第三章 酶的制备与纯化.ppt

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1、第三章第三章 酶的制备与纯酶的制备与纯化化提高酶产量的策略提高酶产量的策略（一）菌种选育（一）菌种选育1.1.诱变育种诱变育种 (1)使诱导型变为组成型使诱导型变为组成型选育组成型突变株选育组成型突变株(2)(2)使阻遏型变为去阻遏型使阻遏型变为去阻遏型 选育营养缺陷型突变株选育营养缺陷型突变株解除反馈阻遏解除反馈阻遏 选育结构类似物抗性突变株选育结构类似物抗性突变株解除分解代谢物阻遏解除分解代谢物阻遏选育抗分解代谢阻遏突变株选育抗分解代谢阻遏突变株2.基因工程育种基因工程育种食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖提高酶产量的策略提高酶产量的策略（一）菌种选育（一）菌种选育2.基因

2、工程育种基因工程育种（二）条件控制（二）条件控制1.1.添加诱导物添加诱导物酶的底物类似物最有效。酶的底物类似物最有效。2.2.降低阻遏物浓度降低阻遏物浓度 除去终产物除去终产物产物阻遏产物阻遏 添加阻止产物形成的抑制剂添加阻止产物形成的抑制剂 避免使用葡萄糖避免使用葡萄糖分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏 避免培养基过于丰富避免培养基过于丰富 添加一定量的添加一定量的cAMPcAMP食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖3.3.添加表面活性剂添加表面活性剂 离子型离子型 对细胞有毒害作用对细胞有毒害作用表面活性剂表面活性剂 Tween Tween8080 非离子型非离子型 增加细胞通透

3、性增加细胞通透性 TritonX TritonX1001004.4.添加产酶促进剂添加产酶促进剂食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖微生物发酵产酶微生物发酵产酶 一、产酶微生物的分离和选育一、产酶微生物的分离和选育 1.1.优良产酶菌种应具备的条件优良产酶菌种应具备的条件 （1 1）酶产量高）酶产量高 （2 2）易培养（生长速率高、营养要求低）易培养（生长速率高、营养要求低）（3 3）遗传性能稳定，不易退化）遗传性能稳定，不易退化 （4 4）易分离提纯）易分离提纯 （5 5）安全可靠（不是致病菌）安全可靠（不是致病菌）食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖 3.3.产

4、酶微生物的分离和筛选产酶微生物的分离和筛选 1)1)样品的采集样品的采集:从富含该酶作用底物的场所采集样品从富含该酶作用底物的场所采集样品 2)2)富集培养富集培养:投其所好，取其所抗投其所好，取其所抗 3)3)分离获得微生物的纯培养（分离获得微生物的纯培养（pure culturepure culture）。）。4)4)初筛：选出产酶菌种，以多为主。初筛：选出产酶菌种，以多为主。5)5)复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖4.4.产酶微生物优良菌种的选育产酶微生物优良菌种的选育 诱变育种诱变

5、育种 原生质体融合育种原生质体融合育种 基因工程育种基因工程育种 酶酶 的的 生生 产产发现大量的酶发现大量的酶选择合适的酶选择合适的酶找出为酶编码的基因找出为酶编码的基因将所需基因转入将所需基因转入生产菌种体内生产菌种体内建立生产方法建立生产方法确保安全确保安全 工业生产工业生产 食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖酶发酵生产的一般工艺流程酶发酵生产的一般工艺流程 食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖l预处理预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞破碎包括固液分离和细胞破碎（分离胞内产物）等。（分离胞内产物）等。l初步纯化初步纯化（roughfrac

6、tionation）（提取）：除去与目提取）：除去与目的产物性质差异很大的杂质。的产物性质差异很大的杂质。l高度纯化高度纯化（finefractionation）（精制）：除去与产精制）：除去与产物性质相似的杂质。物性质相似的杂质。l浓缩与干燥浓缩与干燥（concentrationanddesiccation）（）（成品加成品加工）工）:使酶与溶剂分离的过程。使酶与溶剂分离的过程。二、二、酶的提取与分离纯化酶的提取与分离纯化食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖一、发酵液预处理一、发酵液预处理(一一)发酵液的相对纯化发酵液的相对纯化1.1.无机离子的去除无机离子的去除 2.2.杂蛋

