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1、第一章 绪论1、 何为酶工程，试述其主要内容与任务。 答：1酶工程：酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。2主要内容：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与别离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化，酶非水相催化，酶定向进化，酶反响器与酶的应用等。3主要任务：经过预先设计，通过人工操作获得人们所需的酶，并通过各种方式使酶的催化特性得以改良，充分发挥其催化功能。2、 酶有哪些显著的催化特性？ 答：1酶催化作用的专一性强绝对转移性：一种酶只能催化一种第五进展一种反响；相对专一性：一种酶能够催化一类构造相似的底物进展某种一样类型的反响；2酶催化作用的效率高1071013倍；3酶催
2、化作用条件温与。3、 简述影响酶催化作用的主要因素。 答：1底物浓度的影响：决定酶催化作用的主要因素。酶催化反响速度随底物浓度增加现增加在逐步趋向平衡再反而下降。2酶浓度的影响：底物浓度足够高的条件下，酶催化反响速度与酶浓度成正比。3温度的影响：适宜温度范围内，酶能进展催化反响，最适温度条件下，酶的催化反响速度到达最大。一般60C以上易失活，5C以下活性极低，Taq聚合酶95C下仍稳定。4PH的影响：适宜PH范围内，酶才能显示其催化活性，最适pH条件下，酶催化反响速度到达最大。5抑制剂的影响：在抑制剂的影响下，酶的催化活性降低甚至丧失，从而影响酶的催化功能，有竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性
3、抑制。6激活剂的影响：在激活剂的作用下，酶的催化活性提高或者由无活性的酶生成有催化活性的酶。如Ca、Mg、Co、Zn、Mn、等金属离子与Cl等无机负离子。5、 简述酶活力单位的概念与酶活力的测定方法。 答：概念：在特定条件下温度可采用25C，pH等条件均采用最适条件，每1min催化1mol的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位IU。或在特定条件下，每秒催化1mol底物转化为产物的酶量定义为1Kat. 测定方法：化学测定法，光学测定法，气体测定法。 6、 *酶的开展历史：我国在4000多年前的夏禹时代就已经掌握了酿酒技术；在3000多年前的周朝，就会制造饴糖、食酱等食品，2500多年前的春秋
4、战国时期，就懂得用麥菊来治疗消化不良等疾病；1833年。佩恩与帕索兹从麦芽的水抽提物中用乙醇沉淀得到一种可使淀粉水解生成可溶性糖的物质称之为淀粉酶；19世纪中叶，巴斯德对酵母的乙醇发酵进展大量研究，认为活酵母细胞内有一种可以将糖发酵成乙醇的物质。1878年昆尼首次将酵母中进展乙醇发酵的物质称之为酶；1896年，巴克纳兄弟发现酵母的无细胞抽提液也能将糖发酵成乙醇；1902年亨利根据蔗糖酶催化蔗糖水解的实验结果，提出了中间产物学说；1913年，米彻利斯与曼吞根据中间产物学说，推导出酶催化反响的根本动力学方程米氏方程；1926年，萨姆纳首次从刀豆提取液中别离纯化得到脲酶结晶，并证明它有蛋白质的性质；
5、1960年，雅各与莫诺德提出操纵子学说；1982年切克发现SsRNNA前体具有自我剪接功能，认为RNA也具有催化活性，将这种有催化活性的RNA成为核酸类酶；1983年，阿尔特曼等发现核酸酶。7、 *2种命名法：国际酶学委员会与1961年在“酶学委员会的报告中提出了酶的分类与命名方案，获得了“国际生物化学与分子生物学联合会的批准。此后经过屡次修订，不断得到补充与完善。根据国际酶学委员会的建议，每一种具体的酶都有其推荐名与系统命名：推荐名是在惯用名称根底上，加以选择与修改，一般由两局部组成：底物名称+催化反响的类型+酶，不管酶催化的反响是正反响还是逆反响，都用一个名称，对于水解酶类，可省去“水解；
6、系统命名法更详细、更准确的反映出该酶所催化的反响，系统命名包括了酶的作用底物、酶作用的基团及催化反响的类型。8、 *1蛋白类酶分为六大类：氧化复原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合成酶或连接酶。2核酸类酶：分子内催化R酶：自我剪切酶、自我剪接酶；分子间催化R酶：RNA剪切酶、DNA剪切酶、多肽剪切酶、多糖剪接酶、氨基酸酯剪切酶、多功能酶。9、 *固定化酶的活力测定方法：振荡测定法、酶柱测定法、连续测定法、固定化酶的比活力测定、酶结合效率与酶活力回收率的测定。10、 *酶的生产方法：提取别离法、生物合成法、化学合成法。第二章 微生物发酵产酶1、 试述酶生物合成的根本过程。 答：1RNA的生物
