同时存在两种质粒27.穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector ）：由人工构建的具有两种不同复制起点和挑选标记,因而可在两种不同的寄主细胞存活和复制的质粒载体28.Ampr（氨苄青霉素抗性）RE单一酶切位点的片段,一般为人工拼接29.Tet r（四环素抗性）30.MCS：载体上供外源基因插入的、具有多个而成31. 回文结
8、构 （palindrom ）：以切割序列正中作为轴心,反转对称；同一单链以中心轴对折可形成互补双链；32. 平末端：在识别序列的对称轴上进行切割；33. 粘（黏）性末端：在识别序列的两个对称点切割,产生末端带有单链尾巴的切口；34. 同裂酶：不同的 RE有相同的识别特点,但切割位点不肯定相同 ; 35. 同尾酶：不同 RE识别不同序列 ,但切割后能产生相同的粘性末端,可以连接起来 ; 36. 酶单位（ U）：在最适反应条件下 1 小时完全消化 l g 标准 DNA 所需的酶量为 1 个单位37. 星活力： RE在酶切反应条件转变后识别特异序列的特性降低的一种现象38. DNA 连接酶（ DNA
9、 ligase）：催化双链 DNA 中相邻碱基的 5磷酸和 3羟基间磷酸二酯键形成的酶名师归纳总结 39.DNA 聚合酶：催化dNTP 聚合成 DNA 的酶,主要用于DNA 的体外合成、探针标记等第 2 页,共 18 页40.基因重组 ：DNA 分子间（目的基因和载体）发生共价连接形成重组DNA 分子的过程；41.转化 ：是指感受态的宿主细胞捕获（重组）DNA 分子的过程- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思42.感受态细胞 （ competent cells ）：处于能摄取外界DNA 分子的生理状态的细胞1.绝大多数
10、原核生物的DNA 都是共价封闭的环状双螺旋；2.依据重复程度,可以将DNA 重复序列分为三种类型：单一或轻度重复序列、中等重复序列、高度重复序列；3. 组成染色体的化学成分：DNA、蛋白质, RNA；4. 蛋白质含量约为 DNA 的二倍, RNA含量很少 ,仍不到 DNA 量的 10%；5. 组成染色体的蛋白质分为组蛋白和非组蛋白；6. 染色体外 DNA：线粒体 DNA、叶绿体 DNA、质粒 DNA 7. CTAB（溴化十六烷三甲基铵）,可与多糖、变性蛋白质等结合,提取核酸时除去多糖、脂类等杂质8. pUC18,拷贝数可达 500-700 个；携带抗氨芐青霉素基因,转化细菌后含 pUC18 能
11、生长；仍携带细菌 lacI 和 lacZ 基因编码,使菌落出现蓝色；假如在 lacz 中间插入外源 DNA,破坏半乳糖苷酶活性,生长的菌落就呈白色,作为挑选重组子的标记；9. 聚丙烯酰胺凝胶电泳辨论率高于琼脂糖凝胶电泳10. 载体按功能分为克隆载体、表达载体、穿梭载体；按来源分为质粒载体、噬菌体载体、柯斯质粒载体、真核细胞克隆载体；按受体细胞分为原核生物载体、真核生物载体、 植物基因工程载体、动物基因工程载体11. 具有三种不同的构型：SC型（共价闭合环形 DNA）、OC型（开环 DNA）、L 型（线性 DNA）12. -半乳糖酶 可分解无色的化合物 X-gal 产生 不溶性的蓝色分解物,MC
12、S 在无外源基因插入时不影响 lacZ；插入了外源基因的 MCS影响 lacZ 基因表达, 无 -半乳糖酶产生；因此 在含 X-gal 的琼脂平板上,含非重组质粒的菌菌落是蓝色的、重组菌菌落是白色的13. 型限制性内切酶的应用价值最大；型酶只具限制活性,无甲基化修饰活性；对 DNA的切割要求严格的序列作为靶位点,切割精确；此类酶作用时只需要 Mg2+参加,无需ATP 14.DNA 连接酶主要类型有T4 噬菌体 DNA 连接酶、大肠杆菌DNA 连接酶、 T4 噬菌体 RNA连接酶基因工程（ Gene engineering ）遗传工程（ Genetic engineering ）转基因技术（ T
