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1、五章外源化学物质突变作用1 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望环境毒理学|第一节第一节第一节第一节 环境化学物的致突变性及其评价环境化学物的致突变性及其评价环境化学物的致突变性及其评价环境化学物的致突变性及其评价|一、基本概念一、基本概念一、基本概念一、基本概念|生物的个体和各代之间存在着种种差异，我们通常称之为生物的个体和各代之间存在着种种差异，我们通常称之为生物的个体和各代之间存在着种种差异，我们通常称之为生物的个体和各代之间存在着种种差异，我们通
2、常称之为变异变异变异变异（variationvariation）。）。）。）。|基于染色体和基因的变异才能够遗传，而遗传变异称为突变基于染色体和基因的变异才能够遗传，而遗传变异称为突变基于染色体和基因的变异才能够遗传，而遗传变异称为突变基于染色体和基因的变异才能够遗传，而遗传变异称为突变（mutationmutation）。）。）。）。|突变的发生及其过程就是致突变作用（突变的发生及其过程就是致突变作用（突变的发生及其过程就是致突变作用（突变的发生及其过程就是致突变作用（mutagenesismutagenesis）。）。）。）。|突变可分为自发突变突变可分为自发突变突变可分为自发突变突变可分
3、为自发突变(natural(natural或或或或sporadic mutation)sporadic mutation)和诱发突变和诱发突变和诱发突变和诱发突变(induced mutation(induced mutation）。）。）。）。|各物种的自发突变频率较低各物种的自发突变频率较低各物种的自发突变频率较低各物种的自发突变频率较低,而诱发突变比较常见而诱发突变比较常见而诱发突变比较常见而诱发突变比较常见,诱发突变指由于诱发突变指由于诱发突变指由于诱发突变指由于物理、化学、生物等环境因素引起的突变。至今物理、化学、生物等环境因素引起的突变。至今物理、化学、生物等环境因素引起的突变。至
4、今物理、化学、生物等环境因素引起的突变。至今,已发现相当数量的已发现相当数量的已发现相当数量的已发现相当数量的外源化学物能损伤遗传物质，从而诱发突变，这些物质称为致突变外源化学物能损伤遗传物质，从而诱发突变，这些物质称为致突变外源化学物能损伤遗传物质，从而诱发突变，这些物质称为致突变外源化学物能损伤遗传物质，从而诱发突变，这些物质称为致突变物或诱变剂（物或诱变剂（物或诱变剂（物或诱变剂（mutagenmutagen），也称为遗传毒物），也称为遗传毒物），也称为遗传毒物），也称为遗传毒物(genotoxic agent(genotoxic agent）。）。）。）。2 2环境毒理学|环境化学诱变
5、剂的分类环境化学诱变剂的分类|第一组人工合成,仅在一定条件下应用的诱变剂|1.药品|抗癌药抗菌素,麻醉药和避孕药等|2.农药|杀虫剂,灭鼠剂,除莠剂和除霉剂等及他们的残留物|3.食品添加剂|4.化妆品|5.生物污染|第二组工业生产中应用的或产生的环境诱变剂|1.工业烷化剂|2.有机溶剂及有机金属化合物|3.水污染物|4.空气污染物|5.重金属及其化合物|第三组自然界存在的诱变剂与食品加工过程产生的诱变剂|1.生物碱|2.微生物代谢产物|3.食品加工过程中产生的诱变剂3 3环境毒理学|二、突变的类型二、突变的类型|一般根据遗传物质的损伤能否在显微镜一般根据遗传物质的损伤能否在显微镜下直接观察到分
6、为下直接观察到分为染色体畸变染色体畸变(chromosome aberration)和和 基因突变基因突变(gene mutation)两类：两类：|染色体损伤大于或等于染色体损伤大于或等于0.2微米时，可微米时，可在光学显微镜下观察到，称为染色体畸在光学显微镜下观察到，称为染色体畸变；变；|若小于这一下限，不能在镜下直接观察若小于这一下限，不能在镜下直接观察到，要依靠对其后代的生理、生化、结到，要依靠对其后代的生理、生化、结构等表型变化判断突变的发生，称为基构等表型变化判断突变的发生，称为基因突变因突变(gene mutation），亦称点突变），亦称点突变(point mutation）。