7、合成转录：转录的起始、RNA链的延伸、RNA链合成的终止、RNA前体的加工；2蛋白质的生物合成翻译：氨基酸活化生成氨酰-tRNA、肽链合成的起始、肽链的延伸、肽链合成的终止、蛋白质前体的加工。2、 何谓酶生物合成的诱导作用？简述其原理。 答：参加某些物质使酶的生物合成开场或加速进展的现象，称为酶生物合成的诱导作用。能够引起诱导作用的物质称为诱导物，诱导物一般是酶催化作用的底物或底物类似物。原理：一般来说，不同的酶有各自不同的诱导物，但有些诱导物可以诱导同一酶系的假设干种酶，如半乳糖苷可以同时诱导半乳糖苷酶、透过酶与半乳糖乙酰化酶3种酶，而一种酶往往有多种诱导物，可以根据需要进展选择。当培养基中
8、以乳糖为惟一碳源时，细胞吸收乳糖为别乳糖。别乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白的构造发生改变，从而使它与操纵基因的结合力减弱，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，就使RNA聚合酶可以与启动基因结合，进展转录而合成构造基因所对应的酶。3、 什么是酶生物合成的反响阻遏作用？简述其原理。 答：又称产物阻遏作用，指酶催化反响的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象。引起反响阻遏作用的物质称为阻遏物，阻遏物一般是酶催化反响的产物或是代谢途径的末端产物。原理：当环境中色氨酸浓度增加，阻遏物到达一定程度时，阻遏蛋白与阻遏物结合，使其构造发生改变，从而使阻遏蛋白与操纵基因的结合力增强。阻遏蛋白与
9、操纵基因结合，就排挤RNA聚合物与启动基因的结合，使转录无法进展，酶的生物合成因此受到阻遏。4、 简述分解代谢物阻遏作用的原理与解除方法。 答：指某些物质经过分解代谢产生的物质阻遏某些酶主要是诱导酶生物合成的现象。原理：某些物质经过分解放出能量，有一局部能量储存在ATP中。ATP是由AMP与ADP通过磷酸化作用产生的。细胞内的ATP浓度增加，ADP浓度降低，存在于细胞内的cAMP就通过磷酸二酯酶的作用水解生成AMP。同时腺苷酸环化酶的活化受到抑制而使cAMP 的生成受阻，从而导致细胞内cAMP的浓度降低。这就必然使cAMP-CAP的复合物浓度降低，结果启动基因的相应位点上没有足够的cAMP-C
10、AP复合物结合，RNA聚合酶也就无法结合到其在启动基因的相应位点上，转录无法进展，酶的生物合成收到阻遏。解除方法：分解代谢物阻遏作用以及该阻遏作用的解除，实质上是cAMP通过启动基因对酶生物合成进展调节控制。在培养环境中控制好某些降解物质的量，或在必要时添加一定量的cAMP，均可减少或解除分解代谢物阻遏作用。5、 酶的生物合成有哪几种模式？ 答：1同步合成型：酶的生物合成与细胞生长同步进展。2延续合成型：酶的生物合成在细胞的生长阶段开场，在细胞生长进入平衡期后酶还可以延续合成一段较长时间。3中期合成型：酶在细胞生长一段时间以后才开场，而细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随之停顿。4滞后合成
11、型：在细胞生长一段时间或进入平衡期以后才开场其生物合成并大量积累，又称为非生长偶联型。6、 如何控制微生物发酵产酶的工艺条件？ 答：1细胞活化与扩大培养；2培养基的配制；3pH的调节控制；4温度的调节控制；5溶解氧的调节控制：调节通气量、调节氧分压、调节气液接触时间、调节气液接触面积、改变培养液性质。7、 提高酶产量的措施有哪些？ 答：1添加诱导物2控制阻遏物的浓度3添加外表活性剂4添加产酶促进剂。10、 简述固定化微生物细胞发酵产酶的特点。 答： 提高产酶率；可以反复使用或连续使用较长的时间；基因工程菌的质粒稳定，不易丧失；发酵稳定性好；缩短发酵周期，提高设备利用率；产品容易别离纯化；适用于
12、胞外酶等胞外产物的生产。固定化细胞发酵产酶的工艺条件及其控制：固定化细胞的与培养；溶解氧的供应；温度的控制；培养基组分的控制。11、 固定化微生物原生质体发酵产酶的特点。 答：变胞内产物为胞外产物；提高产酶率；由于有载体的保护作用，稳定性较好，可以连续或重复使用较长时间；易于别离纯化固定化原生质体发酵产酶的工艺条件极其控制：渗透压的控制；防止细胞壁再生；保证原生质体的浓度。12、 *优良的产酶微生物应当具备的条件：酶的产量高；产酶稳定性好；容易培养与管理；利于酶的别离纯化；平安可靠、无毒性。13、 *酶的发酵根据微生物培养方式不同：固体培养发酵、液体深层发酵、固定化微生物细胞发酵、固定化微生物