13、ransgene technology）基因操作技术（Gene opertation/Gene manipulation）分子克隆（ Molecular cloning ）基因克隆（ Gene cloning）基因重组（ Gene recombination ）突变子（ muton ）重组子（ recon）断裂基因（ split gene）内含子（ intron ）外显子（ extron/exon ）核小体（ nucleosome）名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页,共 18 页精选学习资料 - - - - - - - - - 读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思重叠基因（
14、overlapping gene ）转座子（ Transposon）内切酶（ Nuclease）同源重组（ homologous recombination ）位点特异性重组（site-specific recombination ）PCR（Polymerase Chain Reaction）Taq-DNA聚合酶（ Thermus aquaticus 多克隆位点 （Multiple cloning sites ,简称 MCS）分别纯化核酸的原就和要求：应保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子的污染；核酸制备时的留意事项：尽量简化操作步骤,缩短提取过程；尽量削减化学（化学试剂等）核酸的影响；、物
15、理（机械剪切力、高温等）和生物（核酸酶等）因素对假如提取的是 DNA,就需要抑制 DNase 活力,同时仍要防止机械张力拉断；金属离子螯合剂（如 EDTA或柠檬酸钠）、去垢剂 （如 SDS）、蛋白变性剂 （如苯酚、氯仿）都也可使 DNase失活核酸制备中常用酶DNase：降解 DNA RNase：降解 RNA 蛋白酶 K：去除蛋白质溶菌酶：溶解细胞壁（特别是革兰氏阳性菌）核酸的储存储存温度：-70长期储存的良好温度-20也可较长时间储存4短期储存储存介质：TE缓冲溶液 -最常用,首选；水-短期储存可用质粒 DNA 提取溶液 组成：葡萄糖、EDTA、溶菌酶葡萄糖：增加溶液黏度,防止菌体沉淀和 D
16、NA 机械损耗EDTA：抑制 DNAase,有利于溶菌酶作用溶菌酶：水解细胞壁（特别是 G+菌）溶液 组成： NaOH、SDS NaOH：溶解细胞、核酸在pH12 或 3 时会因 H 键解离而变性,0.2mol/LNaOH 会使溶液pH 至 12.6 SDS：溶解膜蛋白破坏细胞膜、使蛋白质变性沉淀溶液 组成： KAc（pH 4.8）名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页,共 18 页精选学习资料 - - - - - - - - - 读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思使溶液 pH 回至中性,质粒 DNA 复性高浓度 K 盐的存在,置换了SDS上的 Na 盐而形成 PDS,有利于大
17、分子染色体DNA、RNA 以及蛋白质凝结而沉淀；溶液 I 要加 RNAase（假如提取的是 RNA,就应当加 DNAase）,葡萄糖让 DNA 重悬（可加溶菌酶,蛋白 EK,破壁）溶液 II：碱变性,让细胞裂解,让蛋白质,基因组 DNA 变性溶液 III：酸复性,醋酸钾,蛋白质,基因组 DNA 复性不了,只有质粒 DNA 复性可能问题及解决方法1、DNA 样品不纯混有多糖、蛋白等重新纯化 DNA 有金属离子残留增加 70乙醇洗涤的次数（2-3 次）DNA 溶解前有乙醇残留重新沉淀 DNA,让乙醇充分挥发2、DNA 降解材料不新奇或反复冻融新奇防止反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性可增加裂解液中
