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1、第十章第十章 毒理学试验基础毒理学试验基础一、毒理学试验的原则一、毒理学试验的原则二、毒理学试验的目的二、毒理学试验的目的三、试验动物的选择和处置三、试验动物的选择和处置四、剂量设置和比照四、剂量设置和比照五、结果处理五、结果处理教学目标1.驾驭食品毒理学试验的原则和局限性驾驭食品毒理学试验的原则和局限性2.驾驭试验动物选择的基本原则驾驭试验动物选择的基本原则3.驾驭食品毒理学试验设计的三大原则驾驭食品毒理学试验设计的三大原则4.了解量反应资料和质反应资料的统计方法了解量反应资料和质反应资料的统计方法一、毒理学试验的原则和局限性一、毒理学试验的原则和局限性1.1.化学物在试验动物中产生的作用可
2、以化学物在试验动物中产生的作用可以外推于人：（外推于人：（1 1）人是最敏感的动物；）人是最敏感的动物；（2 2）人和试验动物的生物学过程包）人和试验动物的生物学过程包括化学物的代谢，与体重或体表面积括化学物的代谢，与体重或体表面积相关。相关。2.2.试验动物必需暴露于高剂量，这是发试验动物必需暴露于高剂量，这是发觉对人造成潜在危害的牢靠方法。觉对人造成潜在危害的牢靠方法。3.3.染毒途径的选择，应尽可能模拟人接染毒途径的选择，应尽可能模拟人接触该受试物的方式触该受试物的方式毒理学试验的局限性毒理学试验的局限性-动物试验结果外推到人的不确定性动物试验结果外推到人的不确定性1.动物与人对外源化学
3、物的反应敏感性可能不同，动物与人对外源化学物的反应敏感性可能不同，甚至存在质的差别；甚至存在质的差别；2.运用少量动物、接受较大剂量，使对群体的代表运用少量动物、接受较大剂量，使对群体的代表性较差，可能造成高剂量与低剂量的差异；性较差，可能造成高剂量与低剂量的差异；3.动物数量较少，对低概率毒效应难以发觉；动物数量较少，对低概率毒效应难以发觉；4.试验动物为纯系，成年动物，反应较单一，与接试验动物为纯系，成年动物，反应较单一，与接触人群的困难性不匹配，对外源化学物的易感性触人群的困难性不匹配，对外源化学物的易感性存在差异。存在差异。二、毒理学试验的目的二、毒理学试验的目的1.1.受试物毒作用的
4、表现和性质（描述毒理学）受试物毒作用的表现和性质（描述毒理学）2.2.在急性或慢性试验中视察动物异样，发在急性或慢性试验中视察动物异样，发觉有害作用觉有害作用3.3.剂量剂量-反应（效应）探讨反应（效应）探讨4.4.毒性评价和平安性评价的基础；得到多毒性评价和平安性评价的基础；得到多种毒性参数和剂量种毒性参数和剂量-反应（效应）线的斜率反应（效应）线的斜率5.5.确定毒作用的器官确定毒作用的器官6.6.阐明毒作用特点，为机制探讨和毒性阐明毒作用特点，为机制探讨和毒性防治供应线索防治供应线索7.7.确定损伤的可逆性确定损伤的可逆性通过动物对外源化学物的毒性反应，向人外推，通过动物对外源化学物的毒
5、性反应，向人外推，以期评价化学物对人的危害和危急性以期评价化学物对人的危害和危急性三、动物试验的职业道德三、动物试验的职业道德一般原则一般原则人道主义的管理人道主义的管理和处理和处理使痛觉和不适感使痛觉和不适感减到最小减到最小避开不必要的运避开不必要的运用动物用动物3R 原则原则replacement替代：用替代：用无知觉材料的科学方无知觉材料的科学方法替代有知觉脊椎动法替代有知觉脊椎动物的方法物的方法reduction削减：保证数削减：保证数据信息前提下，尽量据信息前提下，尽量削减动物运用数量削减动物运用数量refinement优化：必需优化：必需运用动物时，削减非运用动物时，削减非人道程序
