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1、动物细胞工程常用的技术手段 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望动物细胞工程常用的技术手段：动物细胞工程常用的技术手段：动物细胞培养、动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞核移植、动物细胞融合、动物细胞融合、单克隆抗体单克隆抗体动物细胞培养技术动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。是其他动物细胞工程技术的基础。提问：提问：v植物细胞工程常用的技术手段有哪些植物细胞工程常用的技术手段有哪些？植物组织培养植物组织培养,植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物
2、细胞培养和核移植技术动物细胞培养和核移植技术动物细胞培养就是从动物机体内取出相关的组织，动物细胞培养就是从动物机体内取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。中，让这些细胞生长和增殖。1、选材：、选材：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官，动物胚胎或幼龄动物的组织、器官，它们细胞增殖能力强，分裂旺盛，分化它们细胞增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养。程度低，容易培养。v在进行动物细胞培养时，用在进行动物细胞培养时，用胰蛋白酶胰蛋白酶分散分散细胞，说明细胞间的物质主要是细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质蛋白质。动
3、。动物细胞培养适宜的物细胞培养适宜的PH为为7.27.4，此环境下，此环境下胃蛋白酶（胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。的活性较高。2.分散成单个细胞分散成单个细胞3.动物细胞生长特性动物细胞生长特性：细胞贴壁：细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。称为细胞贴壁。要求：要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。贴附。细胞的接触抑制细胞的接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增
4、殖，这种现象称为细胞的接触胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。抑制。4.动物细胞培养过程胚胎成幼龄动物的组织器官（细胞来源）胚胎成幼龄动物的组织器官（细胞来源）单个细胞单个细胞原代细胞原代细胞细胞株细胞株细胞系细胞系剪碎胰蛋白酶剪碎胰蛋白酶分离细胞分离细胞洗涤、稀释、分离洗涤、稀释、分离原代培养原代培养传代培养传代培养（遗传物质没有发生改变）（遗传物质没有发生改变）（遗传物质发生改变）（遗传物质发生改变）细胞细胞悬浮悬浮液液1010代代细胞细胞5050代代细胞细胞无限传无限传代代原代培养原代培养传代培养传代培养细胞株细胞株细胞系细胞系5.5.如何界定原代培养和传代培养；细胞株和如何
5、界定原代培养和传代培养；细胞株和细胞系？细胞系？多数组织细胞固定在表面多数组织细胞固定在表面生长和分裂。生长和分裂。随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖遗传物质改变遗传物质改变动物动物胚胎胚胎或或幼龄幼龄动动物的组织、器官物的组织、器官胰蛋白酶胰蛋白酶剪碎剪碎单个细胞单个细胞加培养液加培养液制成制成细胞细胞悬浮悬浮液液细胞株细胞株细胞系细胞系细胞增值细胞增值无限传代无限传代去掉组织去掉组织间蛋白间蛋白动物细胞培养不能动物细胞培养不能最终培养成生物体最终培养成生物体思考：思考：2、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细
6、胞培养材料？织做动物细胞培养材料？1、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？培培养基有何独特之处？3、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？4、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？终培养成新个体？主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。独特之处有：清等。独特之处有：1、液体培养基、液体培养基 2、成分中有动物血、成分中有动物血清等清等因为这些组织或器官上的细胞生命
7、力旺盛，分裂能力强因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体能发育成新的动物个体5、为什么选用胰蛋白酶做上述处理？、为什么选用胰蛋白酶做上述处理？弹性纤维易被胰蛋白酶分解，从而使细胞分离开来。弹性纤维易被胰蛋白酶分解，从而使细胞分离开来。动物细胞培养条件：动物细胞培养条件：1、无菌、无毒的环境、无菌、无毒的环境（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）2、营养、营养
8、（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等。葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等。）3、温度和、温度和PH 36.5+（-）0.5度,7.2-7.44、气体环境：、气体环境：O2和和CO2（95%空气和空气和5%CO2）保证细胞顺利的保证细胞顺利的生长增殖生长增殖动物细胞培养液的主要成分：动物细胞培养液的主要成分：葡萄糖葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和、氨基酸、无机盐、维生素和动物动物血清血清等。等。与植物培养基相比其特点是：与植物培养基相比其特点是：（1 1）液体培养基）液体培养基（2 2）含有动物血清）含有动物血清动物体细胞大都生动物体细胞大都生活在活在液体液体的环境的环境细胞的全
