第三章理化检测解析优秀PPT.ppt

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1、可溶性糖类的检测可溶性糖类的检测(还原糖还原糖蔗糖蔗糖总糖总糖)(一)还原糖的测定u费林热滴定法(SP法)、铁氰化钾法（结合食用总糖检测时介绍）（结合食用总糖检测时介绍）u萨氏萨氏(Somogyi)(Somogyi)法法(费林法测糖)u次碘酸钠法次碘酸钠法u高锰酸钾法高锰酸钾法 （二）蔗糖的测定（二）蔗糖的测定 蔗糖（无还原性）蔗糖（无还原性）果糖果糖+葡萄糖（还原性）葡萄糖（还原性）物理法物理法物理法物理法（三）总糖的测定（三）总糖的测定 非还原性糖酸水解还原性单糖 按还原糖法测定按还原糖法测定 酸本身存在的还原性单糖（1）滴定必需在沸腾条件下进行不能把锥形瓶从热源上取下来滴定可以加快还原糖

2、与的反应速度；保持反应液沸腾可防止空气进入，避开次甲基蓝被氧化而增加耗糖量。（2）不能随意摇动锥形瓶 以免空气进入反应液中，使亚甲基蓝被氧化项目三 产品 理化指标检测模块六模块六 食用菌产品其他理化指标检测技术食用菌产品其他理化指标检测技术灰份灰份总糖总糖VC检测技术检测技术粗蛋白粗蛋白杂质杂质VCVC检测技术检测技术2,62,6二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法 简便简便/须脱色、干扰多（深色、其他还原性物质）须脱色、干扰多（深色、其他还原性物质）二甲苯二氯靛酚比色法二甲苯二氯靛酚比色法 深色深色荧光法：精确度高，较困难荧光法：精确度高，较困难2 2，4-4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法还原型VC的测

3、定总VC的测定总VC=氧化型VC+还原型VC+二酮古乐糖酸少氧化+还原+二酮古乐糖酸操作困难，结果易受影响氧化型+还原型VCVC检测技术检测技术2,62,6二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法1 1、原理、原理 VC VC的提取的提取:用草酸用草酸/偏磷酸（不常用偏磷酸（不常用,须要在合适的须要在合适的PHPH下进行提取下进行提取)将样品中的将样品中的VCVC提取出来提取出来 用蓝色的碱性染料标准溶液用蓝色的碱性染料标准溶液(2,6(2,6二氯靛酚标准溶液二氯靛酚标准溶液),),对对提取液进行氧化还原滴定提取液进行氧化还原滴定依据消耗的染料的量可计算出样品中还原型依据消耗的染料的量可计算出样品中还原型

4、VCVC的含量的含量终点指示原理终点指示原理:染料被还原为无色染料被还原为无色,当到达滴定终点时当到达滴定终点时,多多余的染料在酸性介质中则表现为浅红色余的染料在酸性介质中则表现为浅红色,2,6二氯靛酚碱性酸性蓝色红色VCVC检测技术检测技术2,6二氯靛酚滴定法2、试剂（1）2,6二氯靛酚(2,6二氯靛酚吲哚酚钠盐)溶液配制碳酸氢钠热蒸馏水溶解加2，6二氯靛酚溶解冷却后定容过滤保存备用棕色瓶低温滴定度的测定：每次运用均要进行该操作VCVC检测技术检测技术2,6二氯靛酚滴定法2、试剂1ml抗坏血酸标准溶液10ml浸提剂用2，6二氯靛酚溶液滴定呈粉红色15s不褪色取10ml浸提剂做空白试验（2%草