13、原生质体发酵。14、 *酶生物合成的调节：分解代谢物阻遏作用、酶生物合成的诱导作用、酶生物合成的反响阻遏作用。15、 *组成型酶：在细胞中的量比拟恒定，环境因素对这些酶的合成速率影响不大。适应型酶/调节型酶：在细胞中含量变化大，其合成速率明显受到环境因素的影响。16、 *在DNA分子中，与酶的生物合成有密切关系的基因有4种：构造基因：与多肽链有各自的对应关系。操纵基因：可以与调节基因产生的变构蛋白阻遏蛋白中的一种构造结合从而操纵酶生物合成的时机与合成速度。启动基因：决定酶的合成能否开场，有两个位点，RNA聚合酶结合位点与cAMP-CAP结合位点。调节基因：可以产生一种阻遏蛋白。 构造基因、操纵
14、基因、启动基因一起组成操纵子。17、 *常用的产酶微生物：细菌：大肠杆菌；枯草芽孢杆菌：最广泛淀粉酶、蛋白酶、葡聚糖酶、5-核苷酸酶与碱性磷酸酶。放线菌：链霉菌：葡萄糖异构酶。霉菌：红曲霉可用于生产淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶；黑曲霉；米曲霉；青酶；木霉；根酶；毛酶。酵母：啤酒酵母；假丝酵母。18、 *常用的保藏方法：斜面保藏法、沙土管保藏法、真空冷冻枯燥保藏法、低温保藏法、石蜡油保藏法。19、 *培养基：碳源、氮源、无机盐、生长因子。20、 *最适pH：细菌、放线菌6.58.0；酵母、霉菌46 偏酸；植物细胞56.21、 *诱导物一般分为三类：酶的作用底物、酶的催化反响产物、作用底物的类
15、似物。22、 *发酵动力学包括：细胞生长动力学、产酶动力学/产物生成动力学、机制消耗动力学。产酶动力学主要研究发酵过程中细胞产酶速率以及各种因素对产酶速率的影响规律。产酶动力学模型/产酶动力学方程：RE=dE/dt=(+)X 其中X为细胞浓度，为细胞比生长速率，为生长偶联的比产酶系数，为非偶联的产酶速率，E为酶浓度。第三章 动植物细胞培养产酶2、 何谓抗体酶？试述获得抗体酶的主要方法。答：抗体酶又称催化性抗体，是一类具有生物催化功能的抗体分子。制备抗体酶的主要方法有修饰法：对抗体进展分子修饰，在抗体与抗原的结合部位引进催化基团而成为抗体酶；诱导法：是利用特定的抗原诱导抗体酶合成的方法主要，有半
16、抗原诱导法与酶蛋白诱导法。3、 植物细胞培养产酶有何特点？答：提高产率；缩短周期；易于管理、减轻劳动强度；提高产品质量；其他：对剪切力敏感、生长周期长缺点。5、 试述植物细胞培养产酶的工艺条件及其控制。答：1植物细胞培养的工艺流程：外植体的选择与处理；植物细胞的获取：直接别离法、愈伤组织诱导法、原生质体再生法；细胞悬浮培养；别离纯化。2植物细胞培养的培养基：特点：需要大量无机盐、多种维生素与植物生长激素、无机氮源、蔗糖为碳源；常用：MS培养基无机盐浓度较高，为较稳定的离子平衡溶液，营养成分的种类与比例较适宜，可以满足植物细胞的营养要求，其中硝酸盐的浓度比其他培养基高，故广泛应用于植物细胞、组织
17、与原生质体培养、B5培养基、White培养基、KM-8P培养基。3温度的控制，通常不低于20度不高于35度。4pH的控制：培养基一般是5.55.8之间。5溶解氧的调节控制。6光照的控制。7前体的添加。8刺激剂的应用。6、 动物细胞培养过程中要注意哪些工艺条件。答：1动物细胞培养基的组成成分：氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖、激素、生长因子等。2动物细胞培养基的配制。3温度的控制。4pH的控制。5渗透压的控制。6溶解氧的控制。7、 举例说明动物细胞培养产酶的工艺过程。答：以人黑色素瘤细胞培养产生组织纤溶酶原活化剂tPA为例：1配制人黑色素瘤细胞培养基；2人黑色素瘤细胞培养： 将人黑色素瘤的种质细胞
18、用胰蛋白酶消化处理，细胞分散后，用pH7.4的磷酸缓冲液洗涤，技术，稀释成细胞悬液；在消毒好的反响器中装入一定量的培养液，将上述细胞悬浮液接种至反响器中，浓度为13*103个细胞/mL，于37度的CO2培养箱中，通入5%CO2的无菌空气，培养至长成单层致密细胞；倾去细胞液，用pH7.4的磷酸缓冲液洗涤细胞23次；换入一定量的无血清Eagle培养液，继续培养；每隔34天，取出培养液进展tPA的别离纯化；再向反响器中参加新鲜的无血清Eagle培养液，继续培养，以获得大量tPA。3组织纤溶酶原活化剂的别离纯化。8、 *动物细胞可以采用离心别离技术、杂交瘤技术、胰蛋白酶消化处理技术等获得。动物细胞培养