9、能性细胞的全能性细胞株、细胞系细胞株、细胞系植物体植物体培养结果培养结果获得细胞获得细胞或或细胞产物细胞产物快速繁殖、培育快速繁殖、培育无病毒植株等无病毒植株等培养目的培养目的葡萄糖、动物葡萄糖、动物血清血清蔗糖、植物激蔗糖、植物激素素培养基特有成分培养基特有成分液体培养基液体培养基固体培养基固体培养基培养基性质培养基性质细胞增殖细胞增殖原理原理动物细胞培养动物细胞培养植物组织培养植物组织培养比较项目比较项目植物细胞和动物细胞培养的比较植物细胞和动物细胞培养的比较动物细胞培养应用动物细胞培养应用大规模培养生产生物制品（病毒疫苗、干大规模培养生产生物制品（病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体）扰素、单克
10、隆抗体）作为基因工程中的受体细胞作为基因工程中的受体细胞培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性判断某种物质的毒性为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据据二、动物体细胞核移植技术二、动物体细胞核移植技术:将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。用核移植的方法得到的动物用核移植的方法得到的动物称为克隆动物称
11、为克隆动物核移植核移植胚胎细胞核移植胚胎细胞核移植体细胞核移植体细胞核移植（难度高难度高）受体细胞：受体细胞：M期的期的卵母细胞卵母细胞卵细胞卵细胞母绵羊母绵羊母绵羊母绵羊乳腺细胞乳腺细胞细胞质细胞质细胞核细胞核细胞核移植细胞核移植早期胚胎早期胚胎卵裂卵裂C母绵羊子宫母绵羊子宫胚胎移植胚胎移植多莉羊多莉羊分娩分娩妊娠妊娠多多莉莉羊羊的的培培育育过过程程融合后的卵细胞融合后的卵细胞克隆动物的研究意义克隆动物的研究意义1.1.克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白2.2.改良动物品种改良动物品种 3.3.治疗人类疾病，作为供体治疗人类疾病，作为供体4.4.保护濒危
12、动物保护濒危动物体细胞核移植技术存在的问题：体细胞核移植技术存在的问题：许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。器缺陷，免疫失调等。1 1、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是变的细胞是-（）A A细胞系细胞系 B B细胞株细胞株 C C原代细胞原代细胞 D D传代细胞传代细胞2 2、动物细胞工程技术的基础是、动物细胞工程技术的基础是-（）（）A.A.动物细胞融合动物细胞融合 B.B.单克隆抗体单克隆抗体 C.C.胚胎移植胚胎移植 D.
13、D.动物细胞培养动物细胞培养AD3 3、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞是这样的组织细胞 （）A.A.容易产生各种变异容易产生各种变异 B B具有更强的全能性具有更强的全能性 C.C.取材十分方便取材十分方便 D D分裂增殖的能力强分裂增殖的能力强D 4.4.动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于-（）A.A.培养基不同；培养基不同；B.B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行；动物细胞培养不需要在无菌
14、条件下进行；C.C.动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能；动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能；D.D.动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培 养成植株。养成植株。A1.1.过程：过程：诱导方式诱导方式物理法物理法化学法化学法生物法：生物法：灭活的病毒灭活的病毒仙台病毒仙台病毒紫外线紫外线丧失感染性丧失感染性（不感染细胞）（不感染细胞）保留融合活性保留融合活性（诱导细胞融合）（诱导细胞融合）1.1.过程：过程：2.2.动物细胞培养技术的应用动物细胞培养技术的应用（1 1）生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干扰）生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。素
15、、单克隆抗体等。（3 3）用于检测有毒物质）用于检测有毒物质（2 2）获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮。）获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮。（4 4）用于生理、病理、药理等方面的研究，）用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据为治疗和预防疾病提供理论依据1.其由何种细胞产生？其由何种细胞产生？2.主要分布在哪里？主要分布在哪里？3.如何得到抗体？如何得到抗体？提提问问？抗体抗体1 1。抗原抗原 动物体内动物体内刺激刺激效应效应B 抗原抗原 动物体内动物体内刺激刺激效应效应B 抗体抗体抗原不纯抗原不纯抗体不纯抗体不纯筛选单一效应筛选单一效应B细胞细胞不能增值产生大量抗体不能