5、酸OR2%偏磷酸）CV滴定度T(mg/ml)V1V2T每毫升2，6二氯靛酚溶液相当于抗坏血酸的毫克数C抗坏血酸的浓度,mg/mlV吸取抗坏血酸的体积,mV1滴定抗坏血酸溶液所用2，6二氯靛酚溶液的体积，mlV2滴定空白所用2，6二氯靛酚溶液的体积，ml。VCVC检测技术检测技术2,62,6二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法2 2、试剂、试剂（2 2）抗坏血酸标准溶液）抗坏血酸标准溶液(1mg/ml)(1mg/ml)称取称取 100mg(100mg(精确至精确至 0.1mg)0.1mg)抗坏血酸，溶于浸提剂抗坏血酸，溶于浸提剂中并稀至中并稀至100ml100ml现配现用现配现用试剂发黄，则弃去不用试剂

6、发黄，则弃去不用VCVC检测技术检测技术2,62,6二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法3 3、试验步骤、试验步骤(VC(VC的提取的提取/滴定滴定/空白滴定空白滴定)取样品浸提剂捣成匀浆称取部分匀浆浸提剂定容到100ml过滤滤液有颜色用白陶土脱色0.4g/g样品取滤液10ml2,6二氯靛酚溶液滴定 自身为指示剂 浅红色酸式滴定管空白试验：浸提剂10mlVCVC检测技术检测技术2,62,6二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法3 3、试验步骤、试验步骤(VV0)TA维生素C(mg/100g)-100WV滴定样液时消耗染料溶液的体积，mlV0滴定空白时消耗染料溶液的体积，mlT2，6二氯靛酚染料滴定度，mg/ml

7、A稀释倍数 定容体积/吸取体积W样品重量，gVCVC检测技术检测技术2,62,6二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法4 4、留意事项、留意事项 （1）15秒钟红色不褪为终点样品中可能有其他杂质也能还原2，6-二氯靛酚，但一般杂质还原该染料的速度均较抗坏血酸慢（2）必需做空白试验VCVC检测技术检测技术2,62,6二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法4 4、留意事项、留意事项（3 3）样液制备时浆状物泡沫可能太多，可加数滴）样液制备时浆状物泡沫可能太多，可加数滴丁醇或辛醇丁醇或辛醇（4 4）整个操作过程要快速）整个操作过程要快速防止被防止被VCVC氧化氧化 滴定过程一般不超过滴定过程一般不超过2min 2min

8、 滴定所用的染料应在滴定所用的染料应在1-4ml1-4ml之间之间 （微量滴定管）（微量滴定管）假如太多？太小？假如太多？太小？选选择合适的滴定管择合适的滴定管滴定起先时，染料溶液要快速加入，直至红色不马上消逝,而后尽可能一滴一滴地加入（先快后慢）VCVC检测技术检测技术2,62,6二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法4 4、留意事项、留意事项（5 5）取样后，应浸泡在已知量的）取样后，应浸泡在已知量的2%2%草酸溶液中草酸溶液中2%2%草酸有抑制抗坏血酸氧化酶的作用（防止被草酸有抑制抗坏血酸氧化酶的作用（防止被氧化）氧化）1%1%草酸无此作用草酸无此作用VC检测技术二甲苯二氯靛酚比色法1、原理用定过

9、量的 2,6二氯靛酚染料与试样中的维生素C进行氧化还原反应，多余的染料在酸性环境中呈红色用二甲苯萃取后比色，在确定范围内，吸光度与染料浓度呈线性相关，测剩余染料浓度，用差减法计算维生素 C含量。2、仪器与试剂基本同二氯靛酚比色法/偏磷酸浸提VC检测技术二甲苯二氯靛酚比色法2、试验步骤（1）样品处理 定容到100ml（同二氯靛酚比色法）（2）测定 30min内完成食用菌中杂质检测5ml2%偏磷酸和5mlpH4.0的乙酸钠缓冲液6支试管/标准曲线（A500染料体积）5ml2%偏磷酸样品浸出液样品测定不同体积2,6二氯靛酚溶液10ml二甲苯用力摇动取有机层测A500用力摇动+5mlpH4.0的乙酸钠