6、的影响人道程序的影响试验动物：指经人工培育，对其携带微试验动物：指经人工培育，对其携带微生物实行限制，遗传背景明确，来源生物实行限制，遗传背景明确，来源清晰，可用于科学探讨的动物。清晰，可用于科学探讨的动物。四、试验动物的选择四、试验动物的选择（一）物种选择（一）物种选择基本原则：基本原则：对外源化学物的毒性反应及代谢特点与人对外源化学物的毒性反应及代谢特点与人类接近的物种（很难满足）；类接近的物种（很难满足）；自然寿命不太长的物种；自然寿命不太长的物种；易于饲养和试验操作的物种；易于饲养和试验操作的物种；经济并易于获得的物种。经济并易于获得的物种。常规试验选择两个物种，分属：常规试验选择两个
7、物种，分属：啮齿类啮齿类非啮齿类非啮齿类大鼠小鼠兔子豚鼠豚鼠豚鼠：特点是毛短而光滑，生长快，抗病力强，繁殖性能好。广泛用于药物学、传染病学、免疫学、养分学、耳科学等各项医学及生物学的探讨中。C57BL/6J小鼠：黑色，对放射物质耐受性强，但照射后肝癌发生率高。眼畸形，对结核杆菌有耐受性嗜酒精性高，是肿瘤学、生理学、遗传学探讨常用品系。SD大鼠：白色，产仔多，生长发育较Wistar大鼠为快，对疾病的反抗力尤以呼吸道疾病的反抗力强。自发肿瘤发生率较低，对性激素感受性高。Lewise大鼠：近交系大鼠，白化，对诱发自身免疫心肌炎高度敏感，可诱发过敏性脑脊髓炎、过敏性关节炎和自身免疫复合物血管球性肾炎等
8、马上移植多种肿瘤，高脂肪食物简洁引起肥胖症。BALB/c小鼠：对致癌因子敏感，对放射性照射极为敏感。生产性能良好，繁殖期长，广泛应用于肿瘤学、生理学、免疫学、核医学和单克隆抗体等探讨。BN大鼠：近交系大鼠，棕色，对试验过敏性脑脊髓炎有抗力。对自家免疫性复合性肾小球肾炎也具抗力。平均31月龄大鼠心内膜疾病的发生率为7%，先天性高血压为30%。长爪沙鼠长爪沙鼠长爪沙鼠：被毛棕灰色，对很多需氧及厌氧菌敏感，对多种病毒、寄生虫等敏感，也常用于脑神经病、内分泌学、代谢病、肿瘤学等方面的探讨。品系：试验动物学的专用名词，指用支配交配品系：试验动物学的专用名词，指用支配交配的方法获得的起源于共同祖先的一群动
9、物。的方法获得的起源于共同祖先的一群动物。同一品系的动物具有共同的遗传来源、相像的同一品系的动物具有共同的遗传来源、相像的外貌特征、独特的生物学特性、稳定的遗传性外貌特征、独特的生物学特性、稳定的遗传性能能（二）品系选择（二）品系选择（1）近交系动物：指接受连续20代以上兄妹交配或亲子交配而培育的纯品系动物。基因纯合度98.6%99.8%适用于涉及组织或肿瘤移植的试验.津白、津白、615、BALB/c、C3H小鼠突变系动物：动物在生长繁殖过程中，通过突变系动物：动物在生长繁殖过程中，通过自然突变或人工定向突变的方法，使其某基自然突变或人工定向突变的方法，使其某基因发生突变并丢失原有的正常功能，
10、该突变因发生突变并丢失原有的正常功能，该突变基因可以世代相传并保持遗传基因特性的品基因可以世代相传并保持遗传基因特性的品系动物。系动物。无胸腺裸鼠：免疫系统缺陷可接受人类多种无胸腺裸鼠：免疫系统缺陷可接受人类多种癌细胞移植。癌细胞移植。免疫毒理学、化学致癌作用等探讨领域免疫毒理学、化学致癌作用等探讨领域(2)杂交群动物：指两个不同近交系之间有目杂交群动物：指两个不同近交系之间有目的地进行交配所产生的第一代动物，即杂交的地进行交配所产生的第一代动物，即杂交第一代动物。第一代动物。具两系双亲全部的遗传特性，杂合程度一样，具两系双亲全部的遗传特性，杂合程度一样，个体差异小；具备杂交优势，生命力强，无