19、方式有悬浮培养、贴壁培养与微载体培养。动物细胞培养的主要目的是获得疫苗、激素、多肽药物、单克隆抗体、酶、皮肤等人体组织、器官等功能性蛋白质。9、 *植物细胞可以通过机械捣碎或酶解的方法直接从外植体中别离得到。植物细胞培养方式有固体培养、液体悬浮培养等，在次级代谢物的生产中常用液体悬浮培养。植物细胞培养主要用于生产色素、药物、香精、酶等次级代谢产物。10、 *动植物细胞中酶生物合成的调节：细胞分化改变酶的生物合成；基因扩增加速酶的生物合成；增强子促进酶的生物合成；抗原诱导抗体酶的生物合成。11、 *端粒是真核生物染色体的末端构造，作用是保护真核生物的染色体免遭破坏，是通过端粒酶的催化作用而成的。
20、端粒酶是催化端粒合成与延长的酶。12、 *动物细胞培养的特点：主要用于各种功能蛋白质与多肽的生产；动物细胞生长较慢，为防止微生物污染，在培养过程中要添加抗生素青霉素、链霉素；动物细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感，在培养过程中，必须严格控制温度、pH、渗透压、通风搅拌等条件以免破坏细胞；大多数动物细胞具有锚地依赖性，适宜采用贴壁培养，局部细胞可采用悬浮培养。培养基成分复杂，一般要添加血清或其代用品，产品的别离纯化过程较繁杂，本钱较高、适用于高价值药物生产；原代细胞继代培养50代后，即会退化死亡，要重新别离细胞。第四章 酶的提取与别离纯化1、 细胞破碎的方法主要有哪些？各有何特点？答：细胞破
21、碎是通过各种方法使细胞外层构造破坏的技术过程。分类细胞破碎方法细胞破碎原理机械破碎法捣碎法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎研磨法匀浆法物理破碎法温度差破碎法通过各种物体因素的作用，使组织、细胞的外层构造破坏，而使细胞破碎压力差破碎法超声波破碎法化学破碎法添加有机溶剂通过各种化学试剂对细胞膜的作用，从而使细胞破碎添加外表活性剂酶促破碎法自溶法通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，是细胞外层构造受到破坏，从而到达细胞破碎外加酶制剂法特点：机械破碎法：处理量大，破碎效率高，速度快。物理破碎法：处理条件比拟温与，有利于目标产物的高活力释放回收，但破碎效率低，产物释放速度快，处理时间长，不
22、适合大规模细胞破碎的需要。多局限于实验室规模的小批量使用。化学破碎法：优点：比机械破碎法的选择性高，胞内产物总释放率低，料液黏度小，有利于后处理。缺点：通透性差，时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过5%，有些化学试剂有毒。酶促破碎法：优点：选择性释放产物，条件温与，核酸泄出量少，细胞外形完整。 2、 试述酶提取的主要方法。答：酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液的过程，也称为酶的抽提。主要影响因素有：温度、pH、提取液的体积。提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取pH26的水溶液用于提取在稀
23、酸溶液中溶解度大且稳定性较好的酶碱溶液提取pH812的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取与脂质结合结实或含有较多非极性基团的酶3、 简述酶沉淀别离方法的原理与特点。答：沉淀别离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其他溶质别离的技术过程。最多的是硫酸铵沉淀别离方法别离原理盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度的条件下溶解度不同的特征，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质别离。等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性
24、，通过调节溶液的pH，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质别离。有机溶剂沉淀法利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质别离。复合沉淀法在酶液中参加某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质别离。选择变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀而不影响所需的酶，从而使酶与杂质别离。特点：盐析沉淀法：不同浓度的蛋白质浓度产生沉淀所要求的临界浓度不同；蛋白质浓度大时，中性盐极限沉淀低，共沉作用强，分辨率低，但用盐量减少，蛋白质溶解损失小；蛋白质浓度低时相反，中性盐极限沉淀高，共沉作用弱，分辨率高，但用盐量增大，蛋白