10、缓冲液+2ml染料溶液用力摇动VC检测技术二甲苯二氯靛酚比色法2、试验步骤（3）计算 (2V)TA 维生素 C(mg/100g)100 W食用菌中杂质检测2所用2,6二氯靛酚染料的体积，mlV查得2,6二氯靛酚溶液的体积，mlA稀释倍数T染料滴定度，mg/mlW样品重量，gVC检测技术荧光法（氧化型VC+还原型VC）1、原理(1)偏磷酸提取样品中的VC(2)活性炭氧化提取液中的VC 还原型VC氧化型VC 样品中原来的氧化型VC 喹喔啉（具有荧光性）荧光强度与氧化型VC的浓度在确定条件下成正比食用菌中杂质检测+邻苯二胺（OPDA）VC检测技术荧光法（GB第一法）2、试剂（1）100g/ml抗坏血

11、酸标准溶液先用偏磷酸-乙酸溶解并定容配成1mg/ml测pH食用菌中杂质检测2.2偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释2.2偏磷酸-乙酸（2）活性C（活化）活性C1mol/L盐酸加热回流1-2hVC检测技术荧光法（GB第一法）2、试剂食用菌中杂质检测过滤水洗烘箱中干燥洗到洗液中无Fe3+加入洗液蓝色检验：2%亚铁氯化钾+1%盐酸等量混合洗液中有Fe3+VC检测技术荧光法（GB第一法）3、试验步骤（1）样品提取食用菌中杂质检测称取样品偏磷酸-乙酸溶液匀浆取适量匀浆含有1-2mgvc调酸碱度百里酚蓝指示剂显红色（2.8）偏磷酸-乙酸-硫酸定容到100ml过滤样品滤液(2)用活性C氧化VC检测技术荧光法（GB第

12、一法）3、试验步骤（2）氧化处理食用菌中杂质检测取样品滤液100ml活性C过滤样品氧化液振摇1mi取抗坏血酸标准溶液100ml标准氧化液取滤液最初几ml舍去（3）制备试液（待测液）、标准液、空白液VC检测技术荧光法（GB第一法）3、试验步骤食用菌中杂质检测（3）制备试液（待测液）、标准液、空白液5ml标准氧化液5ml标准氧化液标准液标准空白液5ml样品氧化液5ml样品氧化液试液（待测液）试液空白液5ml硼酸-乙酸钠加水定容到25ml摇动15min5ml50%乙酸钠加水定容到100ml加水定容到25ml加水定容到100mlVC检测技术荧光法（GB第一法）3、试验步骤食用菌中杂质检测（4）测荧光值

13、标准液试液标准空白液试液空白液各2ml5ml邻苯二胺避光放置35min测荧光值（荧光分光光度计）改为不同体积的标准液（0/0.5/1/1.5/2)标准曲线法样品荧光值标样荧光值样品空白荧光值标样空白荧光值VC检测技术荧光法（GB第一法）3、试验步骤食用菌中杂质检测（5）计算样品中维生素C含量(mg/100g)=(IIb)c5D100(IsIsb)m100I样品荧光值；Ib样品空白溶液荧光值；Is标样荧光值；Isb标样空白溶液荧光值c标样质量浓度，0.1mg/mL（100g/ml）；m样品的质量，g。D样品(测荧光值时)稀释倍数；5-5ml标准氧化液100-样品滤液100mlVC检测技术荧光法（

14、GB第一法）4、留意事项（1）尽快用偏磷酸-醋酸提取液将样品制成匀浆以保存维生素C（2）不易过滤可改为抽滤或离心后取上清液过滤（3）活性炭用量应适当与精确（有吸附抗坏血酸的作用）（4）本法为外标法测定，也可通过标准曲线法测定（5）全部试验应避光操作（6）空白液中硼酸的加入消退产品中丙酮酸的干扰食用菌中杂质检测VCVC检测技术检测技术2 2，4-4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法 （GBGB其次法）其次法）1 1、原理、原理 样品中还原型样品中还原型VCVC经活性炭氧化为氧化型经活性炭氧化为氧化型VCVC 原有的氧化型原有的氧化型VCVC 脎的含量与总抗坏血酸含量成正比，进行比色测脎的含量与总抗坏血酸