7、白质的去除杂蛋白质的去除3.3.色素及其他物质的去除色素及其他物质的去除第一节第一节 酶的分离酶的分离食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖1.影响发酵液过滤的因素影响发酵液过滤的因素1）菌种）菌种2）培养基组成）培养基组成2.提高过滤性能的方法提高过滤性能的方法1 1）絮凝和凝聚）絮凝和凝聚2 2）稀）稀释、加热释、加热3 3）加助滤剂，）加助滤剂，常用硅藻土等。常用硅藻土等。(二）发酵液的固液分离二）发酵液的固液分离微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎胞外产品：胞外产品：各种胞外酶、胞外多糖、细胞代谢物各种胞外酶、胞外多糖、细胞代谢物细胞本身：细胞本身：单细胞蛋白（单细胞蛋白（SC

8、P）胞内产品胞内产品:碱性磷酸酯酶、基因工程产物、植物细胞产物碱性磷酸酯酶、基因工程产物、植物细胞产物食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖2.1 细胞壁的组成和破碎阻力细胞壁的组成和破碎阻力细菌细菌：肽聚糖，多糖，磷壁酸，主要阻力来自肽聚糖，多糖，磷壁酸，主要阻力来自于肽聚糖的网状结构。于肽聚糖的网状结构。酵母菌：酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质，主要阻葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质，主要阻力来自于壁结构交换的紧密程度和厚度。力来自于壁结构交换的紧密程度和厚度。真菌：真菌：多糖，蛋白质，脂类，葡聚糖，几丁质，多糖，蛋白质，脂类，葡聚糖，几丁质，主要阻力来自于壁强度和聚合物网状结构。主要

9、阻力来自于壁强度和聚合物网状结构。back食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖微生微生物物 革兰氏阳性革兰氏阳性细菌细菌 革兰氏阴性细菌革兰氏阴性细菌 酵母菌酵母菌 霉菌霉菌 壁厚壁厚/nm 15 50 10 13 100 300 100 250 层次层次 单层单层 多层多层 多层多层 多层多层 主要主要组成组成 肽聚糖肽聚糖(40%90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白质蛋白质脂多糖脂多糖(1%2%)肽聚糖肽聚糖(5%10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11%22%)磷脂磷脂蛋白质蛋白质葡聚糖葡聚糖(30%40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)几丁质几丁质(1%2%)蛋白质蛋白质(6%8%

10、)脂类脂类(8.5%13.5%)多聚糖多聚糖(80%90%)脂类脂类蛋白质蛋白质 各种微生物细胞壁的结构与组成各种微生物细胞壁的结构与组成 食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖微生物细胞的破碎技术微生物细胞的破碎技术1微生物细胞的破碎技术微生物细胞的破碎技术2常用的破碎技术常用的破碎技术3破碎方法的影响因素破碎方法的影响因素食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖细胞破碎主要方法细胞破碎主要方法 食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖机械破碎法与非机械法比较机械破碎法与非机械法比较 食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖破碎方法选择原则破碎方法选

11、择原则(1)(1)仅破坏或破碎存在目标生化物质的位置周围仅破坏或破碎存在目标生化物质的位置周围(2)(2)选择性溶解目标生化物质选择性溶解目标生化物质细胞破碎的方法细胞破碎的方法l 机械法机械法 物理法物理法 化学法化学法 生物法（酶解）生物法（酶解）食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖1.1.机械法：机械法：l 1 1）液体剪切：搅拌、匀浆。）液体剪切：搅拌、匀浆。l 2 2）固体剪切：研磨，珠磨，捣碎。）固体剪切：研磨，珠磨，捣碎。2.2.物理法物理法：l 1 1）超声波破碎法。）超声波破碎法。l 2 2）渗透压突变法：高渗（蔗糖，高盐等）渗透压突变法：高渗（蔗糖，高盐等）l

12、 平衡后迅速转入低渗溶液或水中。平衡后迅速转入低渗溶液或水中。l 3 3）冻融法：反复低温冰冻，室温融化。）冻融法：反复低温冰冻，室温融化。食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖3.化学法化学法应用各种化学试剂与细胞膜作用，应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜结构改变或破坏。使细胞膜结构改变或破坏。l1 1）有机溶剂处理：）有机溶剂处理：破坏膜磷脂结构，常用破坏膜磷脂结构，常用丙酮、丁醇、氯仿等丙酮、丁醇、氯仿等。l 2 2）表面活性剂处理：）表面活性剂处理：常用非离子型表面常用非离子型表面活性剂，如活性剂，如Triton X-100Triton X-100，TweenTween