25、质回收率低。等电点沉淀法：在溶液的pH等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两性电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀下来；由于在等电点时两性电解质分子外表的水化膜仍然存在，使酶等大分子物质仍有一定的溶解性，而使沉淀不完全；在实际使用时，等电点沉淀法往往与其他方法一起使用；有时单独使用等电点沉淀法主要是用于粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白。 有机溶剂沉淀法：一般比盐析法析出的沉淀易于离心或过滤别离，不含无机盐，分辨率也比拟高；但是有机溶剂沉淀法容易引起酶的变性失活，所以必须在低温条件下操作，而且沉淀析出后要尽快别离，尽量减少有机溶剂对酶活力的影响。 4、 何
26、谓膜别离技术？在酶的生产中有何应用？答：借助一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状与不同特性的物质颗粒或分子进展别离的技术成为膜别离技术。薄膜的作用是选择性的让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。根据物质颗粒或分子通过薄膜的原理与推动力的不同，膜别离可以分为三类：加压膜别离微滤、超滤、反渗透、电场膜别离电渗析、离子交换膜电渗析、扩散膜别离透析。应用：用于酶液或其他溶剂的脱盐，用于酶的别离纯化，酶的浓缩超滤：酶的别离纯化、酶液浓缩、液体酶制剂的生产；反渗透：无离子水的制备、海水淡化；电渗析：酶液或其他溶液的脱盐、海水淡化、纯水制备、其他带电荷小分子的别离；离子交换膜电渗
27、析：酶液脱盐、海水淡化、从发酵液中别离柠檬酸、谷氨酸等带有电荷的小分子发酵产物；透析：酶等生物大分子的别离纯化、从中去除无机盐等小分子物质。5、 简述双水相萃取与超临界萃取的概念与特点。答：1双水相萃取：双水相萃取的两相分别为互不相溶的两个水相。利用溶质在两个互不相溶的水相中的溶解度不同到达别离。双水相萃取中使用的双水相一般由按一定百分比组成的互不相溶的盐溶液与高分子溶液或者两种互不相溶的高分子溶液组成如硫酸铵与聚乙二醇。在双水相系统中，蛋白质、RNA等。特点：含水量高，适宜提取水溶性的蛋白质、酶等生物活性物质，且不易引起蛋白质的变性失活。不存在有机溶剂残留问题。易于放大，各种参数可按比例放大
28、而产物收率并不降低。但别离后的酶浓度较低，需要经过浓缩等提高浓度。2超临界萃取：又称为超临界流体萃取，是利用欲别离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而到达别离的一种萃取技术。在温度与压力超过某物质的超临界点时，该物质成为超临界流体，最常用CO2。特点：具有良好的化学稳定性，对设备没有腐蚀性；临界温度在室温附近或操作温度附近；萃取剂选择性好，易制得高纯度的制品；溶解度高，减少溶剂的循环量。可分为：等压别离、等温别离、吸附别离6、试述凝胶层析、亲与层析、离子交换层析的原理与操作要点。答：1凝胶层析：凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，各组分在层析柱内同时进展两种运动
29、。随着溶液流动而进展的垂直向下的移动无定向的分子扩散运动布朗运动。大分子物质由于直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶微孔内，使小分子物质向下移动的速度比大分子的慢，从而使混合液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，到达别离的目的。操作过程一般包括装柱、上柱、洗脱等过程。 2亲与层析：原理：亲与层析是利用生物分子与配基之间所具有的的可逆的亲与力，使生物分子别离纯化的层析技术。当酶液流经亲与层析试剂时，酶分子与其配基分子结合留在柱内，而其他杂质不与配基结合，可洗涤流出，然后用适当的洗脱液进展洗脱，到达酶的别离纯化。 方