18、螯合剂的含量操作过于猛烈,DNA 被机械打断细胞裂解后的操作应尽量轻柔外源核酸酶污染全部试剂用无菌水配制,耗材经高温灭菌反复冻融将 DNA 分装储存于缓冲液中3、DNA 提取量少试验材料不佳或量少尽量选材新奇破壁或裂解不充分延特长理时间和强度沉淀不完全低温沉淀、延长沉淀时间、加帮助物促进沉淀洗涤时 DNA 丢失洗涤时,最好用枪头将洗涤液吸出,勿倾倒PCR的反应体系标准的 PCR反应体系组成4 种 dNTP混合物 各 200mol/L 引物 各 10 100pmol 模板 DNA 0.12g Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 实操的 PCR反应体系组成反应体系（ 50
19、 l ）：（留意次序 ）名师归纳总结 无菌双蒸水（待定）l 5.5 g 左右 ） 5 第 5 页,共 18 页引物（ 10 M） 1l+1l 模板 DNA 1 g（待定,参考量 0.52 PCR MasterMix 12.5l 总体积 25l - - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思PCR编程 1. 预变性 94, 4min-3min 2. 变性 94 , 45sec-45s 退火 55, 50sec-45s 3.4. 延长 72, 1min-1min 5. 重复 2-4 步骤, 30 次循环 6. 最终延长 72 ,
20、8min-5min 7. 保温 4-20；C储存备用影响 PCR的因素（一） PCR体系各成分的影响：1、模板：模板是待扩增的核酸；单、双链 DNA均可；不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、 DNA结合蛋白类；一般 100ng DNA模板/100L ；模板浓度过高会导致反应的非特异性增加 2、引物浓度：引物是与靶 DNA特异性结合的寡核苷酸片段 引物浓度一般为 0.1-0.5mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配 , 反应特异性下降；：3、Taq-DNA聚合酶（ Thermus aquaticus 0.5-2.5 U/50l 多就反应特异性下降,少就影响产量 4、dNTP：dNTP浓
21、度取决于扩增片段的长度,一般为 20-200mol/L ；四种 dNTP浓度应相等；浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低就降低反应产量 dNTP可与 Mg2+结合,使游离的 Mg2+浓度下降,影响 DNA聚合酶的活性；5、Mg 2+：Mg 2+浓度对 Taq DNA聚合酶的影响很大；一般浓度范畴为 0.5-2mmol/L ；浓度过低会使 Taq 酶活性丢失、产量下降；浓度过高影响反应特异性；Mg 2+可与负离子结合,所以反应体系中 Mg 2+浓度；6、缓冲液：dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页,共 18 页精选学习资料 - - - -
22、 - - - - - 读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思维护 PCR反应体系的 pH; 一般含有 10-50mM Tris-HClpH 8.3-8.8、50mM KCl和适量浓度的 Mg2+；可增加产量、利于退火,但盐浓度过高会抑制 Taq DNA聚合酶的活性；7、其他因素：在反应体系中加入肯定浓度的添加剂如甘油、二甲基亚砜、液体 石蜡等,可提高扩增效率与特异性；（二）反应参数的影响：1、变性：使双链 DNA解链为单链；DNA模板的 GC含量 ,55%的一般为 94-95,45 秒,55% 需 变性温度取决于 要更高变性温度；在循环开头前会在 94,预变性 3-10min 使模板 DNA完
