动物病毒学重点相关资料.docx

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1、说明：红色加下划线是罗老师最后上课说（基本上包括），红色是老师平时上课时说要掌握，大家对着课件划一划吧，若有遗漏，可以和我说哈要强调是DNA病毒和RNA病毒分类很重要：(如下)v 具有分段基因组病毒：正粘病毒科：布尼病毒科：砂粒病毒科呼肠孤病毒科： 双RNA病毒科：v 用于病毒分离及培养：细胞培养、鸡胚和实验动物v 病毒有两种形式：一是存在于细胞外具有感染性病毒粒子，二是存在于细胞内可以增值基因组v 天花是人类历史上第一个用疫苗消灭传染病。v 根据病毒宿主性质将其分为： 动物病毒(animal virus) 植物病毒(plant virus) 细菌病毒(bacteria virus), 即噬菌

2、体(bacteriophage or phage)v 病毒结构组成v 衣壳（capsid）：在病毒结构组成中，包围着病毒核酸及其结合蛋白蛋白质鞘，由许多原体以次级键结合形成，具有保护病毒核酸作用，同时也是病毒核酸由一个宿主细胞转移到另一个宿主细胞工具。v 包膜(囊膜)（envelope）: 覆盖在病毒核衣壳外脂蛋白膜。其组成成分主要来自宿主细胞，是病毒核衣壳在感染细胞内穿越核膜或在感染细胞表面“出芽”时由细胞膜获得。v 病毒衣壳对称形式 1、二十面体对称（icosahedral symmetry）2、螺旋对称(helical symmetry) 3、复合对称壳体(complex symmetr

3、y)1、二十面体对称（icosahedral symmetry） 5、3、2构型，或5、3、2次轴对称 二十面体对称有12顶、20面和30棱 以顶点为轴旋转72，其形不变，要转5 次复位 以面为中心，旋转120，其形不变，要转3次复位 以棱为中心，旋转180，其形不变，要转2次复位 故又称5、3、2构型，或5、3、2次轴对称 DNA病毒：虹彩病毒、疱疹病毒、腺病毒、乳多空病毒、细小病毒、圆环病毒、非洲猪瘟病毒、嗜肝DNA病毒 RNA病毒：呼肠孤病毒、双RNA病毒、小RNA病毒、杯状病毒、戊肝病毒、披膜病毒、黄病毒、动脉炎病毒、反转录病毒2、螺旋对称(helical symmetry) 副流感病

4、毒破碎病毒粒子，箭头所指为螺旋对称核衣壳，右图为模式图 呈螺旋对称多为有囊膜病毒，在动物病毒中螺旋对称病毒均属有囊膜单股RNA病毒。 弹状病毒、布尼病毒、副粘病毒、正粘病毒、嵌沙样病毒、丝状病毒科、冠状病毒 3、复合对称壳体(complex symmetry) 由二十面体对称和螺旋对称两部分组成 有尾噬菌体，头部呈二十面体对称，尾部呈螺旋对称。 不规则二十面体结构 T-偶数噬菌体，由两个半个二十面体通过一短六棱柱连接形成。 逆转录病毒 包膜内有一个二十面体对称壳体，壳体内还有由病毒RNA及蛋白质结合形成，可能为螺旋对称核糖核蛋白核心。 呼肠孤病毒 具有两层壳体，内壳体和外壳体均为二十面体对称

5、痘病毒 衣壳无明显对称形式 v RNA病毒：dsRNA:无囊膜分节段-呼肠孤病毒科（10-12节段）、双RNA病毒科（2节段）ssRNA：正粘病毒（7-8节段），布尼病毒（3节段），砂粒病毒（2节段）v 重叠基因（overlapping genes）：基因组特定序列能够以二个或三个不同框架阅读，产生2种或3种有不同氨基酸序列蛋白质。 e.g. PPV、PRRSV 作用：编码更多蛋白质，满足复制和增殖需要，遗传节约原则。v 病毒蛋白质分类 根据是否存在于病毒粒子中分为： v 结构蛋白（Structural protein）v 非结构蛋白（Nonstructural protein）v 结构蛋白（