7、）。4 4环境毒理学5 5环境毒理学6 67 78 8化化学学毒毒物物致致突突变变的的类类型型|(一一一一)、基因突变、基因突变、基因突变、基因突变(gene mutation)gene mutation)gene mutation)gene mutation)zz1 1 1 1碱基置换碱基置换碱基置换碱基置换(basepair substitution)basepair substitution)basepair substitution)basepair substitution)指某一碱基配对性能改变或脱落所致的突变。指某一碱基配对性能改变或脱落所致的突变。指某一碱基配对性能改变或脱落所
8、致的突变。指某一碱基配对性能改变或脱落所致的突变。(DNA(DNA(DNA(DNA碱基碱基碱基碱基被其他碱基所取代被其他碱基所取代被其他碱基所取代被其他碱基所取代)碱基碱基：腺嘌呤（腺嘌呤（A,Adenine)鸟嘌呤（鸟嘌呤（G,Guanine)胞嘧啶（胞嘧啶（C,Cytosine)胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T,Thymine)A-T;G-C,三个碱基对构成一个密码子三个碱基对构成一个密码子转换转换转换转换(transition)transition)transition)transition)颠换颠换颠换颠换(transvertion)transvertion)transvertion)trans
9、vertion)9 9|它包括转换和颠换两种情况：它包括转换和颠换两种情况：|原来的嘌呤被另一嘌呤置换或原来原来的嘌呤被另一嘌呤置换或原来的嘧啶被另一嘧啶置换，我们称之为转的嘧啶被另一嘧啶置换，我们称之为转换换(transition）；）；|若原来的嘌呤被嘧啶置换或原来的嘧若原来的嘌呤被嘧啶置换或原来的嘧啶被嘌呤置换，我们则称之为颠换啶被嘌呤置换，我们则称之为颠换(transversion）。）。|无论是转换还是颠换都只涉及一对碱无论是转换还是颠换都只涉及一对碱基，其结果可造成一个三联体密码子的基，其结果可造成一个三联体密码子的改变改变,可能出现同义密码、错义密码和可能出现同义密码、错义密码和
10、终止密码。由于错义密码所编码的氨基终止密码。由于错义密码所编码的氨基酸不同，表达的蛋白质可能发生改变；酸不同，表达的蛋白质可能发生改变；如果错义密码为终止密码，可使所编码如果错义密码为终止密码，可使所编码的蛋白质的肽链缩短。的蛋白质的肽链缩短。1010|(一一)、基因突变、基因突变(gene mutation)gene mutation)化化学学毒毒物物致致突突变变的的类类型型1111化化学学毒毒物物致致突突变变的的类类型型|(一一)、基因突变、基因突变(gene mutation)gene mutation)1212zz2 2 2 2移码突变移码突变移码突变移码突变 (frameshift
11、mutation)frameshift mutation)frameshift mutation)frameshift mutation)指发生一对或几对（三对除外）的碱基指发生一对或几对（三对除外）的碱基指发生一对或几对（三对除外）的碱基指发生一对或几对（三对除外）的碱基减少或增加，以致从受损点开始碱基序列减少或增加，以致从受损点开始碱基序列减少或增加，以致从受损点开始碱基序列减少或增加，以致从受损点开始碱基序列完全改变，形成错误的密码，并转译成为完全改变，形成错误的密码，并转译成为完全改变，形成错误的密码，并转译成为完全改变，形成错误的密码，并转译成为不正常的氨基酸。不正常的氨基酸。不正常