23、全解链；循环程度中变性一般为 94, 30-60 秒；2、退火：使变性模板 DNA与引物复性；退火温度高低与时间的长短取决于引物的长度和 GC含量；一般为 37-55,1-2min ,详细的退火温度可通过设计序列试验来摸索（如利用 梯度 PCR来设计一系列退火温度） ；3、延长：即寡核苷酸引物的延长；在 Taq DNA聚合酶的最适反应温度下进行；一般为 70-72,30-60sec; 详细延长时间取决于扩增片段长度,如：500bp,20sec 500-1200bp,40sec 4、循环次数：主要取决于模板 DNA的浓度；一般为 25-35 次,通常取 30 次；次数过多扩增效率降低、错误掺入率
24、增加；影响电泳分别的因素 生物分子本身的性质：带电荷越多、分子越小、外形越接近球形,电泳迁移速度 越快 电场强度：电场强度越大,电泳速度越快 支持介质：筛孔大小、带电性质 缓冲液： pH、黏度琼脂糖凝胶电泳分别 DNA的原理名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页,共 18 页精选学习资料 - - - - - - - - - 读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思DNA分子在碱性环境中（ pH8.0-8.3 ）带负电荷（磷酸基团） ,外加电场作用下向 正极泳动,不同的 DNA分子,分子量大小及构型不同,电泳时的泳动率就不同,从而分出不同的区带；影响因素 DNA分子大小：分子量越大,迁
25、移速度越慢 DNA的分子构型：超螺旋 线性 开环闭合环状所加电压： 3-5V/cm 电场方向：如脉冲电泳 核酸染料：常用染料溴化乙锭（EB）,嵌入碱基对中,可降低 DNA的迁移率 电泳缓冲液：常用缓冲液 TAE、TBE、TPE 电泳缓冲液：在电泳过程中维护合适的 DNA分子的迁移；TAE：缓冲容量最低,不宜长时间使用；对高分子质量的 DNA辨论率略高；对超螺旋 DNA辨论率略高；pH；使溶液具有肯定的导电性,以利于线状 dsDNA片段在 TAE中比在另两者中迁移速率快 10%；适用于回收 DNA片段的电泳；TBE：缓冲容量高,但成本也略高；对小分子量 DNA（ 1kb）辨论率略高；不宜用于回收
26、 DNA片段的电泳；TPE：缓冲容量高,但成本也略高；不宜用于回收 DNA片段的电泳；电泳操作步骤 制胶 - 放入缓冲液 - 点样 - 电泳 - 观看结果（一）制胶 1. 称肯定量的琼脂糖,加入电泳缓冲液,加热溶解；2. 预备制胶模具,加梳子；3. 倒胶,胶厚一般为 0.3-0.5cm ；4. 冷却凝固,取出梳子,凝胶置于电泳槽中；5. 加入电泳缓冲液,液面高于胶面 1mm 留意事项：名师归纳总结 - - - - - - -第 8 页,共 18 页精选学习资料 - - - - - - - - - 读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思掌握好琼脂糖加热溶解时间 掌握好倒胶时的温度 掌握好胶的厚度
27、 掌握好梳子高度、宽度 留意电泳仪器及缓冲液的使用太短,不溶解；太长,水分蒸发多；低于 45 ,凝固；高于 60 ,使制板变形；太薄,上样量小,易裂；太厚,不易取出梳子,铺张；梳齿与胶板之间有肯定间隙；依据上样量挑选梳子宽度；配胶与电泳槽中缓冲液最好同批次；电泳槽中缓冲液使用次数不宜太多；（二）点样 DNA样品与载样缓冲液混匀；吸取混合液,加入样品孔中；载样缓冲液：待电泳的样品在点样前与之相混合的一种缓冲液；作用：增加样品密度保证 DNA沉入加样孔内 使样品带有颜色易于点样其中的染料在电场中以可猜测的泳动速率向阳极迁移,情形留意事项：掌握好样品与载样缓冲液比例：参考说明书,一般为 buffer
