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1、第三章 基因转录表达调控现代分子生物学Francis Crick在1958年提出中心法则，指出信息传递是单向过程，一旦转变为蛋白质，就不会从蛋白质转回到核酸分子，但遗传信息可以从核酸到核酸或从核酸到蛋白质.遗传信息从DNA经过RNA传递到蛋白质的过程称为基因表达基因表达（gene expression）。任何能较为直接影响转录和翻译过程开启/关闭及发生速率的因素及其作用过程，称为基因表达调控基因表达调控(regulation of gene expression)。可以在多层次或水平上进行，如转录起始，转录延伸，转录终止及翻译前/后等，但最主要也是最有效的调控是转录起始调控。第三章 基因转录表
2、达调控转录过程与DNA复制过程非常相似，都会在特定酶的催化下合成一条与DNA摸板互补的新核苷酸链，但有以下区别：1）转录过程产生的新链由核糖核苷酸核糖核苷酸组成，而复制产生的新链则是由脱氧核糖脱氧核糖 核苷酸核苷酸组成；2）催化合成RNA的聚合酶不需要引物，可以从头从头（de novo）起始转录. 在细胞内 转录是从一段特定的DNA序列起始并转录某一特定的DNA区段。3）产生的RNA产物并不与模板DNA保持大范围碱基配对，而是仅仅在酶活性中 心部位保持一段8个核苷酸的互补区，已经合成的其它区段被从DNA模板上 置换出来。既可以保证翻译的同时进行，也可以允许一个基因同时被几个聚合 酶所转录，从而
3、保证短时间内产生大量转录产物。4）精确率低于复制过程（10-4 Vs 10-8）第一节 转录一、RNA聚合酶 J Harowitz与S Weiss分别在1960年首次发现以DNA为模板的RNA聚合酶，可催化如下反应： 原核生物一般只有一种RNA聚合酶，而真核生物有三种RNA聚合酶（、）。其中细菌RNA聚合酶核心酶由5个亚基组成（ ），可以与另外六个其它亚基形成全酶全酶（holoenzyme）, 其中的亚基亚基介导RNA聚合酶只对特定的启动子序列结合并起始转录。真核生物的核心酶由Rpb1,2,3,11,6组成，分别对应于细菌聚合酶的 亚基，与另外7个其它亚基组成全酶。真核生物RNA聚合酶对启动子
4、序列的特异性识别结合是由普通转录因子普通转录因子（general transcription factor, GTF）介导的。.DNA模板，Mg2+/Mn2+RNA PolRNA+4n PPi nNTPT.aquaticsS.cerevisiae晶体结构显示两种核心酶的整体结构非常相似，呈蟹爪状（crab claw）The subunits of RNA polymerases ProkaryoticBacteriaArcheaEukaryoticRNAP1RNAPRNAPA/ABDLK+6 othersRPA1RPA2RPC5RPC9RPB6RPB1RPB2RPB3RPB11RPB6RPC1
5、RPC2RPC5RPC9RPB9+9 others+7 others+11 othersChannels into and out of the open complex二、转录过程整个转录过程可以分为三个阶段：1）转录起始转录起始(initiation)；2）转录延伸转录延伸(elongation)；3）转录终止转录终止(termination)1）DNA中一段特定序列（启动子启动子）被RNA聚合酶所结合，形成一个闭合复合物闭合复合物（closed complex）；闭合复合物或在其它蛋白质因子作用下,或自发地发生结构改变，形成一开放复合物开放复合物（open complex），此过程为不可
6、逆过程，不需要ATP水解；在开放复合物中, 一段围绕转录起始点约14bp（+3-11）的区段发生解链，形成“转录泡转录泡（transcription bubble）”结构。相应于最初的两个核苷酸随后进入酶活性位点，被催化形成磷酸二酯键并继续进行其它核苷酸的合成。在RNA链最初10个核苷酸的合成中，RNA聚合酶易从模板链上脱落，合成效率较低, 此阶段称为流产转录流产转录(abortive trancription)；一旦合成的RNA链长度10nt, 聚合酶可以与DNA、RNA形成稳定的三维复合结构，进入转录延伸阶段，这一转变过程称为启动子逃启动子逃离离（promoter escape）.启动子启