12、的氨基酸。不正常的氨基酸。zz 3 3 3 3、大段损伤、大段损伤、大段损伤、大段损伤 大片段损伤是指大片段损伤是指大片段损伤是指大片段损伤是指DNADNA链大段缺失或插入。链大段缺失或插入。链大段缺失或插入。链大段缺失或插入。这种损伤有时可跨越两个或数个基因，但这种损伤有时可跨越两个或数个基因，但这种损伤有时可跨越两个或数个基因，但这种损伤有时可跨越两个或数个基因，但所缺失的片段仍远小于光镜下所能观察到所缺失的片段仍远小于光镜下所能观察到所缺失的片段仍远小于光镜下所能观察到所缺失的片段仍远小于光镜下所能观察到的染色体变化，故又可称为小缺失。的染色体变化，故又可称为小缺失。的染色体变化，故又可
13、称为小缺失。的染色体变化，故又可称为小缺失。1313|(二二)、染色体畸变、染色体畸变(chromosome aberration)chromosome aberration)指染色体的结构改变指染色体的结构改变 z染色单体型畸变染色单体型畸变(chromatid-type aberration)chromatid-type aberration)z染色体型畸变染色体型畸变(chromosome aberration)chromosome aberration)染色体畸变染色体畸变裂裂隙隙(g ga ap p)断断裂裂(b br re ea ak k)断断片片(f fr ra ag gm me
14、 en nt t)和和缺缺失失(d de el le et ti io on n)微微小小体体(m mi in nu ut te e b bo od dy y)无无着着丝丝点点环环环环状状染染色色体体 双双着着丝丝点点染染色色体体 倒倒位位(i in nv ve er rs si io on n)易易位位(t tr ra an ns sl lo oc ca at ti io on n)插插入入(i in ns se er rt ti io on n)和和重重复复(d du up pl li ic ca at ti io on n)辐辐射射体体 化化学学毒毒物物致致突突变变的的类类型型1414|
15、（1）裂隙和断裂（）裂隙和断裂（gap and brake）：都是指染色体上狭窄）：都是指染色体上狭窄的非染色带，其所分割的两个节段保持线状连接为裂隙，否的非染色带，其所分割的两个节段保持线状连接为裂隙，否则为断裂。则为断裂。|（2）无着丝粒断片和缺失）无着丝粒断片和缺失(acentric fragment and deletion)：一个染色体发生一次或多次断裂而不重接，且这些断裂的：一个染色体发生一次或多次断裂而不重接，且这些断裂的节段远远分开会出现一个或多个无着丝粒断片和一个缺失了节段远远分开会出现一个或多个无着丝粒断片和一个缺失了部分染色质并带有丝粒的异常染色体。细胞再次分裂时会形部分
16、染色质并带有丝粒的异常染色体。细胞再次分裂时会形成微核或微小体。成微核或微小体。|（3）环状染色体（）环状染色体（ring chromosome）：染色体两臂各发生）：染色体两臂各发生一次断裂，其带有着丝粒的节段的两断端连接成一个环，称一次断裂，其带有着丝粒的节段的两断端连接成一个环，称之为环状染色体。之为环状染色体。|（4）倒位）倒位(inversion)：当染色体发生两次不同部位断裂时，：当染色体发生两次不同部位断裂时，中间节段倒转中间节段倒转1800再重接，为倒位。再重接，为倒位。|（5）插入和重复）插入和重复(insertion and duplication)：当一个染色体：当一个染
17、色体发生三处断裂，带有两断段的断片插入到另一臂的断裂处或发生三处断裂，带有两断段的断片插入到另一臂的断裂处或另一染色体的断裂处重接称为插入，若缺失的染色体和插入另一染色体的断裂处重接称为插入，若缺失的染色体和插入的染色体是同源染色体，且各有一处断裂发生于同一位点，的染色体是同源染色体，且各有一处断裂发生于同一位点，则出现两段相同节段，称为重复。则出现两段相同节段，称为重复。|（6）易位）易位(translocation)：从某个染色体断下的节段连接到：从某个染色体断下的节段连接到另一个染色体上称为易位。两染色体各发生一次断裂，只一另一个染色体上称为易位。两染色体各发生一次断裂，只一个节段连到另