28、 ；掌握好上样量：掌握好枪头的深度：可参考来判定 DNA的电泳5 LDNA+1 Lloading 依据载样缓冲液说明书,按比例混匀样品与载样缓冲液体,样品量不能大于上样孔容积, 否就样品溢出, 交叉污染；一般样品投入量达 50100ng/ 带即可观看到清楚结果, 而对于宝贵 DNA样品就上样量达电泳的最低辨论 率 510ng/ 带也可； 而对于肯定量的 DNA,当电泳时采纳较薄的梳子制胶,就电 泳时 DNA条带相对较窄, 观看较清楚； 而随着电泳时间的延长, 由于 DNA分子本；身有肯定的扩散,电泳条带也会变浅 太浅,样品不易进入孔内；太深,简单损坏样品孔；（三）电泳 设置好电压,接通电源；名
29、师归纳总结 - - - - - - -第 9 页,共 18 页精选学习资料 - - - - - - - - - 读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思依据指示剂迁移位置,判定是否终止电泳；切断电源,取出凝胶,观看结果；留意事项：电极要正确连接,点样孔在负极；电压一般采纳 1-5v/cm（两极间距离）,大片段 DNA可略低,防止拖尾；小分 DNA 可略高些,缩短电泳时间；掌握好电压：电压高,时间短,条带不整齐不清楚；电压低,时间长,条带相对清楚整齐；掌握好电泳槽内缓冲液的量（没过胶 1mm）：太多,电流加大,凝胶发热；（四）检测观看 切断电压,取出凝胶；观看结果、拍照、记录；目前通用方法,用核酸
30、染料对核酸进行染色,通过紫外光进行直接（肉眼）或间 接（凝胶成像仪）观看,或利用相应检测设备捕获荧光信号,进行数据处理（荧 光定量 PCR仪）核酸染料 溴化乙锭（ EtBr,EB ）: 成本较低,致癌剂 GoldView. : 成本较低,毒性有争辩 SYBR GreenI：昂贵,据说是目前毒性最低的染色剂的使用方法 染胶法：制胶时添加,灵敏度最高 染样品法：与核酸样品混合点样,灵敏度最低后染法：电泳完毕后将胶放入染色液中染色一段时间,常见问题及解决方法（一） DNA条带模糊：DNA降解：防止核酸酶污染 电泳缓冲液陈旧：常常更换电泳条件不当：电压不应超过 20V/cm,温度 30；DNA上样量过
31、多：削减凝胶中 DNA上样量缓冲液冲洗, 灵敏度较高名师归纳总结 - - - - - - -第 10 页,共 18 页精选学习资料 - - - - - - - - - 读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思DNA变性：电泳前勿加热（二） DNA条带弱或无 DNA带：DNA的上样量不够：增加 DNA的上样量 DNA降解：防止 DNA的核酸酶污染 DNA跑出凝胶：缩短电泳时间,降低电压,增强凝胶浓度；检测时间源不合适：如（三） DNA带缺失：EB染色的 DNA,应用短波长（ 254nm）的紫外光源检测小的 DNA带跑出凝胶：缩短电泳时间,降低电压,增强凝胶浓度 分子大小相近的 DNA带混在一起,
32、没有分别开： 增加电泳时间, 核准正确的凝胶 浓度 DNA变性：电泳前请勿高温加热 DNA链 DNA链庞大,不适于常规电泳：脉冲电泳载体的基本条件：具自主复制才能；如质粒具有复制起始点 ori 具有供外源 DNA插入的单一 RE酶切位点；如： MCS 具有合适的挑选标记基因,挑选重组；抗药基因如：氨苄青霉素抗性某些表达载体仍具有外源基因的转录和表达才能（除复制子外仍有启动子）较小的分子量, 可容纳较大的外源 数DNA片段,又可在受体细胞内扩增较多的拷贝在细胞内稳固性高,可以使重组体稳固传代而不易丢失表达载体与克隆载体相比仍需具备的条件 一个强启动子及其两侧的调控序列 ; 有 SD序列（mRNA