13、等。等。食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖4.4.酶解法（酶解法（e enzymatic lysisnzymatic lysis）：l 外加酶法：外加酶法：根据细胞壁的结构和组成特点，选用适当根据细胞壁的结构和组成特点，选用适当的酶的酶。l 自溶法（自溶法（a autolysisutolysis）细胞结构在本身具有的各种水解酶作用下细胞结构在本身具有的各种水解酶作用下发生溶解的现象。发生溶解的现象。4 破碎方法的影响因素破碎方法的影响因素细胞的数量、破碎条件、破碎目标食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖1.1.直接测定破碎前后的细胞数直接测定破碎前后的细胞数 破碎

14、前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数；破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数；破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。2.2.测定电导率测定电导率 利用破碎前后电导率的变化测定破碎程度。利用破碎前后电导率的变化测定破碎程度。3.3.测定释放的蛋白质量或酶活力测定释放的蛋白质量或酶活力 测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破碎率。破碎率。5.细胞破碎确认细胞破碎确认食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖 把酶从生物组织或细胞中以溶解状态把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽可

15、能多的酶，尽释放出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。量少的杂质从原料中引入溶液。三、酶的提取三、酶的提取(extraction)食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖1.提取目标提取目标a.将将目的酶最大限度地溶解出来。目的酶最大限度地溶解出来。b.保持生物活性。保持生物活性。注意注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活，一：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活，一般般采用低温下（采用低温下（0 0 1010）操作。操作。2.提取原则提取原则na.相似相溶。相似相溶。nb.远离等电点的远离等电点的pH值，溶解度增加。值，溶解度增加。食品与生物工程学院食品与

16、生物工程学院 张海晖张海晖（一）盐溶液提取（一）盐溶液提取 常用稀盐（常用常用稀盐（常用NaClNaCl）溶液（盐溶），）溶液（盐溶），对酶稳对酶稳定性好、溶解度大定性好、溶解度大 ，最常用。，最常用。（二）酸、碱溶液提取（二）酸、碱溶液提取（三）有机溶剂提取（三）有机溶剂提取 3.提取方法提取方法食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖名称名称 转速转速(r/min)(r/min)注意事项注意事项 低速离心机低速离心机 60006000 常温，注意样品热变性和离心常温，注意样品热变性和离心管平衡管平衡 高速离心机高速离心机 6000 25000冷冻（防止温度升高），冷冻（防止温度升

17、高），离心管的精确平衡离心管的精确平衡 超速离心机超速离心机 25000冷冻真空系统（减少空气阻冷冻真空系统（减少空气阻力和摩擦），力和摩擦），离心管的精确平衡离心管的精确平衡 酶的分离纯化酶的分离纯化离心分离离心分离l平衡、定温、定速、定时。平衡、定温、定速、定时。食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖 采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法的颗粒分批分离的方法。特点：特点：分离大小和密度差异较大的颗粒。分离大小和密度差异较大的颗粒。优点：优点：操作简单操作简单。缺点：缺点：1）分离效果较差，分离效果较差，不能

18、一次得到纯颗粒。不能一次得到纯颗粒。2）壁效应严重。）壁效应严重。3 3）沉降的颗粒受到挤压）沉降的颗粒受到挤压。1差速离心差速离心（differential centrifugation）食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖酶的分离纯化酶的分离纯化沉淀分离（根据溶沉淀分离（根据溶解度的不同）解度的不同）l中性盐沉淀（盐析法）中性盐沉淀（盐析法）l有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀l选择性沉淀（热变性和酸碱变性）选择性沉淀（热变性和酸碱变性）l等电点沉淀等电点沉淀l有机聚合物沉淀有机聚合物沉淀食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖1）中性盐的选择）中性盐的选择常用（常用（NH4

19、）2SO4，其突出优点：，其突出优点：la.溶解度大溶解度大lb.分离效果好分离效果好lc.不易引起变性不易引起变性ld.价格便宜价格便宜盐析用盐盐析用盐（一）盐析沉淀法（改变离子强度（一）盐析沉淀法（改变离子强度）食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖盐析操作l低饱和度：低饱和度：饱和溶液滴加法。易于迅速混合均匀，一般饱和溶液滴加法。易于迅速混合均匀，一般终饱和度不超过终饱和度不超过4040。l高饱和度：高饱和度：固体盐添加法。不会大量增加溶液体积。固体盐添加法。不会大量增加溶液体积。l1 1）固体硫酸铵充分研细，温和搅拌中缓慢加入。）固体硫酸铵充分研细，温和搅拌中缓慢加入。l2

