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1、生殖生殖细细胞和体胞和体细细胞一胞一样样，在，在离体条件下也具有离体条件下也具有发发育成完育成完整植株的潜能，取植物的花整植株的潜能，取植物的花药药离体培育可离体培育可获获得得单单倍体植倍体植株，株，这样这样的植株本身在生的植株本身在生产产上没有上没有应应用价用价值值，但在育种，但在育种工作中却有重要的意工作中却有重要的意义义，这这种育种方法就叫种育种方法就叫单单倍体育种。倍体育种。它是先通它是先通过过花花药药离体培育离体培育获获得得单单倍体植株，再倍体植株，再经过经过人工人工诱导诱导(如秋水仙素如秋水仙素处处理理)使染色体数加倍，从而使染色体数加倍，从而获获得能得能稳稳定定遗传遗传的具有的具
2、有优优良性状的良性状的纯纯合子，大大合子，大大缩缩短了育种的年限。短了育种的年限。课题背景课题背景花的结构：花的结构：花梗、花梗、花托、萼片、花瓣、雌蕊和雄蕊花托、萼片、花瓣、雌蕊和雄蕊被子植物花的结构：被子植物花的结构：花粉花粉是是小孢子母细胞小孢子母细胞经过经过减数分裂减数分裂而形成的，而形成的，因此，花粉是因此，花粉是单倍体单倍体的的生殖细胞生殖细胞（一）被子植物的花粉发育（一）被子植物的花粉发育花粉粒的形成花粉粒的形成经验时期：经验时期：四分体时期、单核期、双核期四分体时期、单核期、双核期四分体时期四分体时期（进入单核期）（进入单核期）有丝有丝分裂分裂单核靠边期单核靠边期(小孢子小孢子
3、)单核居中期单核居中期(小孢子小孢子)小孢子小孢子（单核花粉粒）（单核花粉粒）花粉母细胞花粉母细胞（小孢子母细胞）（小孢子母细胞）减数分裂减数分裂精子精子精子精子有丝有丝有丝有丝分裂分裂分裂分裂花粉管细胞核花粉管细胞核生殖细胞核生殖细胞核生殖细胞生殖细胞营养细胞营养细胞双核期双核期两个精子和一个养分核的基因型相同两个精子和一个养分核的基因型相同1 1花花粉母粉母细胞细胞4 4个小个小孢子孢子减分减分有分有分4 4个花粉管细胞核个花粉管细胞核4 4个生殖细胞核个生殖细胞核有分有分8 8个精子个精子花粉粒类型花粉粒类型二核花粉粒二核花粉粒:成熟的花粉粒中，只含花粉管细胞成熟的花粉粒中，只含花粉管细
4、胞核和生殖细胞核。（精子在花粉管中形成）核和生殖细胞核。（精子在花粉管中形成）三核花粉粒三核花粉粒:有些植物的花粉，在成熟前，生殖有些植物的花粉，在成熟前，生殖细胞进行一次有丝分裂，形成两个精子，这样细胞进行一次有丝分裂，形成两个精子，这样的花粉在成熟时，含有一个养分核和两个精子。的花粉在成熟时，含有一个养分核和两个精子。（二）产生花粉植株的两条途径（二）产生花粉植株的两条途径不同植物的诱导成功率很不相同，就同一种不同植物的诱导成功率很不相同，就同一种植物来说亲本的生理状况对诱导成功率也有植物来说亲本的生理状况对诱导成功率也有干脆影响干脆影响选择合适的花粉发育时期是提高诱导成功率的选择合适的花
5、粉发育时期是提高诱导成功率的重要因素重要因素因为并不是任何时期的花粉都可以经过培育产因为并不是任何时期的花粉都可以经过培育产生愈伤组织或胚状体，花粉发育的过程中，只生愈伤组织或胚状体，花粉发育的过程中，只有某一个时期对离体刺激敏感。有某一个时期对离体刺激敏感。花期早期时的花药比晚期的更简洁产生花花期早期时的花药比晚期的更简洁产生花粉植株。粉植株。选材选材（三）影响花药培育的因素（三）影响花药培育的因素一般来说，在单核期，细胞核由中心移向细胞一般来说，在单核期，细胞核由中心移向细胞一侧的时期，花药培育的成功率最高。即：最一侧的时期，花药培育的成功率最高。即：最适合花药培育的小孢子发育时期为单核靠
