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1、第8章菌种退化与保藏n第一节菌种的退化与防止第一节菌种的退化与防止n一、菌种退化一、菌种退化(degeneration)n生生产产菌菌种种或或优优良良菌菌种种由由于于传传代代或或保保藏藏之之后后，群群体体中中的的某某些些生生理理特特性性或或形形态态特特征征减减退退或或消逝。消逝。二、菌种退化的缘由n1、基因突变是主要缘由n2、连续传代是加速退化的干脆缘由n3、培育条件和保藏条件有多方面的影响n(1)不同环境条件n(2)培育基n(3)培育条件n(4)保藏条件三、菌种退化的防止n1、削减传代n2、用单核细胞和单菌落传代n3、常常进行菌种纯化n4、接受良好的培育基和培育条件n5、科学的保藏方法四、菌
2、种复壮n1、菌种复壮：通过自然分别的方法将那些尚未弃衰退的细胞从群体中分别出来，使菌种的优良性壮得以复原。是一种消极的措施。n2、主动措施：在尚未退化前，常常进行自然分别。其次节其次节 工业微生物菌种保藏技术工业微生物菌种保藏技术n在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某一期盼代谢产物主实力的微生物菌种的保存和长期保藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。一、保藏方法应具备的条件一、保藏方法应具备的条件(1)经长期保藏后菌种存活健在；经长期保藏后菌种存活健在；(2)保保证证高高产产突突变变株株不不变变更更表表型型和和基基因因型型，特特殊殊是是不不变变更更初初级级代代谢谢产产物物和和次次级级代代谢
3、谢产产物物生产的高产实力。生产的高产实力。(3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。二、工业微生物菌种保藏技术二、工业微生物菌种保藏技术(1)冷冻干燥或真空干燥保藏；(2)超低温或在液氮中冷冻保藏；(3)转接培育或斜面传代保藏；(4)土壤或陶瓷珠等载体干燥保藏。2.12.1冷冻保藏冷冻保藏n冷冷冻冻保保藏藏为为保保藏藏微微生生物物菌菌种种的的最最简简洁洁而而有有效效的的方方法。法。n通通过过冷冷冻冻，使使微微生生物物代代谢谢活活动动停停止止。一一般般而而言言，冷冷冻冻温温度度愈愈低低，效效果果愈愈好好。为为了了获获得得满满足足的的冷冷冻冻结结果果，通通常
4、常应应在在培培育育物物中中加加入入确确定定的的冷冷冻冻爱爱护护剂剂。冷冷冻冻保保藏藏时时温温度度要要求求在在-20以以下下，同同时时应应细细致致驾驭好冷冻速度和解冻速变。驾驭好冷冻速度和解冻速变。n冷冻深藏的缺点之一是培育物运输较困难。冷冻深藏的缺点之一是培育物运输较困难。冷冻保藏种类冷冻保藏种类1、一般冷冻保藏技术、一般冷冻保藏技术(-20)2、超低温冷冻保藏技术、超低温冷冻保藏技术(-60一一-80)3、液氮冷冻保藏技术、液氮冷冻保藏技术1 1、一般冷冻保藏技术、一般冷冻保藏技术(-20)(-20)n将将液液体体培培育育物物或或从从琼琼脂脂斜斜面面培培育育物物收收获获的的细细胞胞分分接接到
5、到试试管管或或指指管管内内，然然后后贮贮藏藏于于冰冰箱箱的的冷冷藏藏室室中中，或或于于温温度度范范围围在在-5-5-20-20的的一一般般冰冰箱箱(-20)(-20)中中。或或者者，将将菌菌种种培培育育在在小小的的试试管管或或培培育育瓶瓶斜斜面面上上，待待生生长长适适度度后后，将将试试管管或或瓶瓶口口用用橡橡胶胶塞塞严严格格封封好好，同同上上置于冰箱中保存。置于冰箱中保存。n用此方法可以维持若干微生物的活力用此方法可以维持若干微生物的活力1212年。年。留意！留意！n应应留留意意的的是是经经过过一一次次解解冻冻的的菌菌株株培培育育物物不不宜宜再再用来保藏。用来保藏。n保保藏藏过过程程中中应应留