20、 2）冰箱中（）冰箱中（4 4）放置过夜，待沉淀完全后高速离心。）放置过夜，待沉淀完全后高速离心。l3 3）沉淀再溶解后可用超滤）沉淀再溶解后可用超滤（ultrafiltrationultrafiltration）、透析透析（dialysisdialysis）或层析或层析（chromatographychromatography）方法脱盐。方法脱盐。食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖1)离子强度离子强度2)蛋白质浓度蛋白质浓度 过稀回收沉淀困难，过浓易共沉淀，过稀回收沉淀困难，过浓易共沉淀，2.5%-3%2.5%-3%最好。最好。3)pH值：值：等电点处最易沉淀。等电点处最易沉

21、淀。4)温度的影响温度的影响 稀盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度提高。稀盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度提高。浓盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度下降。浓盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度下降。一般可在室温下进行。某些对温度敏感的酶，可在一般可在室温下进行。某些对温度敏感的酶，可在04下操作下操作。影响盐析的因素影响盐析的因素食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖 利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。的方法。1.沉淀机理沉淀机理 降低溶液的介电常数降低溶液的介电常数 部分地引起蛋白质脱水部分地引起蛋白质脱水2.常用有机溶剂常用

22、有机溶剂 丙酮丙酮 乙醇乙醇 甲醇，用量一般为酶液体积的甲醇，用量一般为酶液体积的2 2倍左右，终倍左右，终浓度为浓度为70%70%。（二）（二）有机溶剂沉淀（降低介电常数）有机溶剂沉淀（降低介电常数）溶剂极性越大，介电常数越大溶剂极性越大，介电常数越大食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖3.有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 优点优点：1）分辨率比盐析法高分辨率比盐析法高 2）沉淀不需脱盐沉淀不需脱盐 3）溶剂易蒸发，沉淀易离心）溶剂易蒸发，沉淀易离心 缺点：缺点：1）容易引起蛋白质变性失活）容易引起蛋白质变性失活 2）有机溶剂易燃、易爆有机溶剂易燃、易爆食品与生物工程学院食品与生物

23、工程学院 张海晖张海晖4.操作注意事项操作注意事项（1 1）温度）温度 ：低温（低温（0 0）操作。）操作。（2 2）pH pH 值：值：尽可能靠近其等电点。尽可能靠近其等电点。（3 3）离子强度：）离子强度：采用采用 0.05mol/L0.05mol/L的稀盐溶液的稀盐溶液 增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度 目的防止蛋白质变性目的防止蛋白质变性 （4 4）蛋白质浓度：）蛋白质浓度：适当，一般为适当，一般为5 52020mg/ml mg/ml 食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖（三）（三）等电点沉淀等电点沉淀(isoelectric precipit

24、ation)(isoelectric precipitation)1.原理原理 蛋白质在等电点时溶解度最低蛋白质在等电点时溶解度最低 不同的蛋白质具有不同的等电点不同的蛋白质具有不同的等电点 2.使用方法使用方法 单单独独使使用用较较少少（用用于于从从粗粗酶酶液液中中除除去去某某些些等等电电点点相相距距较较大大的的杂杂蛋蛋白白），多多与与其其它它方方法法联联合合使使用用（如如盐盐析析法法、有有机机溶溶剂剂法法），因因蛋蛋白白质质在在等等电电点点时时仍仍有有一一定定的的溶解度。溶解度。食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖3.优点：优点：1）大多数蛋白质的）大多数蛋白质的pI都在偏酸

25、性范围内都在偏酸性范围内 2）无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低）无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低 3）无需除掉多余酸即可进行下一步纯化）无需除掉多余酸即可进行下一步纯化4.缺点：缺点：酸化时，容易引起蛋白质失活酸化时，容易引起蛋白质失活 食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖（四）有机聚合物沉淀法（四）有机聚合物沉淀法1.作用机理：作用机理：降低介电常数、竞争水降低介电常数、竞争水。2.沉淀剂：沉淀剂：常用常用聚乙二醇聚乙二醇 （Polyethyeneglycol，简写，简写PEGPEG）多用分子量为多用分子量为600020000的的PEG。3.优点：优点：操作条件温和，不