6、边期适合花药培育的小孢子发育时期为单核靠边期选择单核期以前的花药接种，质地幼嫩，极易选择单核期以前的花药接种，质地幼嫩，极易裂开；裂开；选择单核期之后的花药接种，花瓣已有些松动，选择单核期之后的花药接种，花瓣已有些松动，又给材料的消毒带来困难，且难以选择到单核又给材料的消毒带来困难，且难以选择到单核期的花药。期的花药。花药培育时期的选择花药培育时期的选择其它其它时期选择的缺点时期选择的缺点 花药培育时间花药培育时间为了选择到单核期的花药，通常选择完全未开为了选择到单核期的花药，通常选择完全未开放的花蕾。盛开的或略微开放的花，都不宜选放的花蕾。盛开的或略微开放的花，都不宜选作试验材料。作试验材料
7、。选择完全未开放花蕾的缘由选择完全未开放花蕾的缘由 完全未开放的花蕾，可选择到单核期的花完全未开放的花蕾，可选择到单核期的花药，菌少、易消毒药，菌少、易消毒单核期花药的选择单核期花药的选择一般月季的花药培育时间选在五月初到五月的中一般月季的花药培育时间选在五月初到五月的中旬，即月季的初花期。初花期的花蕾养分状态及旬，即月季的初花期。初花期的花蕾养分状态及生理状态会比较好，可能提高花粉的诱导成功率生理状态会比较好，可能提高花粉的诱导成功率月季花药培育时的花粉粒最好是（月季花药培育时的花粉粒最好是（）A A、四分体时期、四分体时期 B B、单核居中期、单核居中期 C C、单核靠边期、单核靠边期 D
8、 D、二核或三核花粉粒、二核或三核花粉粒C C2 2、培育基：、培育基：花药培育基所接受的培育基可能因植物的不同花药培育基所接受的培育基可能因植物的不同而有所变更小麦中为而有所变更小麦中为N6N6，马铃薯、月季中为，马铃薯、月季中为MSMS，油菜中为，油菜中为B5B5培育基培育基3 3、其他因素、其他因素亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及接种的密度等对诱导成功都有确定的影响接种的密度等对诱导成功都有确定的影响六、试验操作六、试验操作（一）材料的选取（一）材料的选取某些植物的花粉细胞核不易着色，需接受焙某些植物的花粉细胞核不易着色，需接受焙花青花青-
9、铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。蓝黑色。最常用的方法有最常用的方法有醋酸洋红法醋酸洋红法1 1、方法、方法醋酸洋红法染色机理醋酸洋红法染色机理醋酸洋红为醋酸洋红为碱性染色剂碱性染色剂，而花粉细胞内有染色，而花粉细胞内有染色体，染色体主要成分是体，染色体主要成分是DNADNA和蛋白质和蛋白质,易被碱性易被碱性染料着色染料着色染成红色染成红色 。将体积分数将体积分数4545的醋酸的醋酸100ml100ml煮沸，缓缓加煮沸，缓缓加入入1g1g洋红，在加热回流洋红，在加热回流8h8h，冷却至，冷却至5050，过，过滤即可。滤即可。醋酸洋红的配置醋酸洋红的配置
10、2 2、醋酸洋红法、醋酸洋红法将花药放在载玻片上，加一滴质量分数将花药放在载玻片上，加一滴质量分数1 1的醋的醋酸洋红，用镊柄将花药捣碎，盖上盖玻片在显酸洋红，用镊柄将花药捣碎，盖上盖玻片在显微镜下检查。微镜下检查。染色操作染色操作3 3、焙花青、焙花青铬钒法铬钒法将无水酒精与冰醋酸按体积比为将无水酒精与冰醋酸按体积比为3 3：1 1的比的比例混匀例混匀卡诺氏固定液的配制方法卡诺氏固定液的配制方法花药应当在卡诺氏固定液中固定花药应当在卡诺氏固定液中固定20min20min，然后，然后取出放在载玻片上，加焙花青取出放在载玻片上，加焙花青铬钒溶液染色，铬钒溶液染色，盖上盖玻片后在显微镜下检查。盖上
11、盖玻片后在显微镜下检查。将将5g5g铬明矾铬明矾KK2 2SOSO4 4CrCr2 2(SO(SO4 4)24H24H2 2OO加入加入90ml90ml蒸馏水中，溶解后加入蒸馏水中，溶解后加入0.1g0.1g焙花青，混匀焙花青，混匀并加热至沸腾，煮沸并加热至沸腾，煮沸5 5分钟后冷却至室温，过滤，分钟后冷却至室温，过滤，加蒸馏水定容至加蒸馏水定容至100ml100ml。焙花青焙花青铬钒溶液的配制方法铬钒溶液的配制方法染色操作染色操作（二）材料的消毒（二）材料的消毒1 1、酒精处理、酒精处理花蕾用体积分数为花蕾用体积分数为70%70%的酒精浸泡的酒精浸泡3030秒，秒，马上取出。马上取出。无菌水