15、含量成正比，进行比色测定。定。食用菌中杂质检测2，4-二硝基苯肼二硝基苯肼红色脎红色脎VCVC检测技术检测技术2 2，4-4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法 （GBGB其次法）其次法）2 2、试验步骤、试验步骤（1 1）样品提取）样品提取 同前法同前法（2 2）氧化）氧化取取25ml 25ml 样品滤液样品滤液2g2g活性活性C C 振摇振摇1min 1min 过滤过滤取滤液取滤液10ml 10ml2%10ml 10ml2%硫脲溶液硫脲溶液样品氧化液样品氧化液 （3 3）呈色反应）呈色反应食用菌中杂质检测最初滤液舍去4ml氧化液4ml氧化液4ml氧化液空白平行试验2，4二硝基苯肼373h防止防止VC

16、接着被氧化接着被氧化促进脎的形成促进脎的形成氧化剂氧化剂+脱色剂脱色剂VCVC检测技术检测技术2 2，4-4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法 （GBGB其次法）其次法）2 2、试验步骤、试验步骤食用菌中杂质检测冷却空白液室温样品液冰水冰水冷却2，4二硝基苯肼10-15min后（4 4）85%85%硫酸处理硫酸处理本步已成脎，但显色不稳定本步已成脎，但显色不稳定用浓硫酸处理，转变为用浓硫酸处理，转变为橘红色的双橘红色的双-2，4-二硝基苯二硝基苯每支+5ml85%硫酸边加边摇至少加1min室温下放置30minVCVC检测技术检测技术2 2，4-4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法 （GBGB其次法）其次法）2

17、 2、试验步骤、试验步骤食用菌中杂质检测（5 5）比色测定）比色测定 测测A A500500（6 6）绘制标准曲线）绘制标准曲线 50ml1mg/ml抗坏血酸标准溶液1g活性C 振摇1min 过滤取滤液10ml 5g硫脲 1%草酸定容到500ml（浓度为20g/ml）1%硫脲稀释到不同浓度（1/2/4/6/10/12g/ml）以下操作同样品测定取4ml2，4二硝基苯肼373h5ml85%硫酸室温下放置30minA500标准曲线VCVC检测技术检测技术2 2，4-4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法 （GBGB其次法）其次法）2 2、试验步骤、试验步骤食用菌中杂质检测（7 7）计算）计算X=（cV/m）

18、F(100/1000)X样品中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量，mg/100g；c由标准曲线查得或由回来方程算得样品溶液浓度，g/ml；m试样质量，g；F样品氧化处理时的稀释倍数；V呈色反应所用试样体积，ml。VCVC检测技术检测技术2 2，4-4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法 （GBGB其次法）其次法）3 3、留意事项、留意事项（1 1）试管自冰水中取出后，颜色会接着变深，）试管自冰水中取出后，颜色会接着变深，所以，加入硫酸后所以，加入硫酸后3030分钟应准时比色。分钟应准时比色。（2 2）活性）活性CC氧化剂氧化剂+脱色剂（深色样品）脱色剂（深色样品）无色或已脱色样品无色或已脱色样品溴或溴或2 2

19、，6 6二氯靛酚作氧化剂二氯靛酚作氧化剂（3 3）硫脲的加入）硫脲的加入防止防止VCVC接着被氧化接着被氧化 促进脎的形促进脎的形成成食用菌中杂质检测食用菌中蛋白质检测测定蛋白质的方法可分为两大类测定蛋白质的方法可分为两大类利用蛋白质的共性，即含氮量（利用蛋白质的共性，即含氮量（16%16%）、肽键测定、肽键测定蛋白质含量蛋白质含量 ；利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基团以利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含量。及芳香基团等测定蛋白质含量。具体测定方法具体测定方法凯氏定氮法凯氏定氮法凯氏定氮法凯氏定氮法水杨酸比色法水杨酸比色法、紫外分光光度法、双缩脲反应、

