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1、精选学习资料 - - - - - - - - - 学习必备 欢迎下载蛋白纯化方法大全及优缺点比较1. 蛋白沉淀 蛋白能溶于水是由于其表面有亲水性氨基酸,在蛋白质的等电点处如溶液的离子强度特殊高或者特殊低,蛋白就倾向于从溶液中析出；硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐,因为它在冷的缓冲液中溶解性好,冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性；硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步,它可以初步粗提蛋白质,去除非蛋白成分；蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳固, 可以短期在这种状态下储存中间产物,当前蛋白质纯化多采纳这种方法进行粗分离翻；在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题,硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强；其他的盐如硫酸钠
2、不存在这种问题,但其纯化成效不如硫酸铵；除了盐析外蛋白仍可以用多聚物如 PEG 和防冻剂沉淀出来,PEG 是一种惰性物质,同硫酸铵一样对蛋白有稳固成效,在缓慢搅拌下逐步提高冷的蛋白溶液中的 PEG 浓度,蛋白沉淀可通过离心或过滤获得,蛋白可在这种状态下长期储存而不损坏；蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法,由于它只能达到几倍的纯化成效,而我们在达到目的前需要上千倍的纯化；其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培育基及细胞裂解物中解脱出来；2. 缓冲液的更换 虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度,但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用；不同的蛋白纯化方法需要不同pH 及不同离子强度的缓
3、冲液；假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来, 毫无疑问蛋白是处在高盐环境中,需要想方法脱盐, 可用的方法有利用半透膜透析,通过勤换透析液体去除盐分,此法尚可,但需几个小时,通常要过夜,也难以用予大规模纯化中； 新型的设备将透析膜夹在两个板中间,板的一侧加缓冲液,另一侧加需脱盐的蛋白溶液, 并在蛋白溶液一侧通过泵加压,可以使两侧溶液在数小时内达到平稳,如增加对蛋白溶液的压力,仍可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的；也有出售的脱盐柱,柱内的填料是小孔径的颗粒,蛋白分子不能进入孔内,先于高浓度盐离子从柱中流出, 从而使二者分别； 蛋白纯化的每一步都会造成目的蛋白的丢失,缓冲液平稳的步骤
4、尤甚； 蛋白会结合在任何它能接触的表面上,很简单让蛋白失活；剪切力、 起泡沫和离子强度的快速变化名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页,共 5 页精选学习资料 - - - - - - - - - 学习必备 欢迎下载3.离子交换色谱 这是在全部的蛋白纯化与浓缩方法中最有效方法；基于蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用,通过挑选不同的缓冲液,同一种蛋白既可以和阴离子交换树脂（能结合带负电荷的分子）结合,也可以和阳离子交换树脂结合；树脂所用的带电基团有四种：二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交换树脂；羧甲基用于弱的阳离子交换树脂；季铵用于强阴离子交换树脂；甲基磺酸酯用于强阳离子交换树脂；蛋白质由
5、氨基酸组成,氨基酸在不同的 pH 环境中所带总电荷不同；大多数蛋白在生理pH（pH68）下带负电荷,需用阴离子交换柱纯化,极端的 pH 下蛋白会变性失活 .应尽量防止；由于在某个特定的 pH 下不同的蛋白所带电荷数不同,与树脂的结合力也不同,随着缓冲液中盐浓度的增加或 pH 的变化,蛋白按结合力的强弱被依次洗脱；在工业化生产中更多地是转变盐浓度而不是去转变 pH 值,由于前者更简单掌握； 在试验室中几乎总是用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱,利用泵的帮助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升,当离子强度能够中和蛋白的电荷时,蛋白就被从柱上洗脱下来； 但在工业生产中盐浓度很难精确掌握,所以常用分步洗脱
6、而不足连续上升的盐梯度； 与排阻层析相比, 离子交换特异性更好,有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果,树脂也比较廉价；值得一提的是,即便是用最精确掌握的条件,仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白,仍需要其他的纯化步骤；4. 亲和层析 亲和层析基于目的蛋白与固相化的配基特异结合而滞留,其他杂蛋白会流过柱子；本方法存在的问题是：单抗特别昂贵,而且也需先纯化；单抗与目的蛋白结合力太强 .要用苛刻的条件来洗脱,这会使目的蛋白失活并破坏单抗；混合物中的其他蛋白如蛋白酶也可能破坏抗体或与它们非特异结合；某些单抗也会在纯化过程中从树脂上解离下来混入产物中,也需要从终产物中去除；亲和柱通常在纯化过程的后