11、个体差异小；具备杂交优势，生命力强，无近亲衰退现象。近亲衰退现象。不能接着繁殖育种，因在子二代会发生遗传性不能接着繁殖育种，因在子二代会发生遗传性状分别。状分别。(3)封闭群动物：指在封闭群动物：指在5年以上不从外部引年以上不从外部引进新血缘，仅由同一品系的动物在固定场进新血缘，仅由同一品系的动物在固定场所保存随机繁殖的动物群所保存随机繁殖的动物群.具有确定程度的遗传学差异具有确定程度的遗传学差异.昆明种小鼠、昆明种小鼠、NIH小鼠、小鼠、LACA小鼠、小鼠、SD大鼠、青紫蓝兔、新西兰兔等均属封闭群大鼠、青紫蓝兔、新西兰兔等均属封闭群动物动物.动物品系的遗传均一性动物品系的遗传均一性遗传均一性
12、排序：近交系杂交群遗传均一性排序：近交系杂交群封闭群封闭群试验动物选择：适宜品系、固定品试验动物选择：适宜品系、固定品系系（三）试验动物微生物限制的选择（三）试验动物微生物限制的选择依据微生物限制分类，试验动物分为四级依据微生物限制分类，试验动物分为四级（四）个体选择（四）个体选择性别：初次试验雌雄同用；存在差异分开统性别：初次试验雌雄同用；存在差异分开统计；选敏感性别。计；选敏感性别。年龄和体重：动物年龄依试验类型选择，取年龄和体重：动物年龄依试验类型选择，取成年期数据。体重可作为推断年龄的指标。成年期数据。体重可作为推断年龄的指标。生理状态：避开激素影响，雌雄分开饲养；生理状态：避开激素影
13、响，雌雄分开饲养；繁殖试验、致畸试验适时合笼交配。繁殖试验、致畸试验适时合笼交配。健康状况：用健康动物，提前视察确认。健康状况：用健康动物，提前视察确认。（五）试验动物管理（五）试验动物管理动物管理：动物的接受、适应、饲养、鉴动物管理：动物的接受、适应、饲养、鉴别和记录（动物来源、处理、其它资料）别和记录（动物来源、处理、其它资料）.环境条件管理：气候（温度、湿度、通风、环境条件管理：气候（温度、湿度、通风、光照）、其它条件（噪音、气味、垫料、光照）、其它条件（噪音、气味、垫料、群体密度、空间限制）、饲料、饮水等群体密度、空间限制）、饲料、饮水等.设施管理：清洁卫生、废弃物处理、害虫设施管理：
14、清洁卫生、废弃物处理、害虫限制、突发事务管理限制、突发事务管理.五、受试物样品的准备五、受试物样品的准备了解其化学结构与理化性质：挥发性、了解其化学结构与理化性质：挥发性、溶解性、稳定性；溶解性、稳定性；纯度及杂质成分；纯度及杂质成分；接受同一种同一批号受试物接受同一种同一批号受试物;毒性资料查阅（形似化学物）毒性资料查阅（形似化学物）;制备成确定剂型：水溶液、油溶液、混制备成确定剂型：水溶液、油溶液、混悬液悬液.（一）（一）体内体内毒理学试验设计毒理学试验设计剂量分组剂量分组以获得剂量以获得剂量-反应关系，确认受试物反应关系，确认受试物与毒作用的关系：至少三个剂量组（高、中、与毒作用的关系：
15、至少三个剂量组（高、中、低）；设比照组（阳性、阴性、未处理比照、低）；设比照组（阳性、阴性、未处理比照、历史性比照）历史性比照）各组动物数：试验目的和设计、统计学要求各组动物数：试验目的和设计、统计学要求试验期限：由试验目的和所用动物种或品系确试验期限：由试验目的和所用动物种或品系确定：急毒为一次或定：急毒为一次或24h内多次染毒视察内多次染毒视察14天，亚天，亚慢性规定持续至动物寿命的慢性规定持续至动物寿命的10%，慢性试验、，慢性试验、致癌试验为持续至动物寿命的大部分。致癌试验为持续至动物寿命的大部分。六、毒理学试验设计要点六、毒理学试验设计要点（二）（二）体外体外毒理学试验设计毒理学试验
16、设计溶解性测试：在试验测试期间，受试物溶解性可溶解性测试：在试验测试期间，受试物溶解性可能变更，起始和结束时评价溶解性具有意义；能变更，起始和结束时评价溶解性具有意义；最高剂量举荐：高剂量会影响渗透压引发损伤，最高剂量举荐：高剂量会影响渗透压引发损伤，上限为：动物细胞上限为：动物细胞10mmol/L或或5mg/ml;细菌试验细菌试验5mg/平板。毒性物应有毒效应和致死率。平板。毒性物应有毒效应和致死率。代谢活化：大鼠预处理后，取肝组织匀浆为代谢代谢活化：大鼠预处理后，取肝组织匀浆为代谢活化系统活化系统-S9（p137）阳性比照：剂量反应的直线部分阳性比照：剂量反应的直线部分重复：可疑结果要重复