20、染料结合反应、酚试剂法、红外光谱、紫外分光光度法、双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法、红外光谱蛋白质含量测定最常用的方法是凯氏定氮法蛋白质含量测定最常用的方法是凯氏定氮法食用菌中蛋白质检测凯氏定氮法凯氏定氮法测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数系数（1/16%1/16%）而求出蛋白质的含量而求出蛋白质的含量为为粗蛋白含量（含有少部分含粗蛋白含量（含有少部分含N N非蛋白核酸、非蛋白核酸、生物碱等）生物碱等）18331833年年KieldahlKieldahl首先提出首先提出常量常量K氏定氏定N法法微量微量K氏定氏定N法法自动自动K氏定氏定N法法半微量

21、半微量K氏定氏定N法、改良法等法、改良法等食用菌中蛋白质检测1 1、原理、原理样品与浓硫酸和样品与浓硫酸和催化剂催化剂一同加热消化，使蛋白质分解一同加热消化，使蛋白质分解 碳和氢被氧化为碳和氢被氧化为COCO2 2和和H H2 2O O逸出逸出 有机氮转化为氨，与硫酸结合成有机氮转化为氨，与硫酸结合成硫酸铵硫酸铵常量常量K氏定氏定N法法硫酸铜作催化剂常量、微量、半微量硫酸铜+二氧化钛改良2NH2(CH2)2COOH+13H2S04(NH4)2S04+6C02+12S02+16H2O 食用菌中蛋白质检测1 1、原理、原理常量常量K氏定氏定N法法l加硫酸铜加硫酸铜催化剂催化剂指示消化终点：溶液为蓝

22、绿色（硫酸铜溶液颜色），清澈透亮指示消化终点：溶液为蓝绿色（硫酸铜溶液颜色），清澈透亮l加氧化剂加氧化剂如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧化速度如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧化速度蒸馏时碱性反应的指示剂（推断加碱量是否足够）蒸馏时碱性反应的指示剂（推断加碱量是否足够）C+CuSO4Cu2SO4+SO2+CO2Cu2SO4+2H2SO42CuSO4+2H20+SO2蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色而不成褐色蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色而不成褐色（氢氧化（氢氧化铜沉淀、铜沉淀、CUO沉淀、铜离子与氨的络合物），沉淀、铜离子与氨的络合物），此时需再增加氢氧化此时需再增加氢氧化钠用量。钠用量。食用

23、菌中蛋白质检测常量常量K氏定氏定N法法2NH2(CH2)2COOH+13H2S04(NH4)2S04+6C02+12S02+16H2O 消化l确定是浓硫酸：确定是浓硫酸：浓硫酸具有脱水性浓硫酸具有脱水性使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮浓硫酸又具有氧化性浓硫酸又具有氧化性2H2SO4C2SO22H2OCO2二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫H2SO42NH3 (NH4)2SO4l加硫酸钾加硫酸钾增温剂，提高溶液沸点（增温剂，提高溶液沸点（330400）浓硫酸酸性浓硫酸酸性食用菌中蛋白质检测1 1、原理、原理用硼

24、酸吸取氨用硼酸吸取氨以标准以标准HClHCl溶液滴定。依据标准酸消耗量可以计算出蛋白溶液滴定。依据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。质的含量。也可以用过量的标准也可以用过量的标准H2SO4H2SO4或标准或标准HClHCl溶液吸取后再溶液吸取后再以标准以标准NaOHNaOH滴定过量的酸。滴定过量的酸。常量常量K氏定氏定N法法整个过程：消化、碱化、蒸馏、吸取、滴定整个过程：消化、碱化、蒸馏、吸取、滴定2NH3+4H3BO3 (NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B407+H2S04+5H20 (NH4)2SO4+4H2BO2 加碱蒸馏，使氨蒸出加碱蒸馏，使氨蒸出(NH4)2SO4+2NaO