26、易引起生物大分子变性。操作条件温和，不易引起生物大分子变性。沉淀效能高，使用少量的沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当即可沉淀相当多的生物大分子。多的生物大分子。沉淀后有机聚合物容易去除。沉淀后有机聚合物容易去除。食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖（五）选择性变性沉淀法（五）选择性变性沉淀法 选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性沉淀而不选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法。影响所需蛋白质的方法。热变性热变性 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，加热升高温度使杂加热升高温度使杂蛋白变性沉淀而保留目

27、的物在溶液中。蛋白变性沉淀而保留目的物在溶液中。pH变性变性等电点沉淀法是等电点沉淀法是pH变性法中的一种变体。变性法中的一种变体。有机溶剂变性有机溶剂变性使那些对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。使那些对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖六、萃取（六、萃取（extraction）分离）分离 利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法。而使溶质得到纯化或浓缩的方法。特点：特点：1）比化学沉淀法分离程度高）比化学沉淀法分离程度高2）比离子交换法选择性好、传质快）比离子交换法选择性好、传

28、质快3）比蒸馏法能耗低）比蒸馏法能耗低 食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖普通有机溶剂萃取难以进行蛋白质的分离普通有机溶剂萃取难以进行蛋白质的分离1）蛋白质亲水性，不溶于有机溶剂蛋白质亲水性，不溶于有机溶剂2）蛋白质在有机相中易变性失活蛋白质在有机相中易变性失活故溶剂萃取法一般仅用于抗生素等小分子生物物质故溶剂萃取法一般仅用于抗生素等小分子生物物质的提取。的提取。（一）溶剂萃取法（一）溶剂萃取法（二）（二）双水相萃取技术双水相萃取技术 用用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙，如聚乙二醇（二醇（PEGPEG）和葡聚糖（）和葡聚糖（De

29、xtranDextran）进行萃取。由于形）进行萃取。由于形成的两相均有很高的含水量（达成的两相均有很高的含水量（达70%70%90%90%），故称），故称“双水相双水相”系统。系统。食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖（四）（四）反胶团萃取反胶团萃取1.反胶团：反胶团：又称反胶束（又称反胶束（Reversed Micelles）指指表面活性剂表面活性剂（由亲水的极性基团和疏水的非由亲水的极性基团和疏水的非极性基团两部分组成）分散在连续极性基团两部分组成）分散在连续有机有机 溶剂溶剂中自中自发形成的一种稳定的纳米级的聚集体发形成的一种稳定的纳米级的聚集体。食品与生物工程学院食品与

30、生物工程学院 张海晖张海晖2.优点优点1）萃取率和反萃取率高。）萃取率和反萃取率高。2）分离浓缩同时进行，溶剂可反复利用。）分离浓缩同时进行，溶剂可反复利用。3 3）解决胞内酶在非细胞环境中迅速失活问题。解决胞内酶在非细胞环境中迅速失活问题。4）破壁功能，直接从完整细胞提取酶蛋白。）破壁功能，直接从完整细胞提取酶蛋白。5）成本低。）成本低。食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖 第二节第二节 酶的精制酶的精制 酶纯化的基本原则：酶纯化的基本原则：建立一个方便灵敏的分析方法；建立一个方便灵敏的分析方法；选择有效的纯化方法，尽可能减少纯化步骤；选择有效的纯化方法，尽可能减少纯化步骤；常

31、在低温（常在低温（44）条件下进行纯化，避免酶变性。）条件下进行纯化，避免酶变性。食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖（一）（一）扩散膜分离扩散膜分离透析透析（dialysis）溶质分子溶质分子Y从高浓度一侧通过膜向低浓度一侧移动从高浓度一侧通过膜向低浓度一侧移动一、膜分离一、膜分离借助一定孔径的高分子薄膜，将借助一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、形状、性质的颗粒或分子不同大小、形状、性质的颗粒或分子进行分离的技术。进行分离的技术。食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖 1.透析膜透析膜 商品透析膜大多制成管状商品透析膜大多制成管状。材料：纤维素衍生物。材料：纤维素衍