17、，但非简洁重复重复：可疑结果要重复，但非简洁重复六、毒理学试验设计要点六、毒理学试验设计要点七、试验动物染毒和处置七、试验动物染毒和处置尽可能模拟人接触毒物的方式尽可能模拟人接触毒物的方式不同途径的吸取速率为：静注吸入不同途径的吸取速率为：静注吸入 肌注肌注 腹腔注射腹腔注射 皮下注射皮下注射 经口经口 皮内注射皮内注射 其他其他（一）染毒（一）染毒经口染毒：经口染毒：（1）喂饲、（喂饲、（2）灌胃、（）灌胃、（3）吞咽胶囊；吞咽胶囊；经呼吸道染毒经呼吸道染毒：（：（1）静式吸入染毒、）静式吸入染毒、（2）动式吸入染毒）动式吸入染毒经皮肤染毒：经皮肤染毒：注射染毒：尾静脉、肌注、皮下、腹腔注射
18、染毒：尾静脉、肌注、皮下、腹腔试验动物染毒和处置试验动物染毒和处置针对一种外源化学物，如何选择染毒方式针对一种外源化学物，如何选择染毒方式?（二）生物标本采集（二）生物标本采集生物标本采集：（生物标本采集：（1）血液（终末、非终末）血液（终末、非终末采血）、（采血）、（2）尿液采集、（）尿液采集、（3）胆汁采集、）胆汁采集、（4）粪便采集）粪便采集.麻醉：短效、中效、长效麻醉剂运用麻醉：短效、中效、长效麻醉剂运用-；麻醉过程视察麻醉过程视察.安死术：安死术：p129.病理解剖和样标本留取：病理解剖和样标本留取：(1）大体解剖、）大体解剖、（2）组织病理学检测）组织病理学检测.试验动物染毒和处置
19、试验动物染毒和处置八、毒理学试验的统计学基础八、毒理学试验的统计学基础统计学要点：统计学要点：试验设计遵循原则：随机、重复、比照试验设计遵循原则：随机、重复、比照.包括：包括：（1）剂量水平数目及间隔；）剂量水平数目及间隔；（2）每个剂量点的试验单位数，试验单位确定要）每个剂量点的试验单位数，试验单位确定要保证样本的独立性、代表性；保证样本的独立性、代表性；（3）比照设置；）比照设置；（4）非试验因素条件的均一性：样本足够数量、）非试验因素条件的均一性：样本足够数量、适当重复、盲法视察等。适当重复、盲法视察等。结果统计分析：方法选择，可用不同方法处理结果统计分析：方法选择，可用不同方法处理.毒
20、理学试验结果评价毒理学试验结果评价结果评价须要解决的问题结果评价须要解决的问题是否具有统计学意义是否具有统计学意义是否具有生物学意义是否具有生物学意义是否具有毒理学意义是否具有毒理学意义具有统计学意义是推断生物学意义的必要条件之一；具有统计学意义是推断生物学意义的必要条件之一；推断生物学意义时要：（推断生物学意义时要：（1 1）纵向比较：剂量）纵向比较：剂量-反应关系；反应关系；（2 2）横向比较：其它相关参数是否变更；）横向比较：其它相关参数是否变更；（3 3）与历史比照比较）与历史比照比较毒理学意义须要专家评价九、优良试验室规范九、优良试验室规范Good Laboratory Practi
21、ce-GLPGLP专指毒理学平安性评价试验室的管理，专指毒理学平安性评价试验室的管理，是试验室质控要求，保证数据科学性、精是试验室质控要求，保证数据科学性、精确性、公正性。确性、公正性。要求：要求：1）组织体制及责任体制明确化；）组织体制及责任体制明确化；2）试验、操作规程的标准化；）试验、操作规程的标准化；3）依据支）依据支配、操作规程实施试验；配、操作规程实施试验；4）保存标本、记）保存标本、记录；录；5）主动地保证可信性。）主动地保证可信性。GLP基本精神是全面质量管理基本精神是全面质量管理化学品平安性评价遵循化学品平安性评价遵循GLP原则是国家法规要求的原则是国家法规要求的GLP认证单位认证单位