7、动子 原核生物核心酶理论上可以识别结合DNA分子上的任何一个位点;但在细胞内只会从特定启动子序列起始转录。这种特异性是通过可以对启动子序列特异性识别结合的因子来完成。在大肠杆菌中最主要的因子为70。被70识别的启动子具有下面特点：1）具有两段保守序列，序列中心点分别距转录起始点为10bp及35bp，称为-10区 及-35区；2）通过比较各种被70识别的启动子序列发现，不同启动子-10区及-35区序列非 常相似，存在一个共有序列（concensus sequence），其中-10区序列为TATAA T, -35区序列为TTGACA;3) 两个保守区的间隔距离为17-19bp.The phases
8、 of transcription cyclePromoter consensus sequence and spacing consensusand subunits recruit RNA polymerase core enzyme to the promoter 2)当RNA聚合酶成功脱离启动子后，进入转录延伸阶段转录延伸阶段（transcription elongation）. 未转录的DNA双链从两蟹爪交接处进入聚合酶, 并分别进入酶分子中各自通道, 在离开聚合酶后又重新恢复双链结构. 转录延伸中的RNA分子只有89nt与模板DNA互补,其余的RNA链则从模板链上剥离, 并通过RN
9、A通道离开RNA聚合酶. 在延伸过程中, RNA聚合酶具有两种校正功能: 第一种为焦磷酸裂解编辑反应焦磷酸裂解编辑反应(pyrophosphorolytic editing), 通过重新加合一个焦磷酸基团使错误合成的核苷酸得以释放; 另一种称为水解编辑水解编辑(hydrolytic editing), 在一种Cre蛋白的协助下, 聚合酶可以从错误加合核苷酸处后退一个或几个核苷酸, 从而使RNA 3OH端离开活性中心而被切割, 后退的聚合酶则利用重新位于活性中心的3OH进行延伸. 3)当转录进行到特定序列时,聚合酶会从DNA模板上脱落并使RNA链得以释放, 这种使转录发生停止的特定DNA序列称为
10、终止子序列终止子序列(terminator). 终止子序列可以分为两类: Rho因子非依赖型; Rho因子依赖型. 第一类终止子终止转录不需其它蛋白因子参与, 而第二类则需要Rho蛋白. Rho非依赖型终止子含有两段特征性序列元素, 第一段为长度20bp的倒转重复序列倒转重复序列; 第二段为紧随其后的富含A:T区(7-8对). 终止子本身对转录无任何影响, 只有在其被聚合酶转录后会造成转录终止. 被转录的倒转重复序列区段可以通过自身碱基配对形成发夹结构发夹结构(Hairpin), 可以对转录三维复合物产生一种张力而容易引起复合物的解体; 当此种茎环结构与富含A:U区相邻时, 由于A:U配对间较
11、弱的作用力, 可以最终促使上游形成的茎环结构使转录复合物解体而终止转录. Sequence of a rho-independent terminatorTranscirption terminationRho依赖型终止子没有明显的序列特征, 转录终止的完成依赖于Rho蛋白. Rho蛋白以六聚体形式形成一环状结构,可以结合到从RNA聚合酶中RNA通道释放出的RNA单链区段; Rho蛋白同时具有ATPase活性,一旦与转录物结合后可以利用水解ATP的能量把RNA从模板链与聚合酶中释放出来. 通常Rho蛋白可以结合到RNA中rutrut位点位点(Rho utilization site), rut
12、位点长度一般为40nt, 富含C,且不形成二级结构; 另外,Rho蛋白不会结合已经结合了核糖体正在进行翻译的RNA, 而在细菌中, 翻译与转录是紧密偶联的, 因此,Rho一般只会结合终止已经超越基因末端的转录过程. The Rho transcription terminator第二节 真核生物基因转录真核生物具有三种RNA聚合酶；与原核生物RNA聚合酶需要因子来启动特定染色体区段转录不同，真核生物通常需要多种不同起始因子来协助RNA聚合酶在特定启动子序列有效起始转录，这些起始因子统称为普通转录因子普通转录因子（general transcri-ption factors，GTFs）. 在体外