6、Structural protein）： 构成一个完整、形态成熟病毒颗粒所必需蛋白质。 壳体蛋白 包膜蛋白 存在于病毒体中酶v 非结构蛋白（non-structural protein）： 由病毒基因组编码，但并不结合于病毒颗粒中蛋白质。在病毒复制和增殖过程中发挥一定作用。v 国际病毒分类委员会ICTV（International Committee on Taxonomy of Viruses） v 国际病毒分类及命名规则 一般规则 关于类和病毒命名规则 关于种规则 关于属规则 关于亚科规则 关于科规则 关于目规则 关于亚病毒因子规则 关于书写规则1、病毒分类系统：采用目、科、亚科、属和种等

7、级制度，在种命名尚不完善情况下，许多病毒可用国际通用俗名。2、属是一组具有某些共同特性种。3、属名以“Virus”结尾。 E.g. Pestivirus：瘟病毒属 Coronavirus：冠状病毒属 4、通过一个属名同时需通过一个代表种。5、亚科是一组具有某些共同特性属。6、亚科名以“Virinae”结尾。 E.g. Retrovirinae ：反转录病毒亚科 Spumavirinae：泡沫病毒亚科7、科是一组具有某些共同特性属（不管这些属是否组成了亚科）。8、科名以“Viridae”结尾。 E.g. Herpesviridae：疱疹病毒科 Adenoviridae：腺病毒科 9、通过一个科名

8、同时需通过一个属名。10、目是一组具有某些共同特性科。11、目名以“Virales”结尾。 目 virales 科 viridae 亚科 virinae 属 virus 一些属性不很明确属或暂定属，用引号或后缀“-like viruses”表示，如Norwalk-like viruses。v 国际上通用流感病毒命名方法 Influenza virus 型别/宿主/分离地点/分离株序号/分离年代（血凝素亚型神经氨酸酶亚型） Influenza virus A/Hongkong/1/68（H3N2） H：hemagglutinin N：neuraminidase Influenza virus A

9、/Chicken/Hubei/8/2004(H5N1) Influenza virus A/Duck/Hubei/4/2004(H5N1)v 6个目:v 病毒长期保存1、快速低温冻存 于病毒悬液内加入灭活动物血清或其他蛋白质保护剂和5%-10%DMSO，迅速置-70或-196保存。 含病毒组织材料可以直接低温冰冻保存；或先浸入50%甘油生理盐水中，再低温保存。 2、冷冻干燥 加入保护剂，在真空条件下使冰冻病毒悬液脱水。细胞冻存及复苏基本原则缓慢降温，快速解冻 v 复制（replication）：病毒感染敏感宿主细胞后，在病毒核酸控制下合成子代病毒核酸及蛋白质等成分，然后在宿主细胞内装配成病毒颗

10、粒，再以各种方式释放到细胞外，感染其它细胞，这种增殖方式称复制。v 动物病毒复制周期分为5个主要阶段: 吸附(Adsorption/Attachment) 侵入(Penetration) 脱壳(Uncoating) 病毒成分合成(Synthesis of viral neucleic acid and protein) 装配及释放(Assembly and Release)v 吸附蛋白（virus attachment protein, VAP)： 病毒表面能识别特异细胞受体结构蛋白。主要是壳体蛋白或包膜糖蛋白 -有包膜动物病毒：流感病毒HA、副粘病毒HN糖蛋白、弹状病毒C糖蛋白-无包膜动物病

11、毒：脊髓灰质炎病毒衣壳蛋白上VP1多肽v 动物病毒侵入方式： 细胞内吞(endocytosis) 膜融合(membrane fusion) 直接侵入(direct penetration)v 细胞内吞(endocytosis):有囊膜或无囊膜动物病毒 机制：细胞膜先将病毒粒子包裹，再经膜内陷形成吞噬泡，吞噬泡通过离子泵降低其pH，激活病毒囊膜及吞噬泡膜之间膜融合或激活裂解囊泡酶类，从而释放出病毒粒子。e.g. influenza virus, poxvirus, polyomavirus, reovirus 内吞之后：吞噬泡膜及病毒囊膜融合或吞噬泡裂解v 膜融合（membrane fusion