25、H2NH3+2H2O+Na2SO4食用菌中蛋白质检测2 2、仪器与试剂、仪器与试剂（1 1）通风橱）通风橱 （2 2）消扮装置）消扮装置（3 3）蒸馏装置）蒸馏装置（4 4）盐（硫）酸标准）盐（硫）酸标准溶液溶液 配制、标定配制、标定（5 5）奈氏试剂）奈氏试剂NesslerNessler试剂，试剂，K2K2（HgI4HgI4）常量常量K氏定氏定N法法3.5gKI+1.3gHgCl2溶于溶于70毫升水。加毫升水。加30毫毫升升4mol/L氢氧化钠（或氢氧化钾）溶液，必要时氢氧化钠（或氢氧化钾）溶液，必要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。溶解溶解11.5gHgI2+KI1

26、0g于适量少许水，后加水稀释至于适量少许水，后加水稀释至50ml,静静置后，取其澄清液，弃去沉淀，储存于棕色瓶中。置后，取其澄清液，弃去沉淀，储存于棕色瓶中。食用菌中蛋白质检测3 3、试验步骤、试验步骤（1 1）消化）消化 常量常量K氏定氏定N法法5克样品+10克结晶硫酸钾+l克硫酸铜+浓硫酸25毫升小火加热保持和缓的沸腾使火力集中在凯氏瓶底部（以免溅附在壁上的蛋白质处于无硫酸存在的状况，使氮有损失。）液体为蓝绿色透亮接着加热微沸1h冷却l样品放入定氮瓶内时，样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上不要沾附颈上.(用水冲用水冲洗洗)l消化时如不呈透亮溶消化时如不呈透亮溶液，可放冷后，渐渐加液，可放冷后

27、，渐渐加入入30%过氧化氢过氧化氢2-3ml，促使氧化。，促使氧化。l消化时应留意时常转消化时应留意时常转动凯氏烧瓶，动凯氏烧瓶，l利用冷凝酸液将附利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗在瓶壁上的固体残渣洗下下l促进其消化完全促进其消化完全食用菌中蛋白质检测3 3、试验步骤、试验步骤（2 2）蒸馏、吸取）蒸馏、吸取常量常量K氏定氏定N法法B25毫升硼酸吸取液甲基红溴甲酚绿混合指示剂下端插入液面下40（可放在冷水浴中）A少量水、消化液、玻璃球C80毫升50%氢氧化钠溶液D加热蒸馏将全部氨蒸出:估计时间1-2h奈氏试剂检查是否蒸完PH试纸检查冷凝管下端用水冲洗后接着蒸馏1min后关闭热源（防止倒吸）

28、检验检验NH4+离子，遇铵根离子，遇铵根离子析出黄色或红棕色沉离子析出黄色或红棕色沉淀淀食用菌中蛋白质检测3 3、试验步骤、试验步骤（3 3）滴定）滴定常量常量K氏定氏定N法法馏出液标准盐酸溶液滴定甲基红溴甲酚绿混合指示剂蓝色微红色别遗忘做空白试别遗忘做空白试验！验！不称样不称样消化消化蒸馏蒸馏吸取吸取滴滴定定食用菌中蛋白质检测3 3、试验步骤、试验步骤（4 4）计算）计算常量常量K氏定氏定N法法C(V1-V)X0.014总氮()=X100WC盐酸标准溶液的摩尔浓度；V1样液滴定消耗的盐酸标准溶液的量(毫升)；V空白滴定消耗的盐酸标准溶液的量(毫升)；W样品重量(克)；0.014氮的毫摩尔粗蛋