32、生物。1）透析膜的预处理：）透析膜的预处理：目的目的除杂质。除杂质。2）透析袋的保存）透析袋的保存：防腐剂冷藏。防腐剂冷藏。食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖（二）加压膜分离（二）加压膜分离根据所截留物质颗粒大小的不同，分为根据所截留物质颗粒大小的不同，分为：截留颗粒截留颗粒直径直径操作压力操作压力应用应用微滤微滤0.22 m0.1MPa除菌除菌超滤超滤20A 0.2 m0.1 0.7MPa分离病毒及分离病毒及生物大分子生物大分子反渗透反渗透20A0.7 13MPa纯水制备纯水制备食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖微滤微滤(MicrofiltrationMicr

33、ofiltration，MF)MF)一种静态过滤，随过滤时间延长，膜面上一种静态过滤，随过滤时间延长，膜面上截流沉积不溶物，引起水流阻力增大，透水速截流沉积不溶物，引起水流阻力增大，透水速率下降，直至微孔全被堵塞；率下降，直至微孔全被堵塞；食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖超滤超滤(ultrafiltrationultrafiltration，UFUF)一种动态过程，由泵提供推动力，在膜表一种动态过程，由泵提供推动力，在膜表面产生两个分力：一个是垂直于膜面的方向分面产生两个分力：一个是垂直于膜面的方向分力，使水分子透过膜面，另一个是于膜面平行力，使水分子透过膜面，另一个是于膜面

34、平行的切向力，把膜面截流物冲掉。的切向力，把膜面截流物冲掉。反渗透反渗透（Reverse osmosisReverse osmosis，RORO）利用反渗透膜选择性地只能透过溶剂利用反渗透膜选择性地只能透过溶剂(通常是水通常是水)的性质，对溶液施加压力，使的性质，对溶液施加压力，使溶剂通过反渗透膜而从溶液中分离出来的溶剂通过反渗透膜而从溶液中分离出来的过程。过程。食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖二、层析法二、层析法（Chromatography)利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系

35、数等），使各组分在子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在流动相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移动流动相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移动而达到分离的目的。而达到分离的目的。紫外吸收法紫外吸收法蛋白质定量蛋白质定量-分光比色仪分光比色仪(A280)法法食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖1.基本原理基本原理 大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；下移动，并最先被洗脱出来；小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出层析柱。小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出层

36、析柱。（二）凝胶过滤层析（二）凝胶过滤层析4.应用应用1）脱盐）脱盐)生物大分子物质生物大分子物质的的分离纯化分离纯化3）分子量的测定）分子量的测定4）溶液）溶液浓缩浓缩食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖（三）离子交换层析（三）离子交换层析 （ion exchange chromatography，IEC）1.1.原理原理:根据待分离物质带电性质不同的分离根据待分离物质带电性质不同的分离 纯化方法。纯化方法。两种离子交换剂两种离子交换剂l阴离子交换剂阴离子交换剂：l常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羟丙基羟丙基l阳离子交换剂阳离子交换剂：l常用羧甲

37、基常用羧甲基CMCH2COOl磺丙基磺丙基SPC3H6SO3食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖 （四）亲和层析四）亲和层析(Affinity Chromatography)(Affinity Chromatography)由吸附层析发展起来的由吸附层析发展起来的，是从复杂混和物，是从复杂混和物中纯化蛋白质的最好方法。中纯化蛋白质的最好方法。原理：利用生物大分子间特异的亲和力来纯化生原理：利用生物大分子间特异的亲和力来纯化生物大分子，如：抗原和抗体；酶和底物或辅酶或物大分子，如：抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体；抑制剂；激素和受体；RNA和其互补的和其互补的DNA等

38、。等。食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖2.基质的选择基质的选择理想的基质应满足以下要求：理想的基质应满足以下要求：高度的亲水性。高度的亲水性。极低的非特异性吸附极低的非特异性吸附性（惰性）。性（惰性）。具有足够的化学基团。具有足够的化学基团。适当的多孔性。适当的多孔性。较好的理化稳定性。较好的理化稳定性。可被应用的基质（载体）可被应用的基质（载体）：（按性能优劣排序）琼脂糖凝胶、聚丙稀酰（按性能优劣排序）琼脂糖凝胶、聚丙稀酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素。胺凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素。最常用的是最常用的是琼脂糖，琼脂糖，Sepharose 1BSepharose 1B到到10B10