18、一染色体上为单方易位，相互重接为相互易位，个节段连到另一染色体上为单方易位，相互重接为相互易位，若发生若发生3处以上的断裂，其交换重接称为复杂易位。处以上的断裂，其交换重接称为复杂易位。1515染色体缺失及环状染色体的形成图染色体缺失及环状染色体的形成图染色体插入和重复示意图染色体插入和重复示意图1616染色体的臂间倒位染色体的臂间倒位染色体相互易位示意图染色体相互易位示意图1717|(二二)、染色体畸变、染色体畸变(chromosome aberration)chromosome aberration)化化学学毒毒物物致致突突变变的的类类型型1818|(三三三三)、基因组突变、基因组突变、基
19、因组突变、基因组突变 z1 1非非整整倍倍体体 非非整整倍倍体体(aneuploid)aneuploid)指指细细胞胞丢丢失失或或增增加加一一条条或或几几条条染染色色体体。缺缺失失一一条条染染色色体体时时称称为为单单体体(monosome)monosome)，增增 加加 一一 条条 染染 色色 体体 时时 称称 为为 三三 体体(trisome)trisome)。染染色色体体数数目目的的改改变变会会导导致致基基因因平平衡衡的的失失调调，可可能能影影响响细细胞胞的的生生存存或或造造成成形形态态及及功功能能上上的的异常。如异常。如2121三体导致先天愚型三体导致先天愚型(DownDown氏综合征氏
20、综合征)。z2 2整整倍倍体体 整整倍倍体体(euploid)euploid)指指染染色色体体数数目目的的异异常常是是以以染染色色体体组组为为单单位位的的增增减减，如如形形成成三三倍倍体体(triploid)triploid)、四四倍倍体体(tetroploid)tetroploid)等等。在在人人体体，3 3n n为为6969条条染染色色体体，4 4n n为为9292条条染染色色体体。在在肿肿瘤瘤细细胞胞及及人人类类自自然然流流产产的的胎胎儿儿细细胞胞中中可可有有三三倍倍体体细细胞胞的的存存在在。发生于生殖细胞的整倍体改变，几乎都是致死性的。发生于生殖细胞的整倍体改变，几乎都是致死性的。化化
21、学学毒毒物物致致突突变变的的类类型型1919致突变作用的机制|三三 致突变作用机理致突变作用机理|一、一、DNADNA损伤与突变损伤与突变z1.碱基错配碱基错配(共价结合共价结合)z2.嵌入嵌入DNA链链z3.碱基类似物的取代碱基类似物的取代z4.碱基的化学结构改变或破坏碱基的化学结构改变或破坏 2020|二、二、DNA损伤的修复损伤的修复|遗传信息之所以能长期保持高度保遗传信息之所以能长期保持高度保真真(fidelity)即重现精度，是由于细胞能即重现精度，是由于细胞能够够:|通过对通过对DNA损伤的修复以保护亲代损伤的修复以保护亲代DNA链，使之避免由于外来因素的作用链，使之避免由于外来因
22、素的作用而发生改变；而发生改变；|执行高度保真的复制，即对复制中执行高度保真的复制，即对复制中发生的错误及时修复以达到高度保真性。发生的错误及时修复以达到高度保真性。|现已证明突变频率与各种酶性现已证明突变频率与各种酶性DNA修复和防错系统的效率呈负性相关。但修复和防错系统的效率呈负性相关。但也有一些是易错也有一些是易错(error-prone)修复系统。修复系统。2121|机体修复机体修复DNADNA损伤的机制可分为两大类：损伤的机制可分为两大类：1.损损伤伤耐耐受受机机制制：指指DNA遗遗传传可可绕绕过过那那些些阻阻止止DNA 复制的复制的DNA损伤。损伤。2.修复机制：修复机制：DNA修