6、留意意限限制制保保藏藏温温度度，培培育育瓶瓶或或试试管应严格密封。管应严格密封。n这这一一方方法法虽虽简简便便易易行行，但但不不适适宜宜多多数数微微生生物物的的长期保藏。长期保藏。2 2、超低温冷冻保藏技术、超低温冷冻保藏技术 (-60 (-60至至-80)-80)n要要求求长长期期保保藏藏的的微微生生物物菌菌种种，一一般般都都要要求求在在-60以下进行保藏。以下进行保藏。n在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法：在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法：n1离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；n2用簇新培育基重新悬浮所收获的细胞；用簇新培育基重新悬浮所收获的
7、细胞；n3加入等体积的加入等体积的20甘油或甘油或10二甲亚砜；二甲亚砜；n4混混匀匀后后分分装装入入冷冷冻冻指指管管或或安安瓿瓿中中，于于-70超低温冰箱中保藏。超低温冰箱中保藏。nn假如待保藏菌种生长在斜面上，则可用假如待保藏菌种生长在斜面上，则可用含含1010甘油的新配制液体培育基洗涤收甘油的新配制液体培育基洗涤收获。超低温冰箱的冷冻速度一般限制在获。超低温冰箱的冷冻速度一般限制在1-21-2minmin。干细菌和真菌菌种可通过。干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏此保藏方法保藏5 5年而活力不受影响。年而活力不受影响。3 3、液氮冷冻保藏技术、液氮冷冻保藏技术(1)冷冻爱护剂在液氮冷冻
8、保藏中，最常用的冷冻爱护剂是二甲亚砜和甘油，最终运用浓度一般为甘油10、二甲亚砜5。所运用的甘油般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。(2)(2)液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤 1 1待冷冻保藏菌种悬液的制备待冷冻保藏菌种悬液的制备 (1)(1)从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入5ml5ml含含1010甘油的养分液体培育；用巴氏吸管吹吸斜面制甘油的养分液体培育；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌体细胞悬液；成孢子及菌体细胞悬液；0.50.5lmllml分装玻璃安瓿或分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶。液氮冷藏专用塑料瓶。(2)(2)从
9、浸没培育物制备菌悬液：从浸没培育物制备菌悬液：在浸没培育液中加入等体积在浸没培育液中加入等体积20%20%无菌甘油；轻轻振荡无菌甘油；轻轻振荡混匀培育液，假如菌体絮凝较紧，则需先用玻璃珠打散；混匀培育液，假如菌体絮凝较紧，则需先用玻璃珠打散；0.5-lml0.5-lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将全部封好的安瓿置于瓿用酒精喷灯封口；将全部封好的安瓿置于55冰箱中冰箱中3min3min，以使细胞和悬浮培育基之间达到平衡。，以使细胞和悬浮培育基之间达到平衡。(1)(1)将将安安瓿瓿或或液液氮氮瓶瓶置置于于铝铝盒盒或或布布袋袋中