39、B食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖3.配体的选择配体的选择一对可逆结合的生物分子中与载体相偶一对可逆结合的生物分子中与载体相偶联的一方称配体。联的一方称配体。如抑制剂，底物，抗体，如抑制剂，底物，抗体，辅酶等。辅酶等。优良配体须具备的条件：优良配体须具备的条件：1）与待纯化的物质有较强的亲和力。）与待纯化的物质有较强的亲和力。2）具有与基质共价结合的基团。）具有与基质共价结合的基团。食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖所要分离的目所要分离的目的产物的产物 相应的配基相应的配基 酶酶抗体抗体凝集素凝集素激素激素底物、抑制剂、辅酶（辅因子）底物、抑制剂、辅酶（辅因子

40、）抗原、病毒、细胞抗原、病毒、细胞多糖、糖蛋白、细胞受体多糖、糖蛋白、细胞受体受体、载体蛋白受体、载体蛋白 目的产物与相应的配基目的产物与相应的配基食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖2）引入连接臂）引入连接臂（spacearm）又称手臂（又称手臂（spacer）“接臂接臂”的目的：的目的：克服克服影响配基与生物大分子的结合的影响配基与生物大分子的结合的空间障碍空间障碍。“接臂接臂”的途径：的途径：常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。目前带有各种手臂的系列载体已有商品供应。如：目前带有各种手臂的系列载体已有商品供应。如：AH-Sep

41、harose 4BAH-Sepharose 4B食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖第三节第三节 电泳电泳n 电泳电泳（electrophoresis,EPelectrophoresis,EP）：n 指带电粒子在电场中向着与其所带电荷指带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动的过程。性质相反的电极方向移动的过程。n 电电泳泳技技术术是是根根据据各各种种带带电电粒粒子子在在电电场场中中迁迁移移速速度度的的不不同同而而对对物物质质进进行行分分离离的的实实验验技技术术。食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖一、电泳的基本理论一、电泳的基本理论 1.1.原理原理

42、:在一定在一定pHpH条件下（用条件下（用bufferbuffer），），不同大小、形状不同大小、形状及带电颗粒在电场中的移动速度不同（用迁移率表示）及带电颗粒在电场中的移动速度不同（用迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。等电聚焦电泳等电聚焦电泳(isoelectric focusingisoelectric focusing，IEF)IEF)1.1.原理原理原理原理两性电解质载体在电场作用下，按各自两性电解质载体在电场作用下，按各自pIpI形成从阳极到阴形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的极逐渐增加的平滑和连续的pHpH梯度。

43、蛋白质在此梯度。蛋白质在此pHpH梯度凝胶中梯度凝胶中泳动，当迁移至泳动，当迁移至pHpH值等于值等于pIpI处时不再泳动，被浓缩成狭窄的区处时不再泳动，被浓缩成狭窄的区带。带。食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖第四节第四节 酶的浓缩、干燥与结晶酶的浓缩、干燥与结晶一、酶的浓缩一、酶的浓缩 (一一)蒸发浓缩蒸发浓缩 （二）（二）超滤浓缩超滤浓缩 超滤超滤(ultrafiltration)浓缩以压力差为动力，将待浓缩溶液通过超浓缩以压力差为动力，将待浓缩溶液通过超滤膜，酶分子较大被滞留，水分子和小分子滤膜，酶分子较大被滞留，水分子和小分子选择性透过，达到浓缩目的选择性透过，达到浓

44、缩目的。食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖（三）吸水剂（三）吸水剂 1.1.胶过滤浓缩胶过滤浓缩利用葡聚糖凝胶利用葡聚糖凝胶SephadexG-25或或G-50等等的吸水特性。将干胶直接加入样品溶液，吸水的吸水特性。将干胶直接加入样品溶液，吸水膨润后，再过滤或离心分出浓缩的酶液。膨润后，再过滤或离心分出浓缩的酶液。食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖2.2.聚乙二醇浓缩：聚乙二醇浓缩：聚乙二醇聚乙二醇（polyethyleneglycol），简称），简称PEG。利用利用PEG的吸水特性。将的吸水特性。将PEG涂于装有涂于装有酶溶液的透析袋上，置于酶溶液的透析袋上，