23、复修复直接修复直接修复切除修复切除修复O6甲基鸟嘌呤修复甲基鸟嘌呤修复光修复光修复错配碱基修复错配碱基修复碱基切除修复碱基切除修复核苷酸切除修复核苷酸切除修复机体对致突变作用的影响复制后修复复制后修复呼救性修复呼救性修复2222|估计的人类内源性估计的人类内源性DNA损伤和修复过程损伤和修复过程损伤类型损伤发生率最大修复速度脱嘌呤1000a脱嘧啶55a胞嘧啶脱氨15a单链断裂50002105N7甲基化鸟嘌呤3500aO6甲基化鸟嘌呤130104氧化性产物120105注：损伤发生率以每小时每细胞发生次数计，最大修注：损伤发生率以每小时每细胞发生次数计，最大修复速度以每小时每细胞修复的碱基对数计，
24、复速度以每小时每细胞修复的碱基对数计，a指虽已测指虽已测出实际的值，但估计最大修复速度为发生率的出实际的值，但估计最大修复速度为发生率的2倍以上倍以上23231、复制前修复、复制前修复|光复活：光复活：最常见的紫外线对最常见的紫外线对DNA的损伤：相邻的损伤：相邻2个个胸腺嘧啶形成二聚体。胸腺嘧啶形成二聚体。修复：在长波紫外线或短波可见光诱导修复：在长波紫外线或短波可见光诱导下，光裂合酶可催化嘧啶二聚体进行单体下，光裂合酶可催化嘧啶二聚体进行单体化。在人类未得到充分证明。化。在人类未得到充分证明。|“适应性适应性”反应反应 低剂量烷化剂可诱导一种专一蛋白质（酶）低剂量烷化剂可诱导一种专一蛋白质
25、（酶）的合成，这种酶称为烷基转移酶或烷基受的合成，这种酶称为烷基转移酶或烷基受体蛋白。体蛋白。可将结合到碱基上（鸟嘌呤）的烷基转移可将结合到碱基上（鸟嘌呤）的烷基转移到酶本身的半光氨酸到酶本身的半光氨酸-SH基上，恢复嘌呤本基上，恢复嘌呤本身的结构。身的结构。多种细胞中存在。多种细胞中存在。2424|切除修复切除修复 多步骤修复过程。在多种酶的作用下，将受多步骤修复过程。在多种酶的作用下，将受损伤的碱基或异常核苷酸切除。损伤的碱基或异常核苷酸切除。包括损伤部位识别外切酶、内切酶、连接酶包括损伤部位识别外切酶、内切酶、连接酶等。等。能修复能修复UV、加合等多种形式的、加合等多种形式的DNA损伤。
26、损伤。2、复制过程中的修复、复制过程中的修复 损伤保留至复制时修复，容易发生错误。有损伤保留至复制时修复，容易发生错误。有些损伤保留至复制时才得以修复。些损伤保留至复制时才得以修复。3-5外切核酸酶，具有校正读码功能，修复外切核酸酶，具有校正读码功能，修复复制过程中的错误。复制过程中的错误。3、复制后修复（、复制后修复（SOS修复修复)仅限于原核生物。仅限于原核生物。2525|总之，任何总之，任何DNA损伤，只要修复损伤，只要修复无误，突变就不会发生；如果修复无误，突变就不会发生；如果修复错误或未经修复，损伤就得以固定错误或未经修复，损伤就得以固定(fixed)下来下来,于是发生突变。因此诱于
27、是发生突变。因此诱发突变是一个受控制的过程，失控发突变是一个受控制的过程，失控才真正发生突变。一般来说从才真正发生突变。一般来说从DNA损伤到损伤固定需要几次细损伤到损伤固定需要几次细胞分裂周期才能形成。胞分裂周期才能形成。2626突变的不良后果突变的不良后果突变的不良后果突变的不良后果突变的不良后果 体细胞突变体细胞突变体细胞突变体细胞突变 生殖细胞突变生殖细胞突变生殖细胞突变生殖细胞突变 癌癌癌癌变变变变致致致致畸畸畸畸衰衰衰衰老老老老配配配配子子子子死死死死亡亡亡亡死死死死胎胎胎胎自自自自发发发发流流流流产产产产先先先先天天天天畸畸畸畸形形形形四、突变的不良后果四、突变的不良后果2727
28、|体细胞突变的后果中最受注意的是致癌问题，体细胞突变的后果中最受注意的是致癌问题，将在下一节叙述。其次，胚胎体细胞突变可能导将在下一节叙述。其次，胚胎体细胞突变可能导致畸胎，当然，畸胎的发生还与亲代的生殖细胞致畸胎，当然，畸胎的发生还与亲代的生殖细胞突变有关。据报道人类妊娠最初突变有关。据报道人类妊娠最初3个月流产中有个月流产中有60%有染色体畸变，在一定程度上这是致突变物有染色体畸变，在一定程度上这是致突变物透过胎盘作用于胚胎体细胞所致，而不完全是亲透过胎盘作用于胚胎体细胞所致，而不完全是亲代生殖细胞突变的后果。代生殖细胞突变的后果。|体细胞突变也可能与动脉粥样硬化症有关。因体细胞突变也可能