12、) 病毒囊膜及细胞膜融合过程，在除去囊膜同时，将核衣壳导入到细胞内。有囊膜病毒主要侵入方式，由病毒具有细胞融合活性囊膜糖蛋白介导。v 直接侵入(direct penetration)（移位） 许多无囊膜病毒侵入细胞方式，机理尚不清楚 病毒吸附蛋白及细胞受体结合后，细胞膜流动性引起病毒衣壳蛋白重排和构型变化，加之细胞膜上可能存在水解酶作用，从而导致病毒核酸进入细胞质中，侵入及脱壳同时完成。 病毒衣壳直接进入细胞内。 v 病毒核酸复制和蛋白质合成分成5个连续阶段： mRNA早期转录 mRNA早期翻译 病毒核酸复制 mRNA再度转录（晚期转录） mRNA再度译制（晚期翻译） v 潜伏期（latent

13、 period）：病毒体吸附于宿主细胞（病毒体在培养基中消失）到受染细胞释放出子代病毒体（培养基中重新出现病毒体）所需最短时间。v 隐蔽期（eclipse period）：自感染性病毒在细胞内消失到细胞内出现新感染性病毒之间时间。不同病毒隐蔽期长短不一，如痘病毒10h，脊髓灰质炎病毒24h。v 依赖于病毒流产感染 由缺损病毒引起缺损病毒（defective virus）：基因组中一个或多个复制必需基因缺失或失活病毒。u 缺损病毒种类： 干扰缺损病毒/颗粒(defective interfering virus/particle，DI颗粒) 卫星病毒(satellite virus) 条件缺损病

14、毒(conditional defective virus） 假病毒体(pseudovirion) 干扰缺损病毒/颗粒 defective interfering virus/particle 干扰缺损病毒：在病毒感染时产生一类亚基因组缺失突变体。因失去了亲代病毒基因组中复制必需片段，所以不能单独进行复制，而必需在其同型完全病毒（标准病毒）辅助下，由完全病毒提供DI颗粒已丧失、但又为复制所必需基因功能才能复制。 标准病毒（standard virus,SV）：及DI颗粒相关完全病毒。 l DI颗粒特点： 基因组缺损（亚基因组） 依赖于同源标准病毒复制 干扰同源标准病毒复制 具有及亲代病毒相同对

15、称形式、形态特征、结构蛋白和抗原性DI颗粒至少保留亲代病毒基因组： a)特异性病毒复制酶起始序列 b)病毒壳体化起始识别序列l DI颗粒产生 DNA病毒：DNA复制错误、转座子跳跃、同源重组等 RNA病毒：模板转换（RNA复制酶带着未合成好新生链脱离模板，然后重新结合新模板或原模板新位点继续合成新生RNA链）。l 避免DI颗粒污染病毒制备物方法 用低感染复数（m.o.i）接种病毒和传代 对种子病毒进行克隆纯化（蚀斑纯化）卫星病毒(satellite virus) 卫星病毒：存在于自然界中一种绝对缺损病毒，必须依赖辅助病毒才能复制，但其基因组及辅助病毒基因组无任何同源性。 l 特点: 缺损基因组

16、(存在于自然界绝对缺损病毒,不是辅助病毒缺损病毒) 复制专一性地依赖于辅助病毒 卫星病毒和辅助病毒基因组无同源性l Examples: 腺联病毒(adneo-associated virus, AAV)及腺病毒 肝炎病毒(hepatitis delta virus, HDV)及乙型肝炎病毒(HBV) 卫星烟草坏死病毒(satellite tobacco necrosis virus, STNV)及TNV 大肠杆菌噬菌体P4及P2v 影响病毒表型病毒间相互作用 表型混合 多倍体 互补作用 干扰作用 v 什么是干扰素？干扰素性质l 是一组由多种细胞在适宜诱生剂作用下产生具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节