30、法：分子对亲与层析、免疫亲与层析、共价亲与层析、疏水层析、金属离子亲与层析、染料亲与层析、凝集素亲与层析。3离子交换层析：原理：离子交换层析是用离子交换剂上的可解离基团活性基团对各种离子的亲与力不同而到达别离目的的一种层析方法。离子交换剂是含有假设干活性基因的不溶性高分子物质，通过在不溶性高分子物质母体上引入假设干可解离基团活性基团而制成。带电量小，亲与力小的先被洗脱下来，带电量多，亲与力大的后被洗脱下来。操作过程一般包括：装柱、上柱、洗脱与收集、再生。7、 简述凝胶电泳的分类及其原理。答：凝胶电泳是以各种具有网状构造的多孔凝胶作为支持体的电泳技术，凝胶电泳同时具有电泳与分子筛的双重作用，具有
31、很高的分辨率。主要有琼脂糖凝胶电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳，分为1连续凝胶电泳：只用一层凝胶，采用一样的pH与一样的缓冲液。此法配制凝胶时较为简便，但是别离效果稍差，用于组分较少的样品的别离。2不连续凝胶电泳：采用2或3层性质不同的凝胶重叠起来使用，采用2种不同的pH与不同的缓冲液，能使浓度较低的各组分在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨率。样品胶、浓缩胶pH6.76.8、别离胶ph8.88.93梯度凝胶电泳：采用由上而下浓度逐渐升高、孔径逐渐减小的梯度凝胶进展电泳。梯度凝胶用梯度混合装置制成，主要用于测定球蛋白类组分的分子质量。4SDS凝胶电泳：负电荷主要用于蛋白质相对分子质量的测定。8、 酶结晶
32、的主要方法有：盐析结晶法、有机溶剂结晶法、透析平衡结晶法、等电点结晶法。9、*酶的提取别离纯化技术细胞破碎细胞破碎法捣碎法、研磨法、匀浆法物理破碎法温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法化学破碎法添加有机溶剂、添加外表活性剂酶促破碎法自溶法、外加酶制剂法提取盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取、有机溶剂提取沉淀别离盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法、选择性变性沉淀法离心别离差速离心、密度梯度离心、等密梯度离心过滤与膜别离非膜过滤粗滤常压过滤、加压过滤、减压过滤、微滤膜别离技术加压膜别离微滤、超滤、反渗透、电场膜别离电渗析、离子交换膜电渗析、扩散膜别离层析别离吸附层析洗脱方法：
33、溶剂洗脱法、置换洗脱法、前缘洗脱法分配层析纸上层析、薄层层析离子交换层析凝胶层析亲与层析分子对亲与层析、免疫亲与层析、共价亲与层析、疏水层析、金属离子亲与层析、染料亲与层析、凝集素亲与层析层析聚焦电泳别离纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳、等电聚焦电泳萃取别离有机溶剂萃取、双水相萃取、超临界萃取等压、等温与吸附别离、反胶束萃取结晶盐析结晶法、有机溶剂结晶法、透析平衡结晶法、等电点结晶法浓缩与枯燥浓缩、枯燥真空枯燥、冷冻枯燥、喷雾枯燥、气流枯燥、吸附枯燥10、 *要纯的：电泳；要量多的：沉淀；要又纯又多的：层析。11、 *常速/低速离心机最大转速8000r/min；高速离心机(12.5)*10
34、4r/min；超速离心机(2.512)*104r/min。12、 *层析别离：是利用混合液中各组分的物理化学性质分子的大小与形状、分子极性、吸附力、分子亲与力、分配系数等的不同，使各组分以不同比例分布在两相中固定相与流动相。当流动相流经固定相是，各组分以不同的速度移动，从而使不同的组分别离纯化。13、 *电泳：带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程。其移动速度主要决定于其本身所带的静电荷量。14、 *不同电泳的应用范围：1淀粉板薄层电泳：蛋白质、核酸、酶。2薄膜电泳：酶。3凝胶电泳：蛋白质。连续凝胶电泳：组分较少的样品别离；不连续凝胶电泳：静电荷一样的组分也可以别离；梯度凝胶
35、电泳：测定球蛋白类组分的分子质量；SDS-凝胶电泳：蛋白质相对分子质量的测定。4等电聚焦电泳：酶的等电点测定及酶与其他蛋白质的别离。15、 *SDS-凝胶电泳：蛋白质溶液中参加SDS与巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键复原，SDS能使蛋白质分子的氢键、疏水键翻开，并与蛋白质分子结合，形成蛋白质-SDS复合物，由于SDS带负电荷，使各种复合物带上了一样密度的负电荷，而掩盖了原来电荷的差异，此外，SDS与蛋白质结合后，引起蛋白石构象的变化，在水溶液中变成长椭圆形，且长轴的长度与相对分子质量成正比，因此，蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳轰额迁移率不再受原有电荷与分子形状的影响，至于相对分子质