16、增值产生大量抗体2 2。特异性差、纯度低；。特异性差、纯度低；产量低、反应不够灵敏产量低、反应不够灵敏设计方案：设计方案：一个一个B B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体淋巴细胞只分泌一种特异性抗体小鼠骨髓瘤细胞能无限增殖小鼠骨髓瘤细胞能无限增殖-化学性质单一、特异性强的抗体。化学性质单一、特异性强的抗体。杂种细胞杂种细胞？诱导其融合的诱导其融合的方法有哪些？方法有哪些？抗原抗原 效应效应B细胞细胞2.2.制备过程：制备过程：B BB B瘤瘤 瘤瘤瘤瘤 瘤瘤细胞融合后培养液中有几种细胞细胞融合后培养液中有几种细胞筛选杂种筛选杂种细胞细胞已知细胞合成已知细胞合成DNA有有D和和S两条途径，其中两条途径
17、，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两条两条DNA合成途径，但一般不分裂增值。鼠合成途径，但一般不分裂增值。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂途径，但能不断分裂增值，将这两种细胞在试管中混合，加增值，将这两种细胞在试管中混合，加PEG促融，获得杂种细胞。促融，获得杂种细胞。主要用于制备主要用于制备单克隆抗体单克隆抗体获得杂种植株获得杂种植株用途用途物理、化学方法物理、化学方法（同左）（同左）灭活的病毒灭活的病毒物理（离心、振物理（离心、振动动、电刺激）电刺激）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）诱导方法诱导方法使细胞分散后
18、诱使细胞分散后诱导细胞融合导细胞融合去除细胞壁后诱去除细胞壁后诱导原生质体融合导原生质体融合细胞融合的方法细胞融合的方法细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性、细胞膜的流动性、植物细胞全能性植物细胞全能性原理原理动物细胞融合动物细胞融合植物体细胞杂交植物体细胞杂交比较项目比较项目植物、动物细胞融合的比较植物、动物细胞融合的比较除通过杂交瘤细胞产生单克隆除通过杂交瘤细胞产生单克隆抗体外，还有什么方法？抗体外，还有什么方法？3.3.单克隆抗体的应用：单克隆抗体的应用：在基础理论研究中具有重要意义在基础理论研究中具有重要意义 在疾病诊断、治疗和预防方面，具有在疾病诊断、治疗和预防方面，具有特异性
19、高、灵敏度高等优越性。特异性高、灵敏度高等优越性。生物导弹生物导弹一种诱导细胞融合的新方法一种诱导细胞融合的新方法一种新细胞一种新细胞灭活病毒灭活病毒杂交瘤细胞杂交瘤细胞一个优势一个优势单克隆抗体特异性强、单克隆抗体特异性强、灵敏度高的优势灵敏度高的优势多多莉莉与与“母母亲亲”卵细胞卵细胞母绵羊母绵羊母绵羊母绵羊乳腺细胞乳腺细胞细胞质细胞质细胞核细胞核细胞核移植细胞核移植早期胚胎早期胚胎卵裂卵裂C母绵羊子宫母绵羊子宫胚胎移植胚胎移植多莉羊多莉羊分娩分娩妊娠妊娠多多莉莉羊羊的的培培育育过过程程融合后的卵细胞融合后的卵细胞克隆动物的研究意义克隆动物的研究意义1.1.用于生物学和医学研究的实验动物用
20、于生物学和医学研究的实验动物2.2.改良动物品种改良动物品种 3.3.治疗人类疾病治疗人类疾病4.4.保护濒危动物保护濒危动物6.6.世界上第一只克隆绵羊世界上第一只克隆绵羊“多莉多莉”的培育等程序如图所的培育等程序如图所示。请仔细看图后回答问题：示。请仔细看图后回答问题：黑面绵羊去黑面绵羊去核卵细胞核卵细胞白面绵羊卵白面绵羊卵腺细胞核腺细胞核重组细胞重组细胞早期胚胎早期胚胎另一头母绵羊子宫另一头母绵羊子宫克隆绵羊多莉克隆绵羊多莉ab电脉冲处理妊娠、出生写出写出、所指的细胞工程、所指的细胞工程各称：各称：。实施细胞工程时，所需的实施细胞工程时，所需的受体细胞大多采用动物卵细胞受体细胞大多采用动
21、物卵细胞的原因是的原因是：。多莉面部的毛色是多莉面部的毛色是 ，判断依据：判断依据：。继植物组织培养之后，克隆继植物组织培养之后，克隆绵羊培育成功，证明动物细胞绵羊培育成功，证明动物细胞也具有也具有 。请举例说明克隆绵羊培育成请举例说明克隆绵羊培育成功的实际意义功的实际意义：。动物的胚胎移植动物的胚胎移植 解决某些妊解决某些妊娠时间长、每胎娠时间长、每胎产子数量少的优产子数量少的优良种畜的繁殖速良种畜的繁殖速度问题。度问题。1 1、科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，、科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨
22、髓疤细胞融合的是（抗体，与骨髓疤细胞融合的是（）A.A.经过免疫的经过免疫的B B淋巴细胞淋巴细胞 B.B.没经过免疫的没经过免疫的T T淋巴细胞淋巴细胞C.C.经过免疫的经过免疫的T T淋巴细胞淋巴细胞 D.D.没经过免疫的淋巴细胞没经过免疫的淋巴细胞A2.动物细胞融合的目的中最重要的是动物细胞融合的目的中最重要的是-（）A.克服远缘杂交不亲和克服远缘杂交不亲和 B.制备单克隆抗体制备单克隆抗体 C.培育新品种培育新品种 D.生产杂种细胞生产杂种细胞3.动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较中，正确的是（动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较中，正确的是（）A.诱导融合的方法完全相同诱导融合的方法完全相同 B.所用的技术手段基本相同所用的技术手段基本相同 B.C.所采用的原理完全相同所采用的原理完全相同 D.都能形成杂种细胞都能形成杂种细胞 AD4.单克隆抗体制备过程中培育的杂交细胞是单克隆抗体制备过程中培育的杂交细胞是-（）A.由小鼠能产生抗体的由小鼠能产生抗体的B淋巴细胞与肝细胞融合淋巴细胞与肝细胞融合 B.由小鼠一个由小鼠一个B淋巴细胞诱导融合而成淋巴细胞诱导融合而成 C.由小鼠一个由小鼠一个B淋巴细胞与肌瘤细胞诱导融合而成淋巴细胞与肌瘤细胞诱导融合而成 D.由小鼠一个由小鼠一个B淋巴细胞与骨髓瘤细胞诱导融合而成淋巴细胞与骨髓瘤细胞诱导融合而成 D