12、清洗无菌水清洗无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分2 2、消毒液处理、消毒液处理（三）接种和培育（三）接种和培育 放入质量分数为放入质量分数为0.1%0.1%的氯化汞溶液中的氯化汞溶液中2424分分钟（也可质量分数为钟（也可质量分数为1%1%的次氯酸钙溶液或饱和的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液）漂白粉溶液）无菌水冲洗无菌水冲洗3535次次用于培育的花药，事实上多数未熟，由于它的外用于培育的花药，事实上多数未熟，由于它的外面有花萼、花瓣或颖片爱护，通常处于无菌状态，面有花萼、花瓣或颖片爱护，通常处于无菌状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可。所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可。在
13、无菌条件下除去萼片和花瓣用镊子取出花药在无菌条件下除去萼片和花瓣用镊子取出花药要彻底去除花丝，要彻底去除花丝，因为与花丝相连的花药因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成不利于愈伤组织或胚状体的形成马上将花药接种于培育基上，通常每瓶接种花马上将花药接种于培育基上，通常每瓶接种花药药7-107-10个。个。1 1、剥取花药、剥取花药勿损伤花药，以免诱导出非花粉愈伤组织勿损伤花药，以免诱导出非花粉愈伤组织2 2、接种、接种留意：留意：培育条件：温度限制在培育条件：温度限制在2525左右，不须要左右，不须要光照。幼小植株形成后才须要光照。光照。幼小植株形成后才须要光照。3 3、培育、培育培育
14、：一般经过培育：一般经过20-3020-30天培育后，会发觉花药天培育后，会发觉花药开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体长出愈伤组织则将愈伤组织刚好转移到分化培育长出愈伤组织则将愈伤组织刚好转移到分化培育基上，以便进一步分化出再生植株基上，以便进一步分化出再生植株留意：假如花药开裂释放出胚状体，则一个留意：假如花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，必需在花药开花药内就会产生大量幼小植株，必需在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培育基上，否则这些植株将很难分开。育基上，否则这些植株将很难分开。在花药培
15、育中，特殊是通过愈伤组织形成的花在花药培育中，特殊是通过愈伤组织形成的花粉植株，常常会出现染色体倍性的变更（主要粉植株，常常会出现染色体倍性的变更（主要缘由是养分核和生殖核融合造成的），因此还缘由是养分核和生殖核融合造成的），因此还须要对培育出来的植株作进一步的鉴定和筛选。须要对培育出来的植株作进一步的鉴定和筛选。4 4、鉴定和筛选、鉴定和筛选F1花粉花粉单倍体单倍体幼苗幼苗纯合纯合植株植株花药离花药离体培养体培养秋水仙素秋水仙素染色体加倍染色体加倍选择选择新品种新品种YyRrYRYryRyrYYRRYYrryyRRyyrrYRYryRyrYYRR yyrrF1花粉花粉花花 药药 离离 体体 培培 养养秋秋 水水 仙仙 素素 诱诱 导导单倍体植株单倍体植株纯合纯合植株植株