10、中，然然后后置置于于一较大的金属容器中；一较大的金属容器中；(2)(2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；(3)(3)以以1-2/min1-2/min的的致致冷冷速速度度降降温温，直直到到温温度度达达到到相相对温度之上几度的细胞冻结点对温度之上几度的细胞冻结点(通常为通常为-30)-30)；(4)(4)补补加加确确定定量量的的液液氮氮至至系系统统中中，使使细细胞胞在在冻冻结结点点时尽可能快地发生相变；时尽可能快地发生相变；2 2控速冷冻控速冷冻 (5)(5)细细胞胞冻冻结结后后，将将致致冷冷速速度度降降为为1/min1/min，直直到温度达到温度达-5
11、0-50；(6)(6)将将安安瓿瓿快快速速移移入入液液氮氮罐罐中中于于液液相相(-)96)(-)96)或气相或气相(-156)(-156)中保存。中保存。假假如如无无控控速速冷冷冻冻机机，则则一一般般可可将将安安瓿瓿或或液液氮氮瓶瓶置置于于一一7070冰冰箱箱中中冷冷冻冻4h4h，然然后后快快速速移移入入液氮罐中保存。液氮罐中保存。1从液氮罐中取出所需的安瓿，马上置于冰浴中；从液氮罐中取出所需的安瓿，马上置于冰浴中；2快快速速将将安安瓿瓿置置于于37-40水水浴浴中中，并并轻轻轻轻摇摇动动以以加速解；加速解；3用用巴巴氏氏吸吸管管将将安安瓿瓿中中贮贮存存培培育育物物移移接接入入含含有有2m1无
12、无菌菌液液体体培培育育基基的的试试管管中中，用用同同一一支支吸吸管管反反复复抽抽吸吸数数次次，然然后后取取0.1-0.2ml(约约4、8滴滴)转转接接入入琼琼脂脂斜面上。斜面上。(三三)复苏复苏2.22.2冻干保藏冻干保藏n冷冻干燥的基本方法：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培育物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。n冷冻干燥过程中必需运用冷冻爱护剂，目前国内常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等的。n大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丢失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。培育物的冻干过程培育物的冻干过程1 1启启动动冷冷冻
13、冻干干燥燥器器的的致致冷冷单单元元。当当冷冷凝凝器器的的温温度度达达到到-40-40时时启启动动真真空空泵泵，使使真真空空度度达达到到2.672.674.00Pa4.00Pa。2 2将将冷冷冻冻槽槽置置于于歧歧管管之之下下方方。槽槽中中装装入入2 23 3体体积积的的异异丙丙醇醇，然然后后插插入入温温度度计计及及可可调调温温控控仪仪降降温温探探头头打打开开降降温温探探头头限限制制醇醇浴浴温温度在度在-40-40，这，这过程约需过程约需30min30min。(二二)操作步骤操作步骤3 3每每支支斜斜面面加加入入2ml 2ml 2020的的脱脱脂脂乳乳，然然后后用用巴巴氏氏吸吸管管将将斜斜面面上上
14、的的菌菌苔苔吹吹打打下下制制成成孢孢子子或或菌菌体体均均悬悬液液，最最终终菌菌株株浓浓度度一一般般要要求求在在106CFU106CFUm1m1用用细细菌菌浸浸没没培培育育物物来来保保藏藏时时，加加入入4040的的脱脱脂脂乳乳，混混合合制制成成含含106CFU106CFUmlml的均悬液。的均悬液。4 4取取下下安安瓿瓿上上的的棉棉塞塞，然然后后用用lmllml移移液液管管分分装装安瓿安瓿(0.2ml(0.2ml瓿瓿)，重新塞好棉塞。，重新塞好棉塞。5 5轻轻轻轻振振荡荡安安瓿瓿，以以使使细细胞胞重重新新悬悬浮浮。将将安安瓿瓿与与歧歧管管相相联联后后快快速速置置于于醇醇浴浴中中，然然后后调调整整