29、白质()=总氮()KK换算系数，食用菌产品等于4.38食用菌中蛋白质检测4 4、留意事项、留意事项（1 1）样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上，万一沾）样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上，万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。低。（2 2）消化时如不简洁呈透亮溶液，可将定氮瓶放冷）消化时如不简洁呈透亮溶液，可将定氮瓶放冷后，渐渐加入后，渐渐加入30%30%过氧化氢过氧化氢2-3ml2-3ml，促使氧化。，促使氧化。（3 3）消化时应留意时常转动凯氏烧瓶，以便利用冷）消化时应留意时常转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗

30、下，并促进其消化凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。完全。常量常量K氏定氏定N法法食用菌中蛋白质检测（4 4）蒸馏装置不能漏气）蒸馏装置不能漏气（5 5）各种试剂及装置的作用及影响）各种试剂及装置的作用及影响浓浓H2SO4 H2SO4 脱水炭化脱水炭化(生成生成CHN)CHN)、氧化、与、氧化、与NH3NH3作用作用CuSO4 CuSO4 催化剂、指示剂（消化、蒸馏前加碱）催化剂、指示剂（消化、蒸馏前加碱）K2SO4 K2SO4 提高沸点提高沸点有时加入硒粉、氧化汞有时加入硒粉、氧化汞催化剂（为了防止污染通常催化剂（为了防止污染通常接受硫酸铜）接受硫酸铜）50%NaOH50%N

31、aOH的作用：释放铵盐中的的作用：释放铵盐中的NH3 NH3。常量常量K氏定氏定N法法食用菌中蛋白质检测K K氏烧瓶和取样量氏烧瓶和取样量1g1g以上的样品，以上的样品，K K氏烧瓶最小氏烧瓶最小500ml 500ml（加热匀整（加热匀整 缩短消化时间）缩短消化时间）H2SO4H2SO4和和K2SO4K2SO4的添加量的添加量(一般指导原则一般指导原则)1g 1g样品样品 K2SO4 K2SO4：H2SO4=7g H2SO4=7g：12ml12ml 若取样量较大，如干试样若取样量较大，如干试样5 g 5 g 可按每克可按每克试样试样5 m15 m1的比例增加硫酸用量。的比例增加硫酸用量。吸取液

32、吸取液 标准标准H2SO4 H2SO4 溶液：用标准碱返滴定，甲醛溶液：用标准碱返滴定，甲醛(基基)红指红指示剂示剂 硼酸硼酸：用：用HClHCl进行滴定，混合指示剂进行滴定，混合指示剂蒸馏蒸馏 常量法常量法干脆蒸馏干脆蒸馏 微量法微量法水蒸汽蒸馏水蒸汽蒸馏常量常量K氏定氏定N法法l不须要精确知道体积l不须要标定浓度l弱酸对酸碱滴定要求低食用菌中蛋白质检测微量微量K氏定氏定N法法原理及适用范围同前原理及适用范围同前与常量法不同点与常量法不同点 样品质量、试剂量变少样品质量、试剂量变少 微量滴定管微量滴定管 微量凯氏定氮微量凯氏定氮装置（水蒸气蒸馏）装置（水蒸气蒸馏）试验操作（1）消化最终加水定

33、容到100ml,其他与常量法一样（2）蒸馏食用菌中蛋白质检测微量微量K氏定氏定N法法（1）按图安装好按图安装好微量定微量定氮蒸馏装置氮蒸馏装置（2）装水2/3甲基橙、硫酸数ml（保持酸性）（3）10ml4%硼酸硼酸2滴混合指示剂滴混合指示剂（4）10.00ml样品消化稀释液（5）少量水冲洗（6）10ml10%氢氧化钠（7）少量蒸馏水冲洗，盖塞盖塞（8）加热蒸馏吸取液变为绿色计时蒸馏10min冷凝管提离液面接着蒸馏1min（9）滴定食用菌中蛋白质检测自动自动K氏定氏定N法法1、原理及适用范围同前、原理及适用范围同前2、特点：、特点：（1）消扮装置用优质玻璃）消扮装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红