36、量有关。16、 *反胶束：又称反胶团，是外表活性剂分散于连续有机相中形成的纳米尺度的一种聚集体，反胶束溶液是透明的、热力学稳定的系统。外表活性剂是由极性基团与非极性基团组成的两性分子。第五章 酶分子修饰1、 试述酶分子修饰的概念与作用。答：通过各种方法使酶分子的构造发生某些变化，从而改变酶的催化特性的技术过程称为酶分子修饰。通过酶分子修饰，可以使酶分子构造发生某些合理的改变，就有可能提高酶的催化效率、增强酶的稳定性、降低或消除酶的抗原性、改变酶的底物专一性等，同时通过酶分子修饰，研究与了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子与各种物理因素对酶分子空间构象的影响，可以进一步探讨其构造与催化特性
37、之间的关系。2、 何谓金属离子置换修饰？简述其主要修饰过程与作用。答：1把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的催化特性发生改变的修饰方法成为金属离子置换修饰。2方法：酶的别离纯化、除去原有的金属离子、参加置换离子。3作用：说明金属离子对酶催化作用的影响；提高酶的催化效率；增强酶的稳定性；改变酶的动力学特性。3、 何谓大分子结合修饰？有何作用？答：1采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的催化特性的方法称为大分子结合修饰。最广泛修饰剂的选择、修饰剂的活化、修饰、别离2作用：通过修饰提高酶的催化效率；通过修饰可以增强酶的稳定性；通过修饰降低或消除酶蛋
38、白的抗原性。6、简述定点突变技术的主要技术过程及其在酶分子修饰中的应用。答：定点突变是20世纪80年代开展起来的一种基因操作技术，是指在DNA序列中的某一特定位点上进展碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。定点突变技术是氨基酸置换修饰与核苷酸置换修饰的常用方法，也是蛋白质工程的常用技术。1主要过程：新的酶分子构造的设计；突变基因碱基序列确实定；突变基因的获得；新酶的获得。2应用：酪氨酰-tRNA合成酶的修饰是将第51位的苏氨酸由脯氨酸置换，苏氨酸的密码子是ACU、ACC、ACA、ACG，脯氨酸的密码子是CUU、CCC、CCA、CCG，在mRNA上只需将密码子上的第一个A换成C，在对应的基因上只
39、需将T换成G即可到达置换的目的。T4溶菌酶的修饰是将第3位以异亮氨酸密码子为AUU、AUC、AUA，对应基因上的碱基次序为TAA、TAG、TAT置换成半胱氨酸密码子为UGU、UGC，对应基因上的碱基次序为ACA、ACG，只需在对应基因的位点上置换两个碱基，由AC置换TA即可。7、 *酶分子的修饰：金属离子置换修饰；大分子结合修饰；侧脸集团修饰：氨基修饰、羧基修饰碳化二亚胺EDC最普遍，可以在较温与的条件下与酶分子的羧基发生酯化反响，可定量测定酶分子中羧基的数目、巯基修饰、胍基修饰、咪唑基修饰、吲哚基修饰、分子内交联修饰；肽链有限水解修饰；核苷酸链剪切修饰；氨基酸置换修饰：化学修饰法、定点突变技
40、术；核苷酸置换修饰；物理修饰。8、 *酶分子修饰的应用：1在酶学研究方面的应用：酶的活性中心研究；酶的空间构造研究；酶的作用机制研究亲与标记法、差示标记法、氨基酸置换法、核苷酸置换法。2在医药方面的应用：降低或消除酶抗原性；增强医药用酶的稳定性。3在工业方面的应用：提高工业用酶的催化效率；增强工业用酶的稳定性；改变酶的动力学特性。4在抗体酶研究开发方面的应用抗体酶又称催化性抗体，是一类具有催化功能的抗体。5在核酸类酶人工改造方面的应用。6在有机介质酶催化反响中的应用。第六章 酶、细胞、原生质体固定化1、 举例说明常用的固定化方法。答：1酶的固定化方法：吸附法纳米级颗粒，活性炭；包埋法琼脂糖、海
41、藻酸钠：凝胶包埋法、半透膜包埋法；结合法选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方式。离子键结合法、共价键结合法重氮法、EDC是一个氨基与羧基在中性条件下有效结合形成肽键、叠氮法、溴化氰法、烷基化法交联法与结合法区别：有两个功能基团戊二醛是很重要的交联剂，也是很重要的细胞固定化剂，有两个交联基醛基，两个醛基都可以与酶或者蛋白质的游离氨基反响，形成希夫碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定化菌体。由于交联反响条件较为剧烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大热处理法。2细胞固定化的方法：吸附法；包埋法动物细胞吸附：微载体是指颗粒细小的固定化载体，中空纤维由聚丙烯、