15、温控装置。使细胞悬液快速冻结。温控装置。使细胞悬液快速冻结。6 615min15min后，将歧管与真空泵相通。后，将歧管与真空泵相通。7 7维持维持-40-40的醇浴温度的醇浴温度90-120min90-120min，然后调整温，然后调整温控装置。使醇浴温度上升至控装置。使醇浴温度上升至-10-10，维持，维持2h2h。8 8关掉可调温控装置的降温探头，让醇浴温度上关掉可调温控装置的降温探头，让醇浴温度上升至室温升至室温(25)(25)9 9在冷冻干燥的最初在冷冻干燥的最初4h4h内应定期测真空度，在安内应定期测真空度，在安瓿置于真空下后瓿置于真空下后1h1h内，真空度必需达到内，真空度必需达
16、到13.33Pa13.33Pa，并于菌悬液接近干燥时渐渐降到，并于菌悬液接近干燥时渐渐降到2.672.674.0Pa4.0Pa。10 10 在在真真空空状状态态下下，让让安安瓿瓿保保存存在在冷冷冻冻干干燥燥机机 中至少中至少16h16h以获得完全干燥。以获得完全干燥。1111干燥后，在干燥后，在2.672.674.00Pa4.00Pa的真空度下封瓶的真空度下封瓶1212在全部安瓿都封盖好后，撤去真空。在全部安瓿都封盖好后，撤去真空。1313关闭真空泵。关闭真空泵。1414关闭冷凝器。关闭冷凝器。(三三)冻干菌种的保藏与再生冻干菌种的保藏与再生1 1保保藏藏：冷冷冻冻干干燥燥后后的的培培育育物物
17、在在低低于于55下下保保藏藏。较较低低的的保保藏藏温温度度(-20(-20-70)-70)对对于于培培育育物物的的长长期期稳定更好。稳定更好。2 2复苏：复苏：(1)(1)在在超超净净工工作作台台中中用用7070酒酒精精棉棉球球擦擦洗洗安安瓿瓿，然然后后用砂轮在安瓿中锉一道沟。用砂轮在安瓿中锉一道沟。(2)(2)用用无无菌菌纱纱布布或或无无菌菌毛毛巾巾包包好好安安瓿瓿，然然后后用用手手掰掰开开安瓿安瓿(3)(3)在在安安瓿瓿中中加加入入0.50.51ml1ml养养分分液液体体培培育育基基，渐渐渐渐旋旋转转安安瓿瓿，使使冻冻干干菌菌种种复复水水。然然后后将将此此转转接接到到一一含含有有再再生生培
18、培育育基基的的无无菌菌试试管管中中，或或干干脆脆接接种种琼琼脂脂斜斜面面或或涂布平板。涂布平板。(4)(4)在在指指管管中中冻冻干干的的菌菌种种通通常常为为絮絮粉粉状状，可可以以将将此此干干脆脆振振落落入入盛盛有有l l2ml2ml液液体体培培育育基基的的试试管管中中，轻轻轻轻振振荡荡5 5l0minl0min，然后用此悬液接种适宜的再生培育基。，然后用此悬液接种适宜的再生培育基。2.3 2.3 其他保藏方法其他保藏方法一、传代保藏一、传代保藏二、矿物油中浸没保藏二、矿物油中浸没保藏一、传代保藏一、传代保藏n将将菌菌种种定定期期在在簇簇新新琼琼脂脂培培育育基基上上传传代代，然然后后在在确确定的
19、生长温度下生长和保存的传代保藏方法。定的生长温度下生长和保存的传代保藏方法。n可用于试验室中若干菌种的保藏。可用于试验室中若干菌种的保藏。n此法最为简洁和经济，且不要求任何特殊的设备。此法最为简洁和经济，且不要求任何特殊的设备。n但但此此方方法法易易发发生生培培育育基基干干枯枯、菌菌体体自自溶溶、基基因因突突变。变。n因因此此要要求求在在基基本本培培育育基基上上传传代代为为好好，目目的的是是能能淘汰突变株；同时转接菌量应保持较低水平。淘汰突变株；同时转接菌量应保持较低水平。n斜斜面面培培育育物物应应在在密密闭闭容容器器中中于于55保保藏藏，以以防防止培育基脱水并能降低代谢活性。止培育基脱水并能
20、降低代谢活性。n此此方方法法一一般般不不适适宜宜作作工工业业生生产产菌菌种种的的长长期期保保藏藏方法。方法。二、矿物油中浸没保藏二、矿物油中浸没保藏n将将琼琼脂脂斜斜面面或或液液体体培培育育物物浸浸入入矿矿物物油油中中于于室室温下保藏，此方法简便有效。温下保藏，此方法简便有效。n可可用用于于丝丝状状真真菌菌、酵酵母母、细细菌菌和和放放线线菌菌的的保保藏藏。特特殊殊对对难难于于冷冷冻冻干干燥燥的的丝丝状状真真菌菌和和难难以以在在固固体体培培育育基基上上形形成成孢孢子子的的担担子子菌菌等等的的保保藏藏更为有效。更为有效。n浸浸没没保保藏藏的的操操作作要要点点是是首首先先让让待待保保藏藏菌菌种种在在
