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1、克隆试剂配制LB液体培养基：取细菌培养用胰蛋白胨10g，细菌培养用酵母提取物5g，NaCl 10g溶于950mL双蒸水中，摇动容器直至溶质完全溶解，用5mol/LNaOH(约0.2mL)调节PH值至7.0，加水定容至1000mL，121，高压灭菌15min，（必要时根据需要进行分装，然后再高压）室温保存。 LB 固体培养基：按上述方法配制液体培养基，每 100ml 加入 1.5g 琼脂粉， 121，高压灭菌15min。从高压锅中取出培养基（注意：不要旋动，否则会发生暴沸），当培养基降温至50-60时，方可加入不耐热抗生素（如氨苄青霉素）。旋动混匀（注意：要避免产生气泡），然后倒至平板。90mm
2、直径培养皿每个约需20ml培养基。0.1mol/L CaCl2 溶液：取 1.12g 无水 CaCl2 溶于 90mL 双蒸水中，加入双蒸水定容至100mL，高压灭菌，4保存。含15%甘油0.1mol/L CaCl2：称取0.56g CaCl2(无水,分析纯) ，溶于50ml重蒸水中，加入15ml甘油，定容至100m，高压灭菌。（也可再分装感受态细胞时再配制）氨苄青霉素：贮存液100mg/ml（水），过滤除菌，避光保存-20，用时取50微升加入50毫升培养基。IPTG：8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后定溶至10ml，0.22um滤器过滤除菌，分装，-20保存。X-gal储液(20mg/ml)
3、: 用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml储液, 包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏, 储存于-20，无须过滤除菌。感受态细胞制备及克隆A.单菌落划线从冰箱取出一管（1.5 ml离心管）保存细菌，用酒精灯上灼烧冷却接种环从中轻刮一下（菌液不要太多），然后在固体平板培养基上画线。画线是一个细菌梯度稀释过程。第一二道线画完后，需要将接种环上细菌烧死，冷却后再在第二道线上继续画线，以后逐次画线。画线完毕将培养皿倒放，37培养箱培养过夜，当单菌落长至1 mm大小时，将培养皿包好放入4冰箱备用。画线熟练时，一个培养皿可以得到分离很好单菌落。B. 感受态细胞制备（1）从新鲜培养16-20h LB
4、平板上挑选一个单菌落挑取大肠杆菌DH5 单菌落接种到5 ml 灭菌LB 液体培养基中37 振荡培养过夜（至出现雾状浑浊）。（2）吸取1 ml菌液加入装有200 ml LB培养基锥形瓶中，37 下在摇床上以中等摇速扩大培养，随时观察细菌长势。当用肉眼观察到培养基中细菌呈现雾状时即可判定此时细菌已经生长到对数期。（3）将培养好细菌分装入50 ml 干净离心管中，冰浴10-15 min。（4）4 下6000 rpm离心10 min 回收细菌沉淀。离心之后可观察到管底有白色团状沉淀。（5）倒掉培养基，每管加入10 ml 预冷0.1 M CaCl2 悬浮细胞。（6）4 下6000 rpm离心10 min
5、 回收细菌沉淀。离心之后可观察到管底有白色团状沉淀。（7）弃去上清，再将离心管倒置以使残留溶液流尽。每管加入2 ml 冰浴0.1M CaCl2，重悬细菌。（8）重悬细菌以200 l 为一份分装到1.5 ml 干净离心管中，置于4 ，（适时放置可提高其感受效率）直接用于转化实验；或加甘油至终浓度为15，混匀，分装成200l 一小份，-70冻存备用。C. 转化（1）每管感受态细胞加入2.5 l 连接产物，吸打均匀，冰浴30 min。（2）42 热击90 sec。（3）冰浴2 min。（4）每管反应体系加入800 l LB 培养基，吸打均匀。（5）37 下在摇床上以中等摇速（200rpm/min）培
6、养45-60 min。（6）室温下下1000 g 离心10 min 回收沉淀。（7）吸出800 l 上清液丢弃，在管底剩余沉淀物中加入16 l X-gal和9l 和IPTG，吸打均匀。（8） 吸取转化产物到LB 培养基平板（内含100g/ml 氨苄青霉素及IPTG 和X-gal）上，均匀涂布，液体被完全吸收后置于37 培养箱中培养过夜。D. 挑取阳性克隆挑取克隆。用灭菌牙签挑取LB 平板上白色单菌落置于装有400 l LB 培养液（含100g/ml 氨苄青霉素）1.5 ml 离心管中，37 下在摇床上以中等摇速培养5-8 h。菌体全部保存于4 。PCR检测。于超净工作台加入2 l菌液为模板，用通用引物和Taq DNA聚合酶进行正常程序PCR反应，电泳检测是否扩增出特异条带，以确定重组子。带有目片断重组子扩增出条带应比PCR扩增产物条带大100 bp-200 bp左右。若用基因特异性引物进行PCR鉴定，插入目片断重组子扩增产物条带应及PCR扩增产物条带一致。阳性克隆菌液保存。重组质粒经过鉴定后，挑选出阳性克隆，在每管中加入一定量100甘油，使每管中甘油终浓度为15。菌液分装于1.5 ml无菌离心管中，用封口膜封口。取一管进行测序分析，剩余菌液放置70超低温冰箱中保存。2 / 2