42、硅化聚碳酸酯等高分子聚合物制成。3原生质体固定化方法：吸附与包埋常用凝胶包埋法：琼脂-多孔醋酸纤维素固定化法、海藻酸钙凝胶固定化法、角叉菜胶固定化法、光交联树脂固定化法。固定化原生质体可用于氨基酸的生产与胞内酶的生产2、 何谓固定化酶？固定化酶的特性与游离酶比拟有哪些改变？答：固定化酶是指固定在一定载体上并在一定的空间范围内进展催化反响的酶。固定化酶既保持了酶的催化特性，又克制了游离酶的缺乏之处，具有提高酶的催化效率、增加稳定性、可反复或连续使用以及易于与反响产物分开等显著优点。固定化酶的特性：稳定性：热稳定性提高；保存稳定性提高、保存时间较长；对蛋白酶的抵抗性增强、不易被蛋白酶水解；对变性剂
43、的耐受性提高。最适温度：有些与游离酶差不多，有些变化较大。最适pH变化因为有些基团消失。底物特异性其变化与底物分子质量大小有关。3、 固定化酶在工业上有何应用？举例说明之。答：固定化酶的应用：1在工业生产中的应用：氨基酰化酶；葡萄糖异构酶；天冬氨酸酶；青霉素酰化酶用于制造各种半合成青霉素与头孢菌素延胡索酸酶；-半乳糖苷酶；天冬氨酸-脱羧酶；脂肪酶；植酸酶。2在酶传感器方面的应用：酶电极。4、 何谓固定化细胞？固定化细胞有何特点与应用？答：固定在载体上并在一定的空间范围内进展生命活动的细胞称为固定化细胞。通常只能用于胞外酶等胞外产物的生产。1固定化微生物细胞：特点：保持了细胞的完整性与天然状态，
44、可以进展正常的生长繁殖；保持了细胞内原有的酶系、辅酶体系与代谢调控体系，可以按原来的代谢途径进展新陈代谢，并进展有效的代谢调节控制；发酵稳定性好，可以反复或连续使用较长时间；其密度的提高可以提高产率；由于有载体的保护作用，可以提高基因工程菌的质粒稳定性。应用：利用固定化微生物生产各种产物：酒精酒类、氨基酸、有机酸、酶与辅酶、抗生素、甾体转化、废水处理、有机溶剂、维生素、化工产品生产；固定化微生物细胞制造微生物传感器。2固定化植物细胞：特点：由于有载体的保护，可减轻剪切力与其他外界因素对植物细胞的影响，提高植物细胞的存活率与稳定性；细胞经固定化之后，被束缚在一定的空间范围内进展生命活动，不容易聚
45、集成团；固定化植物细胞发酵可以在不同的培养阶段简便的更换不同的培养液，即首先生长培养基中增殖，在到达一定的细胞密度之后，改换成发酵培养基，以利于生产各种所需的次级代谢产物；可反复或连续使用较长一段时间，大大缩短生产周期，提高产率；易于与培养液别离，利于产品的别离纯化，提高产品质量。应用：制造人工种子，生产各种色素、香精、药物、酶等次级代谢产物胞外产物。3固定化动物细胞：特点：提高细胞存活率；提高产率；可反复或连续使用；易于与产物分开，利于产物别离纯化，提高产品质量。应用：主要用于生产各种疫苗、各种激素、酶类、多肽药物及各种组织器官。5、 *酶的一些缺乏之处酶固定化的原因：酶的催化效率不够高；酶
46、的稳定性较差；酶的一次性使用；产品的别离纯化较困难。6、 *酶固定化的历史：1953年的货的格鲁布霍费与施莱思采用聚氨基苯乙烯树脂为载体，经重氮化法活化后，制成固定化酶；1969年，日本的千畑一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革第一次工业固定化酶。7、 *在固定化酶的研究制备过程中，起初都是采用提取与别离纯化后的酶进展固定化，随着技术的开展，也可以采用含酶菌体或菌体碎片进展固定化。第七章 酶非水相催化1、 简述酶非水相催化的概念与特点。答：酶在非水介质中的催化作用称为酶的非水相催化。酶的非水相催化是通过改变反响介质，影响酶的外表构造与活性中心，从而改良酶的催化特性。主要内容包括有机介质中的酶催化、气相介质中的酶催化、超临界流体介质中的酶催化与离子液介质中的酶催化。2、 酶在有机介质中与在水溶液中的特性有何改变？答：酶在有机介质中起催化作用时，由于有机溶剂的极性与水有很大差异，对酶的外表构造、活性中心的结合部位与底物性质都会产生一定的影响。在以下方面表现出与水相介质中不同的催化特性：底物专一性；对映体选择性；区域选择性基因选择性；键选择性；热稳定性；pH特性通常接近或一样。3、什么是必需水与水活度？水对非水相中酶的特性有何影响？ 答：水对有机介质中酶催化的影响：1水对酶分子空间构象的影