33、上与核糖体结合的部位）且该序列与起始密码于 ATG之间要有 合适的距离（约 10bp 左右）在克隆基因与启动子之间有正确的阅读框架（方向、核苷酸数量）外源基因下游有转录终止子噬菌体作载体的缘由：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞 自主复制繁衍性能使外源基因在受体细胞中高效扩增 可克隆大分子 DNA 酶切操作过程：依据 RE说明书,建立酶切反应体系 加样：依次加入水、缓冲液、DNA、酶 混匀名师归纳总结 - - - - - - -第 11 页,共 18 页精选学习资料 - - - - - - - - - 读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思肯定温度下保温肯定时间 终止反应 电泳检测酶切
34、结果影响限制性酶切反应的因素（一） DNA样品纯度及分子结构DNA提取过程残留的污染物如：蛋白质、乙醇、抑制酶的活性：EDTA、SDS以及高浓度的盐等会解决方法：加大酶的用量、加大反应总体积、延长反应时间 DNA分子的构型对酶活影响也很大：线性 DNA分子比超螺旋质粒 DNA更易切割 PCR产物往往要加爱护碱基才可正常切割（二） DNA甲基化程度从一般大肠杆菌分别出来的质粒（三）酶切反应温度DNA,由于甲基化,难酶切大多数 RE的正确反应温度是 37 C 实际操作中常采纳水浴锅, 但由于离心管底部与顶部温度不同, 反应体系会蒸发,引起酶反应条件转变,可能会造成酶产生星活力；酶反应时间较短（ 2
35、h 左右 时可在水浴锅内进行,如时间较长,最好在培育箱内 进行反应（四）缓冲液 每一种 RE都具有相应的反应缓冲液；反应缓冲液可能相同也可能不同（盐浓度、缓冲液成分不同）；同一公司 RE的相同的缓冲液一般可以通用,不同公司的一般不能；如不同 RE使用相同缓冲液,可在同一酶切体系中同时进行双酶切；反之,就只能在第一个 RE的酶切（五）操作留意事项RE酶切完成后,进行酚抽提、乙醇沉淀,再进行另一个新购回的 RE应当分装成小份,于 -20 储存,防止反复冻融 由于操作中 DNA样品与 RE的用量都极少,必需严格留意吸样量的精确性要留意酶切时加样的次序：水、缓冲液、取用 RE时要将其放在冰浴内,防止失
36、活 留意要更换枪头,防止 RE污染DNA,最终才加酶液酶切反应中所使用的枪头、 离心管等都要是干净无菌的,使用时用镊子夹取, 不 直接用手去拿,严防手上杂酶污染；当样品在保温反应时,盖子要盖紧,防止水汽进入,增加反应体积,仍要防止标 签脱落；样品酶切期间或完毕后取样电泳前要离心2 秒钟（保温时样品会有水汽冷凝至管名师归纳总结 - - - - - - -第 12 页,共 18 页精选学习资料 - - - - - - - - - 读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思盖及管壁上）；影响连接反应的因素（1）连接酶用量：平末端连接： 1-2 个单位 黏性末端连接： 0.1 个单位（2）反应温度：连接酶
37、最适反应温度为 37该温度会致黏性末端间碱基配对不稳固；常用连接温度在： 15-26（3）载体 DNA和目的 DNA之间比例 一般为 1：3 （4）DNA末端特性：黏性未端连接效率高于平末端连接平末端可采纳加大酶、底物浓度,延长连接时间等方式重组 DNA技术步骤目的基因的猎取 - 载体的挑选和构建 -外源基因与载体的连接 -DNA 导入受体菌 -重组体的挑选 - 克隆基因的表达基因转移 （重组 DNA导入宿主菌）（1）物理方法 裸 DNA直接注射（基因枪）微粒轰击电穿孔 ：利用脉冲电场提高细胞膜的通透性使细胞膜上形成纳米大小的微孔,可 将 DNA转移到细胞中； 该方法简便、 转染效率稳固、 可
38、广泛运用于细胞的基因转 移 显微注射： 在显微镜下, 将 DNA由细胞玻璃针直接注入细胞, 可以将 DNA直接注 入核内,有助于基因的整合与表达；适用于细胞的基因转移（2）化学方法 钙盐转化法：氯化钙转化法（原核表达体系采纳）冰冻！磷酸钙共沉淀法（真核表达体系采纳）（3）生物方法 Ti 质粒 - 土壤根瘤菌 Ri 质粒 - 发根土壤根菌 逆转录病毒 Rv 载体名师归纳总结 - - - - - - -第 13 页,共 18 页精选学习资料 - - - - - - - - - 读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思腺病毒 Ad 载体 腺相关病毒 AAv 载体 单纯疱疹病毒 HSv载体 嵌合病毒载体