17、和维持细胞自身稳定等多种生物活性糖蛋白，是一种重要细胞因子。v 病毒感染细胞类型 根据病毒感染后细胞表现不同分为: 溶(杀)细胞性感染 稳定态感染 整合感染1. 杀(溶)细胞性感染 细胞在病毒感染以后，因代谢障碍而迅速死亡（破裂或溶解），大量感染性病毒释出于细胞外体液中，形成新一轮感染。 主要由无包膜、杀伤性强病毒感染引起，如：痘病毒、小RNA病毒。 2. 稳定态感染 病毒感染细胞后，病毒在细胞内增殖，但并不严重影响细胞生命活动，被感染细胞能正常繁殖。 病毒常以出芽方式释放或呈细胞到细胞传播，如：PCV、CSFV、EB病毒、鼠类白血病病毒3. 整合性感染 病毒感染细胞后，病毒核酸整合于细胞染色

18、体内，并随细胞分裂而增殖，使细胞转化或恶性变。 腺病毒、SV40等在容许细胞内产生溶细胞感染而在非容许细胞内形成整合性感染 HIV先将病毒基因组RNA反转录成双链DNA，并整合到宿主细胞基因组上3. 包涵（含）体形成（inclusion body) 细胞被病毒感染以后，在细胞浆或细胞核内出现一些在光学显微镜下可见特殊结构。 病毒核酸和蛋白质在细胞内集中合成和装配成病毒粒子场所（病毒工厂）1）包涵体实质（组成） 病毒体或病毒组分：腺病毒、痘病毒、麻疹病毒。 细胞退行性产物：疱疹病毒。 某些细菌及其毒素、某些化学药物和重金属盐也可引起细胞类似组织学变化。2）包涵体类型 不同病毒感染所形成包涵体形态

19、、染色特性和存在部位各不相同：A. 痘苗病毒：胞浆内嗜酸性包涵体B. 单纯疱疹病毒：核内嗜酸性包涵体，细胞融合形成合胞体C. 呼肠孤病毒：胞浆内核周嗜酸性包涵体D. 腺病毒：核内嗜碱性包涵体E. 狂犬病病毒：胞浆内嗜酸性包涵体F. 麻疹病毒：核内和胞浆内嗜酸性包涵体v 细胞凋亡（1972年由英国Kerr教授首次提出） 细胞为维持内环境稳定，由基因控制细胞自主、有序性细胞死亡形式。由细胞内部和外部刺激诱导所致。 特点： 细胞变圆；胞浆浓缩；核染色质聚集、分块、位于核膜上；核仁裂解，核固缩，形成凋亡小体；细胞核内DNA被核酸内切酶降解为约180-200bp整数倍核酸片段，凝胶电泳图谱呈梯状（DNA

20、 ladder)。v 病毒致病性（病原性）和毒力 病毒致病性：是病毒长期进化过程中形成引起机体感染潜在能力，是病毒“种”特征。 毒力：某一特定毒株致病性，是病毒“株”特征。 v 机体病毒感染类型和发生机制（一）按病程长短分:急性型 亚急性型 慢性型（持续性）持续性感染 指病毒感染机体后，病毒在机体内持续存在，达数月或数年甚至终生但不一定持续增殖或持续引起症状。1) 持续性感染特点：潜伏期长病原体长期存在病变和症状常及免疫病理或免疫缺陷有关，发病常呈进行性，预后大多不良。自然感染宿主范围大多极窄，有遗传倾向。2 ) 持续性感染分类 慢性感染 潜伏感染 慢病毒感染 慢性感染病毒在机体内持续增殖，可

21、不断排出体外，常不引起临床症状，但在机体免疫功能低下时发病，症状长期存在。如：慢性猪瘟、小鼠乳酸脱氢酶增高症、人乙肝、艾滋病特点：不产生疾病，但有感染性病毒持续存在，如乙肝病毒无症状健康带毒者。在后期可能由于免疫病理或肿瘤并发症而引起疾病，如马传染性贫血病毒、艾滋病、鼠类、禽类和猫白血病病毒。 潜伏感染 在急性或隐性感染之后，病毒潜伏存在于一定组织细胞中，在某些条件下，病毒在宿主细胞体内重新增殖和扩散，再次出现及初次感染症状极为相似或截然不同急性发作，而且以后还会反复发生。如：人水痘-带状疱疹病毒、伪狂犬病毒。 慢病毒感染（长程感染） 指病毒有很长潜伏期，此时机体无症状，也分离不出病毒。以后发