45、置于4下，干下，干PEG粉末粉末吸收水和盐类，酶溶液即被浓缩。吸收水和盐类，酶溶液即被浓缩。一般用分子量大的一般用分子量大的PEG,PEG,如如PEG 6,000PEG 6,000和和PEG PEG 20,00020,000，以防止以防止PEGPEG进入蛋白质溶液。进入蛋白质溶液。食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖（四）反复冻融浓缩（四）反复冻融浓缩 利用酶溶液相对于纯水冰点较低的原理使利用酶溶液相对于纯水冰点较低的原理使酶分子与小分子物质分离。酶分子与小分子物质分离。（五）沉淀法（五）沉淀法 盐析法，有机溶剂法盐析法，有机溶剂法食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海

46、晖二、酶的干燥二、酶的干燥 酶的干燥多采用酶的干燥多采用冷冻干燥法冷冻干燥法。将酶溶液在较低温度下（将酶溶液在较低温度下（-10-50）冻结成固态，然后）冻结成固态，然后在高度真空条件下，将其中固态水分直接升华为气态而除去，在高度真空条件下，将其中固态水分直接升华为气态而除去，也称酶的也称酶的升华干燥升华干燥。三、酶的结晶三、酶的结晶 结晶结晶（Crystallization）是指物质以晶体的状态从蒸）是指物质以晶体的状态从蒸汽或溶液中析出的过程。汽或溶液中析出的过程。食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖（二）结晶的方法（二）结晶的方法1.除去一部分溶剂除去一部分溶剂，如蒸发浓缩

47、使溶液达，如蒸发浓缩使溶液达到过饱和状态而析出晶体到过饱和状态而析出晶体;2.不除去溶剂，而在溶液中加入沉淀剂不除去溶剂，而在溶液中加入沉淀剂，如中性盐、有机溶剂等。如中性盐、有机溶剂等。盐析法盐析法如，前述的如，前述的有机溶剂法有机溶剂法均可用于结晶均可用于结晶等电点等电点 食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖常用的结晶方法：常用的结晶方法：透析平衡结晶法透析平衡结晶法将酶液装进透析袋，对一定浓度的盐溶将酶液装进透析袋，对一定浓度的盐溶液进行透析，使酶液逐步达到过饱和状态而液进行透析，使酶液逐步达到过饱和状态而析出结晶的过程。析出结晶的过程。前提：前提：酶液要达到一定纯度（经过

48、纯化）。酶液要达到一定纯度（经过纯化）。酶液要浓缩到一定浓度。酶液要浓缩到一定浓度。食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖第五节第五节纯化方案的设计与评价纯化方案的设计与评价一、纯化方案的设计一、纯化方案的设计（一）纯化方法的选择依据（一）纯化方法的选择依据根据有效成分和杂质之间理化性质的差异根据有效成分和杂质之间理化性质的差异1.调节溶解度：调节溶解度：沉淀法沉淀法2.2.根据分子大小、形状的不同：根据分子大小、形状的不同：3.离心分离离心分离，膜分离膜分离，凝胶过滤凝胶过滤4.3.根据分子电荷性质的不同：根据分子电荷性质的不同：5.离子交换层析离子交换层析，电泳电泳6.4.根据

49、专一性结合的方法：根据专一性结合的方法：亲和层析亲和层析5.其它：其它：吸附层析吸附层析，疏水层析疏水层析食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖（二）纯化方法的排序（二）纯化方法的排序先选用粗放、快速、有利于缩先选用粗放、快速、有利于缩小样品体积的方法。精确、费时、小样品体积的方法。精确、费时、需样品少的方法，宜后选用。需样品少的方法，宜后选用。食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖二、纯化方案的评价二、纯化方案的评价（一）酶活力测定（一）酶活力测定：酶活力酶活力(enzymeactivity)又称酶活性，是又称酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力。其大小可用指酶催化某

50、一化学反应的能力。其大小可用在一定的条件下，酶催化某一化学反应的反在一定的条件下，酶催化某一化学反应的反应速率来表示。应速率来表示。一般用单位时间内产物生成的量来表示一般用单位时间内产物生成的量来表示酶催化的反应速率酶催化的反应速率。食品与生物工程学院食品与生物工程学院 张海晖张海晖常用的方法常用的方法：1.化学分析法化学分析法（比色法）：产物可与特定的化学（比色法）：产物可与特定的化学试剂反应生成稳定的有色溶液试剂反应生成稳定的有色溶液。2.分光光度法分光光度法：利用底物和产物光吸收性质的不利用底物和产物光吸收性质的不同同。3.量气法量气法：酶促反应中产物或底物之一为气体。酶促反应中产物或底