13、条件下， GTFs与RNA聚合酶足以启动特定DNA模板的转录；而在胞内条件下，还需要其它蛋白因子如mediator复合物，DNA结合调控蛋白及chromatin-modifying enzymes来启动促进转录。一、真核基因启动子结构 核心启动子核心启动子（core promoter）是指体外条件下可以被RNA聚合酶精确识别结合,并起始转录所必需的一套最少序列元素。长度通常约为40bp, 从转录起始位点向上游或下游延伸。在核心启动子的上游通常还存在其它一些调控序列，如近启动子元素近启动子元素（promoter proximal ele-ments），上游激活序列上游激活序列(upstream
14、activator sequences)，增强子增强子(enhancers)及抑制基因转录的沉默子沉默子(silencers)，边界元素边界元素(boundary elements)和绝缘子绝缘子(insulators)等. 所有这些调控元素都是通过与特定调控蛋白的结合来影响从核心启动子的转录。Pol core promoter前起始复合物的形成位点是核心启动子的TATA元素。GTFs中的TFD首先通过TBP亚基结合到TATA序列上而形成一个其它GTFs与RNA聚合酶对启动子结合的平台。体外实验结果显示，其它GTFs与RNA聚合酶按照一定的顺序在启动子上完成组装。前起始复合物形成后在特定条件下
15、，在TFH解旋酶活性的催化下引起启动子区域解链，并同时对RNA聚合酶大亚基羧基端(C-terminal domain,CTD)七肽重复序列中（Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser）的Ser进行磷酸化修饰，使RNA聚合酶起始转录并脱离其它GTFs。二、转录前复合物的形成普通转录因子可以协助RNA聚合酶结合到启动子并协助实现从闭合复合物向开放复合物的转化；同时还协助聚合酶脱离启动子顺利进入延伸阶段。把结合在启动子上准备起始转录的一整套GTFs及RNA聚合酶称为前起始复合物前起始复合物（pre-initiation complex）.The general transcriptio
16、n factors of RNA polymerase IITBP 1TFA 2TFB 1TFE 2TFF 3 TFH 9TAFs 11GTFsNumber of subunitsTranscription initiation by RNA polymerase TBP-DNA complexTFIIB-TBP-promoter complex由于真核生物染色体是以染色质结构存在，所以细胞内特定基因的转录还需要许多其它蛋白因子如转录调控蛋白,Mediator complex, 核小体修饰/重塑酶（nucleosome-modifying enzymes）的协同作用等。结合在启动子上游的转录调
17、控蛋白通常可以通过Mediator complex的介导,协助并稳定RNA聚合酶对启动子的结合；Mediator complex可以通过调节TFH激酶活性而促进转录起始。酵母与人的Mediator complex均含有20亚基。 Assembly of the pre-initiation complex in presence of Mediator,Nucleosome modifiers and remodelers, and transcription activatorsRepresentative Nucleossome Modifying Enzymes Histone Acet
18、yl-transferase ComplexesTypeNumber of Subunits Catalytic SubunitBromo/ChromodomainTraget histonesSAGA15Gcn5BromoH3 and H2BPCAF11PCAFBromoH3 and H4NuA33Sas3NeitherH3NuA46Esa1chromoH4P300/CBP1P300/CBPBromoH2A,H2B,H3 and H4Sin3 complex7 HDAC1/2NeitherNuRD9HDAC1/2ChromoSIR2 complex3Sir2NeitherSUV39/CLR4