39、操作步骤（一）感受态细胞的制备 受体菌的培育 取适量 4离心 10 分钟 弃上清 , 用冷的 0.1mol/L 的 CaCl2 溶液重悬菌体,冰浴后 4离心 弃上清 , 加冷 CaCl2 二次重悬 , 冰浴 , 即为感受态细胞悬液,贮存于-70 可储存 半年；（二）转化 取感受态细胞悬液置冰上, 加入 DNA摇匀 , 冰上置 30 分钟,42水浴中热击 2min,热击后快速置于冰上冷却 3-5 分钟 加入预热液体培育基 , 混匀, 37振荡培育 1 小时左右,取适量涂布于含挑选性 抗生素的挑选平板适温培育 对比：取未转化感受态细胞分别涂布挑选平板（含挑选抗生素）和空白平板留意事项：（1）用于制
40、备感受态的细胞要保证：较好的生长状态：如：不要多次转接、用 70或-20 甘油储存的菌种而不是的培育菌 相宜密度,过高或不足均会影响转化效率：细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好,可通过监测培育液的 OD600来掌握（2）用于转化的质粒要求：质量：主要是超螺旋 DNA 浓度,与转化效率在肯定范畴内成正比：浓度过高或过低均会降低转化效率,一般情形下 ,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的 5；（3）试剂的质量 : 所用的试剂均需是最高纯度, 用超纯水配制 , 分装储存于干燥的冷暗处；（4）防止杂菌和杂 DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行 , 所用器皿是新的 , 并经高压灭菌处理
41、, 且留意防止污染 , 否就均会影响转化效率或杂DNA的转入 , 为以后的挑选、鉴定带来不必要的麻烦；质粒 DNA转化常见问题问题一：转化后无克隆产生名师归纳总结 - - - - - - -第 14 页,共 18 页精选学习资料 - - - - - - - - - 读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思缘由：感受态细胞低效 抗生素使用错误 转化后立刻涂板遗忘温浴 计策：使用高效率的感受态细胞（106 以上）复查质粒抗性,使用正确的抗生素 转化后温浴 45min 左右让抗性基因得以表达 问题二：试验结果显现假阳性或假阴性 缘由：未加诱导剂、显色剂或其失效 抗生素失活,敏锐菌亦能生长 用于制备感受
42、态的菌株退化 计策：检查平板是否含有诱导剂显色剂以及是否新奇 复查抗生素的抗性, 否就重新制备新奇平板用于制备感受态的菌株,传代次数不能太多（20 代以内为佳）重组子的挑选和鉴定 依据载体遗传标记检测 抗药性挑选法：四环素、氨卞青霉素挑选 pBR322质粒 养分缺陷型挑选法： 载体分子上携带某种养分组份的合成基因,而受体细胞本身 不能合成这一养分组份, 将转化细胞涂布在不含此养分组份的培育基上,长出的 便是转化子 显色挑选法：蓝白斑挑选 pUC质粒 依据克隆 DNA序列检测 限制性酶切图谱法：如：质粒 3593bp；目的片段 830bp；就：重组质粒 4.4kb ；PCR检测：以重组质粒为模板 PCR可得到 830bp 的条带 核酸分子杂交：应用放射性标记的特定的 行杂交DNA或 RNA作探针（已知序列） ,与待测的核酸序列进探针只能与互补的特异核酸特异结合,通过检测放射性杂交信号来定位待测序列；DNA测序：最牢靠的检测方法；测序服务已商业化,可很便利地进行；依据外源基因表达产物检测名师归纳总结 - - - - - - -第 15 页,共 18 页精选学习资料 - - - - - - - - - 读书之法