22、病呈慢性进行性且最后转归于死亡一种病毒感染。 及慢性感染不同点：疾病过程缓慢，但不断发展而且无例外地死亡。 引起慢病毒感染病原体： 常规病毒：如马传染性贫血病毒、山羊关节炎-脑炎病毒、人麻疹病毒、人和猴免疫缺陷病病毒。 朊病毒：羊痒疫、貂传染性脑病、鹿慢性消耗性疾病、牛海绵状脑病、人库鲁病和克一雅氏病等。 3 ) 持续性感染发生机制（1）病毒因素A、病毒基因组整合到宿主细胞DNA中。如：逆转录病毒、SV40 B、病毒侵犯免疫细胞或在有掩护部位或细胞内增殖。如疱疹病毒隐藏在神经细胞内、人和猴免疫缺陷病毒侵入T4淋巴细胞。 C、病毒抗原发生变异。马传染性贫血病毒D、干扰缺损颗粒（DI）出现。水疱性

23、口炎病毒（VSV）E、病毒无免疫原性。朊病毒（2）机体方面 A、免疫耐受 机体在胚胎或初生期感染某些病毒，免疫组织或细胞再次接触该病毒抗原不产生抗体及细胞免疫，或仅有低反应性免疫应答。 B、只产生非中和抗体：小鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、非洲猪瘟病毒C、干扰素产生能力低下：小鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒感染、乙型肝炎病毒感染、PRRSV D、细胞免疫应答低下： 慢性乙型肝炎患者T细胞对其特异性表面抗原及植物血凝素反应偏低E、宿主细胞遗传因素：不同品系对病毒敏感性不同v 疫苗基本成分： 抗原 佐剂 防腐剂 稳定剂/保护剂 灭活剂v PCR主要步骤： 变性 通过加热（90-95）使DNA模板双链

24、氢键断裂，双链解离成单链DNA。 退火 适当降温（42-62）使引物及其互补模板在局部形成杂交链。 延伸 72，在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷酸底物（dNTPs)及Mg2+存在条件下，引物延长，新链合成 每经过变性、复性、延伸一个循环，模板DNA量增加1倍，新合成DNA链又可作为下一轮循环模板，经过3050个循环，可使原DNA量增加106109倍。v Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 免疫酶技术u 原理 将已知抗原或抗体结合在某种固相载体上，将待检标本和酶标抗体或抗原按不同步骤及固相载体表面吸附抗原或抗体发生反应，再用洗涤方法分离抗原抗体复合

25、物和游离成分，然后加入酶作用底物催化显色，进行定性或定量。HRP底物为过氧化物（H2O2、过氧化脲、葡萄糖-葡萄糖氧化酶系统）。作用原理是催化过氧化氢分解，产生原子态O，后者使底物中供氢体氧化，生成有色氧化型染料。u 常用ELISA方法 间接法 双抗体夹心法 竞争法 阻断ELISA 间接法 用已知Ag包被板子+Ab（未知）+酶标抗Ab+酶底物显色 双抗体夹心法(用于检测Ag)Ab+Ag（未知）+酶标Ab+酶底物显色 竞争法(测定Ag) 利用酶标记Ag和未标记Ag共同竞争有限量Ab，测定样品中Ab。 需同时做只加酶标记Ag系统作对照。 试验组：Ab+待检Ag和酶标记Ag（也可先加待检样品，稍后再加酶标记Ag）。 对照组：只加酶标记Ag。 阻断ELISA 已知Ag包被，加入被检血清，反应后加入抗已知抗原酶标抗体，再加底物v 病毒基本特征（病毒及其它微生物区别）(Lwoff-Tournier, 1966) 不具有细胞结构，也不进行蛋白质、糖和脂类代谢活动 病毒体只含有一种类型核酸：或DNA或RNA 特殊繁殖方式：复制 缺乏完整酶系统，不具备能量合成系统，也不具有核糖体 绝对细胞内寄生 对抗生素不敏感 某些RNA病毒（反转录病毒）RNA经反转录合成cDNA，及细胞基因组整合，并随细胞DNA复制而增殖，即DNA前病毒12 / 12