19、chromoH3(lys9)SET1NeitherH3(lys4)PRMTNeitherH3(Arg3)Modifications of histone N-terminal tailsNucleosome movement catalyzed by nucleosome remodeling activitiesEffects of histone tail modificationsChromatin remodeling complexes and histone modifying enzymes work together to alter chromatin structureRN
20、A聚合酶起始转录后，在最初（mRNA长度20nt）阶段可以与其它转录因子（DSIF与与NELF）结合而使转录发生短暂的停止，此时催化mRNA 5端鸟嘌呤甲基修饰的酶系统通过与CTD相互作用而可以对mRNA 5端修饰；加帽修饰完成后，暂停的转录装置在p-TEFb的作用下使CTD中的Ser-2发生磷酸化，同时磷酸化酶磷酸化酶（small CTD phsophotase, SCPs）可以去除Ser-5的磷酸化，磷酸化状态的转变及DSIF中SPT5亚基的磷酸化及甲基化修饰可以协同去除NLEF对转录的抑制，使转录重新进入延伸过程。 真核基因转录延伸:其它一些蛋白质因子如TFS与FACT（facilita
21、te chromatin transcription）等也在转录延伸中发挥重要作用。 TFS可以减少转录延伸过程中RNA聚合酶在某些位点的停留时间而增加总体的转录速度；其次，TFS还可以激活RNA聚合酶内在的RNase活性，从而去除因错误加合的核苷酸，提高转录的精确性，和Gre类似。 FACT复合物是目前为止体外证明可以协助RNA聚合酶转录通过核小体模板的转录延伸因子，主要是通过置换去除核小体中H2A/H2B二体，破坏完整核小体结构而使聚合酶顺利转录通过；又可以重新恢复被转录通过核小体的结构（具有组蛋白分子伴侣活性）。在转录过程结束时，磷酸酶SSU72及Fcp1分别可以特异性地去除RNA聚合酶
22、CTD中Ser-5与Ser-2的磷酸化修饰而使聚合酶得以循环使用。Role of CTD phosphrylation during transcription cylceRNA processing enzymes are recruited by the tail of polymerase在转录延伸过程中，随着RNA聚合酶 CTD磷酸化状态的改变，参与mRNA剪接修饰的蛋白因子会通过与CTD的相互作用使这些过程与转录延伸相偶联。这些RNA处理过程包括：1）RNA 5端的加帽；2）剪接；3）RNA 3的多聚腺苷酰化；RNA 5端的加帽反应包括三步酶促反应：1） RNA 5端的一个磷酸基团被
23、RNA三磷酸化酶三磷酸化酶（RNA triphosphotase）去除；2）鸟苷酰转移酶鸟苷酰转移酶（guanylyl transferase）催化RNA 5端的-磷酸基团对GTP -磷酸基团的亲核攻击，形成新的5-5磷酸二酯键；3）在甲基转移酶甲基转移酶的作用下使鸟嘌呤碱基7位上形成甲基修饰。The structure and formation of the 5RNA cap真核生物基因mRNA 3末端加尾处理与转录终止是紧密相连的。在被转录基因的3末端具有特定的聚聚A信号序列信号序列(AAUAAA)，当这种序列被转录产生RNA后，可以促使结合在RNA聚合酶CTD上的聚腺苷酰酶聚腺苷酰酶（
24、poly-A polymerase）复合物转移到新产生的RNA上，并引起mRNA在聚A信号序列后的切割断裂，发生聚A反应，并转录终止。在介导mRNA切割断裂与聚A反应过程中有两种重要蛋白因子-CPSF(cleavage and polyadenylation specificity factor)与CstF(cleavage stimulation factor)；而RNA聚合酶在mRNA被切割后仍可以继续转录，但在一种5 3核酸外切酶（人Xrn2；酵母Rat1）的作用下被终止转录。Polyadenylation and terminationDetailed poly-adenylation reaction