21、适适宜宜的的培培育育基基上上生生长长，然然后后注注入入经经170下下灭灭菌菌1-2h的的矿矿物物油油，矿物油的用量以高出培育物矿物油的用量以高出培育物1cm为宜。为宜。n以以液液体体石石蜡蜡作作为为保保藏藏方方法法时时，应应对对需需保保藏藏的的菌菌株株预预先先作作试试验验。因因为为某某些些菌菌株株在在液液体体石石蜡蜡下下生生长长还还特特别别明明显显，有有些些菌菌株株如如某某些些假假丝丝酵酵母母还还会会同同化化液液体体石石蜡蜡，也也有有的的对对液液体体石石蜡蜡保保藏藏敏敏感感。全全部部这这些些菌菌株株都都不不能能用用液液体体石石蜡蜡保保藏藏。为为了了预预防防不不测测，一一般般保保藏藏株株23年年
22、也也应应做做一一次存活试验。次存活试验。不同菌种保藏方法比较不同菌种保藏方法比较2.42.4基因工程菌的保藏基因工程菌的保藏n由由载载体体质质粒粒等等携携带带的的外外源源DNA片片段段通通常常是是遗遗传传不不稳稳定定的的、且且很很易易丢丢失失其其外外源源质质粒粒复复制制子子。质质粒粒基因通常为宿主细胞生长非必需。基因通常为宿主细胞生长非必需。n一一般般状状况况下下当当细细胞胞丢丢失失这这些些质质粒粒时时，生生长长速速度度会会加快。加快。n当当培培育育基基中中加加入入抗抗生生素素时时，抗抗生生素素供供应应了了一一有有利利于于携携带带质质粒粒的的细细胞胞群群体体的的极极有有用用的的生生长长选选择择
23、压压。而而且且在在运运用用基基因因工工程程菌菌进进行行发发酵酵时时，抗抗生生素素的的加加入入可可帮帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。助维持质粒复制与染色体复制的协调。n我我们们建建议议基基因因工工程程菌菌应应保保藏藏在在含含低低浓浓度度选选择择剂剂的的培育基中。培育基中。2.5 2.5 微生物活力和稳定性测定微生物活力和稳定性测定n全全部部保保藏藏菌菌种种的的方方法法都都必必需需是是长长期期牢牢靠靠地地保持菌种的优良性状不变。保持菌种的优良性状不变。n在在保保藏藏时时定定期期检检测测菌菌种种活活力力，以以确确定定保保藏藏培培育育物物的的保保藏藏期期限限和和保保藏藏方方法法的的牢牢靠靠性性，以
24、以及及确确定定在在实实际际保保藏藏过过程程中中出出现现的的细细胞胞死死亡程度和遗传稳定性。亡程度和遗传稳定性。建建 议！议！n对对工工业业微微生生物物生生产产菌菌种种来来说说，建建议议保保藏藏菌菌种种的的形形态态学学和和生生化化特特征征(如如代代谢谢产产物物的的产产生生、酶酶活活力力、遗遗传传特特征征及及生生化化指指标标)应应在保藏后加以检测和确定。在保藏后加以检测和确定。n加加速速保保藏藏试试验验可可用用于于预预料料保保藏藏过过程程中中保保藏藏培培育育物物的的稳稳定定性性。在在一一给给定定温温度度下下通通过过对对高高温温下下短短期期活活力力丢丢失失程程度度检检测测，可可以用来预料嗜酸乳杆菌的稳定性。以用来预料嗜酸乳杆菌的稳定性。nn成成功功的的菌菌种种长长期期保保藏藏方方法法之之有有价价值值的的指指标标包包括括在在保保藏藏6个个月月、1年年或或更更长长时时间间后后存存活活百百分分率率(或或存存活活单单位位)。细细胞胞群群体体的的形形态态学学特特征征或或一一些些特特殊殊的的生生化化特特征征应应在在菌菌种种保保藏藏前前后后保保持持同同一一性性，以以及及试试验验室室中中、中中试试车车间间中中和和生生产产发发酵酵中中产产品品滴度的稳定性，后者极为重要。滴度的稳定性，后者极为重要。