7、期应用,此时标本体积已缩小,大部分的杂质已经去除；谷胱甘肽S-转移酶（ Glutathione S-transferase,GST）是最常用的亲和层析纯化标签之一,带有此标签的重组蛋白可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化,但本方法有以下缺点：第一,蛋白上的GST 必需能合适地折叠,形成与谷胱甘肽结合的空间结构才名师归纳总结 能用此方法纯化；其次,GST 标签多达 220 个氨基酸,如此大的标签可能会影响表达蛋白第 2 页,共 5 页- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 学习必备 欢迎下载的可溶性, 使形成包涵体,这会破坏蛋白的自然结构,难于进行结构分析,有时即便
8、纯化后再酶切去除 GST 标签也不肯定能解决问题；另一种可应用的亲和纯化标签是 6 组氨酸标签,组氨酸的咪唑侧链可亲和结合镍、锌和钴等金属离子,在中性和弱碱性条件下带组氨酸标签的目的蛋白与镍柱结合,在低 pH 下用咪唑竞争洗脱；组氨酸标签与 GST 相比有很多优点,第一,由于只有 6 个氨基酸,分子量很小,一般需要酶切去除：其次,可以在变性条件下纯化蛋白, 在高浓度的尿素和胍中仍能保持结合力；另外 6 组氨酸标签无免疫原性,重组蛋白可直接用来注射动物,也不影响免疫学分析；虽然有这么多的优点,但此标签仍有不足,如目的蛋白易形成包涵体、难以溶解、 稳固性差及错误折叠等；镍柱纯化时金属镍离子简单脱落
9、漏出混入蛋白溶液,不但会通过氧化破坏目的蛋白的氨基酸侧链,而且柱子也会非特异吸附蛋白质, 影响纯化成效； 如目的蛋白可与某种碳水化合物特异结合,或者需要某种特殊的辅因子, 可将该碳水化合物或辅因子固相化制成亲和柱,化合物或辅因子洗脱；结合后目的蛋白可用高浓度的碳水5. 疏水作用 层析蛋白是由疏水性和亲水性氨基酸组成的；疏水性氨基酸位于蛋白空间结构的中心部位, 远离表面的水分子；亲水性氨基酸残基就位于蛋白表面；由于亲水性氨基酸吸引了很多的水分子,所以通常情形下整个蛋白分子被水分子包围着,疏水性氨基酸不会暴露在外；在高盐浓度的环境中蛋白的疏水性区域就会暴露并与疏水性介质表面的疏水性配基结合；不同的
10、蛋白疏水性不同,与疏水作用力大小也不同,通过逐步降低缓冲液中盐浓度冲洗柱子,在盐浓度很低时,蛋白复原自然状态,疏水作用力减弱被洗脱出来；疏水性树脂的挑选性是由疏水性配基的结构打算的,常用的直链配体为烷基配体（alkyl ligands）和芳基配体（arylligands ）,链越长结合蛋白的才能也越强；抱负树脂种类的选择应依据目的蛋白的化学性质而定,不能挑选结合力太强的树脂,结合力太强的树脂会很难洗脱,所以开头时应选用中等结合力的苯基树脂探讨条件；为了使挑选合适的介质更简单,Amersham Biosciences 推出了疏水作用树脂挑选试剂盒,里面包括5 种不同的树脂供比较；名师归纳总结 疏
11、水层析很适合作为离子交换纯化的下一个步骤,由于疏水作用层析在高盐浓度下上样,从第 3 页,共 5 页- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 学习必备欢迎下载又省去了下一离子交换得到的产物不需更换缓冲液即可使用；蛋白又在低盐缓冲液中洗脱,步纯化前的更换缓冲液的步骤,既节省了时间,又削减了蛋白的丢失；6. 排阻层析 也叫凝胶过滤或分子筛；排阻层析柱的填充颗粒是多孔的介质,柱中环围着颗粒所能容纳的液体量叫流淌相,也称无效体积； 太大的蛋白不能进入颗粒的孔内,只能存在于无效体积的溶液中,将会最早从柱中洗脱出来,对这部分蛋白无纯化成效；由于各种蛋白的分子大小不同, 扩
12、散进入特定大小孔径颗粒内的才能也各异；大的蛋白分子会被先洗脱出来,分子越小, 洗脱出来的越晚；为得到正确的纯化成效,应将孔径大小选在目的蛋白能在无效体积和总柱床体积的中点邻近洗脱；排阻层析有其他方法所不具备的优点,第一所能纯化的蛋白分子量范畴宽,Tosoh Biosep 公司的聚合物树脂,排阻极限可达 200000kD ；其次,树脂微孔的外形适合分别球形的蛋白质,纯化过程中也不需要能引起蛋白变性的有机溶剂；应当留意的是某些蛋白不适合用凝胶过滤纯化,由于本技术所用树脂有轻度的亲水性,电荷密度较高的蛋白简单吸附在上面；排阻层析从不用于纯化过程的早期,由于这种方法要求标本高度浓缩,上样量只能在柱体积
13、的1 4之间,柱子要细而长才能得到好的分别成效,树脂本身也比较昂贵,规模化的工业生产中不太适用；7.电泳 丙烯酰胺凝胶电泳通常用来查看蛋白混合物样品的复杂程度和监测纯化成效；这种方法分别成效极好, 惋惜很难在不丢失精度情形下放大到制备规模,由于随着胶厚度的增加,电泳时的热效应会严峻干扰蛋白的泳动；在基础讨论中, 有时仅需要少量的纯蛋白进行讨论,如蛋白质测序等, 此时电泳纯化不失为一种简便快速的好方法；丙烯酰胺凝胶电泳也是蛋白纯化过程中重要的分析工具,可以检测目的蛋白是在哪个梯度的离子交换柱盐洗脱液中；可用来判定近年来随着各学科的迅猛进展,对蛋白纯化技术的需求不断增长,已有的纯化方法被日益改进,
14、 新型的纯化方法也相继涌现；羟磷灰石是磷酸钙的结晶,由于其理化性质不够稳固,结合才能差,很难用于层析；近来来Bio-Rad 公司对其进行了改进,提高了钙和磷的比例, 使形成球形、 多孔、 性质稳固的陶瓷羟磷灰石颗粒,其带正电的钙离子和负电性的磷酸根离子可分别与蛋白的羧基及氨基结合；通过调整缓冲液的pH 值,酸性及碱性氨基酸可名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页,共 5 页精选学习资料 - - - - - - - - - 挑选性地与此树脂结合,学习必备欢迎下载资料显示, 使用这种方法转变缓冲液的盐浓度可将蛋白洗脱分别；能使两种等电点、分子量和疏水性相同的蛋白很好分别；名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页,共 5 页