34、外制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。线加热的消化炉。（2）快速：一次可同时消）快速：一次可同时消化化8个样品，个样品，30分钟可消分钟可消化完毕。化完毕。（3）自动：自动加碱蒸馏，）自动：自动加碱蒸馏，自动吸取和滴定，自动数自动吸取和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，数分钟百分含量并记录，数分钟完成完成1个样。个样。食用菌中蛋白质检测1 1、原理、原理(标准曲线法标准曲线法)样品中的样品中的propro经经H2SO4H2SO4消化转化为铵盐溶液消化转化为铵盐溶液在确定的酸度和温度下与水杨酸钠和次氯酸钠作在确定的酸度和温度下与水杨酸钠和次氯酸钠作用生成有

35、颜色的化合物用生成有颜色的化合物在波长在波长660nm660nm处比色测定，求出样品含氮量，计算处比色测定，求出样品含氮量，计算蛋白质含量。蛋白质含量。2 2、试剂、试剂水杨酸比色法水杨酸比色法食用菌中蛋白质检测（1）氮标准溶液）氮标准溶液称称经经110干干燥燥2h的的硫硫酸酸铵铵0.4719g于于烧烧瓶瓶中中定定容容10ml此此液液1ml相相当当于于1.0mg氮氮标标液液运运用用时时配配制制成成1ml相当于相当于2.50g氮标液。氮标液。（2）空白酸溶液）空白酸溶液称称0.50g蔗蔗糖糖加加15mlH2SO4和和5g催催化化剂剂与与样样品品一一样样消消化化定定容容250ml运运用用时时吸吸取

36、取此此液液10ml加加水水至至100ml为工作液备用。为工作液备用。水杨酸比色法水杨酸比色法硫酸铜硫酸钠（1：9）食用菌中蛋白质检测3、试验步骤、试验步骤（1）标准曲线的绘制）标准曲线的绘制水杨酸比色法水杨酸比色法取6个25ml容量瓶编号012345标准N溶液（2.5g/ml）01.02.03.04.05.0分别加空白酸液2ml分别加磷酸盐缓冲液5ml水稀释至15ml分别加水扬酸钠5ml37水浴15分钟加入次氯酸钠2.5ml37水浴15分钟取出试液于660nm下进行比色，绘标准曲线。吸光度含N的质量g食用菌中蛋白质检测3、试验步骤、试验步骤（2）样品处理）样品处理水杨酸比色法水杨酸比色法于K氏

37、瓶中加15mlH2SO4和5g催化剂电炉上加热到沸腾加大火力消化出现暗绿色摇动瓶子（瓶壁黏附的残渣溶解消化）溶液完全澄清冷却加水定容到250ml食用菌中蛋白质检测3、试验步骤、试验步骤（3）样品测定）样品测定水杨酸比色法水杨酸比色法精确吸取上述消化溶液10ml加水定容到100ml精确吸2ml加5ml磷酸缓冲液以下操作与标准曲线绘制的步骤相同测A660水稀释至15ml分别加水扬酸钠5ml37水浴15分钟加入次氯酸钠2.5ml37水浴15分钟（4 4）计算）计算CF含氮%=-100W10001000C从标准曲线中查出测定样液的含氮量（g）F样品溶液的稀释倍数（？）W样品重量（g）pro%=总氮%K食用菌中蛋白质检测4、留意事项、留意事项(1)严格限制反应温度严格限制反应温度(温度对显色反应影响很大温度对显色反应影响很大)(2)样品消化后当天应予以检测样品消化后当天应予以检测(重现性重现性)(3)此法与此法与K氏法结果基本一样氏法结果基本一样水杨酸比色法水杨酸比色法