29、与动脉粥样硬化症有关。因为对于正常动脉壁细胞中的葡糖为对于正常动脉壁细胞中的葡糖-6-磷酸脱氢酶有磷酸脱氢酶有两种变异体，而从动脉粥样硬化症同一斑块取下两种变异体，而从动脉粥样硬化症同一斑块取下的细胞在电泳中只表现为同一种变异体，故认为的细胞在电泳中只表现为同一种变异体，故认为动脉粥样硬化斑块是单克隆来源。动脉粥样硬化斑块是单克隆来源。|体外培养的人类非恶性转化细胞，其寿命都有体外培养的人类非恶性转化细胞，其寿命都有限。这些细胞在传代过程中，细胞遗传学异常率限。这些细胞在传代过程中，细胞遗传学异常率逐渐增高，而有丝分裂逐渐下降，因此可以推测，逐渐增高，而有丝分裂逐渐下降，因此可以推测，体细胞突
30、变是衰老的起因，最低限度在体外如此。体细胞突变是衰老的起因，最低限度在体外如此。另外，另外，DNA修复能力缺陷与成熟的早衰老综合征修复能力缺陷与成熟的早衰老综合征也有一定关系。也有一定关系。2828|二、生殖细胞突变的后果二、生殖细胞突变的后果|如果突变发生在生殖细胞，无论其发生如果突变发生在生殖细胞，无论其发生在任何阶段，都存在对后代影响的可能性，在任何阶段，都存在对后代影响的可能性，其影响后果可分为致死性和非致死性两种。其影响后果可分为致死性和非致死性两种。致死性影响可能是显性致死和隐性致死。显致死性影响可能是显性致死和隐性致死。显性致死即突变配子与正常配子结合后，在着性致死即突变配子与正
31、常配子结合后，在着床前或着床后的早期胚胎死亡。隐性致死要床前或着床后的早期胚胎死亡。隐性致死要纯合子或半合子才能出现死亡效应。纯合子或半合子才能出现死亡效应。|如果生殖细胞突变为非致死性，则可能出如果生殖细胞突变为非致死性，则可能出现显性或隐性遗传病，包括先天性畸形。在现显性或隐性遗传病，包括先天性畸形。在遗传性疾病频率与种类增多时，突变基因及遗传性疾病频率与种类增多时，突变基因及染色体损伤，将使基因库负荷增加。染色体损伤，将使基因库负荷增加。|基因库基因库(gene pool)是指一种物种的群体中是指一种物种的群体中生殖细胞内具有的、并能传给后代的基因总生殖细胞内具有的、并能传给后代的基因总
32、和。和。|遗传负荷遗传负荷(genetic load)系一种物种群体中系一种物种群体中每一个体携带的可遗传给后代的有害基因的每一个体携带的可遗传给后代的有害基因的水平。水平。2929|五、致突变性评价方法五、致突变性评价方法|检测外来化学物的致突变性一般通检测外来化学物的致突变性一般通过过致突变实验致突变实验来进行。来进行。|其目的主要有两点：其目的主要有两点：|检测外源化学物的致突变性，检测外源化学物的致突变性，预测其对哺乳动物和人的预测其对哺乳动物和人的致癌性致癌性；|检测外源化学物对哺乳动物检测外源化学物对哺乳动物生殖细胞的遗传毒性，预测其对人生殖细胞的遗传毒性，预测其对人体的体的遗传危
33、害性遗传危害性。3030|1、常用的致突变试验、常用的致突变试验 z(一一)细菌回复突变试验细菌回复突变试验(AmesAmes试验试验)鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌原养型原养型(his+)组氨酸营养缺陷型突组氨酸营养缺陷型突变株。变株。(his-)正向突变正向突变回复突变回复突变代谢活化系统代谢活化系统受试物受试物观观观观察察察察化化化化学学学学毒毒毒毒物物物物致致致致突突突突变变变变作作作作用用用用的的的的基基基基本本本本方方方方法法法法 原理：利用一种突变微生物菌株与被检测化学物接原理：利用一种突变微生物菌株与被检测化学物接触，使突变型微生物回复突变，重新成为野生型微生触，使突变型微生物回
34、复突变，重新成为野生型微生物。物。突变型微生物不具备合成组氨酸的能力，不能在不突变型微生物不具备合成组氨酸的能力，不能在不含（或低浓度）组氨酸培养基上生长。含（或低浓度）组氨酸培养基上生长。3131|方法：方法：|将突变型沙氏菌在不含（或低浓度）组氨酸培养基将突变型沙氏菌在不含（或低浓度）组氨酸培养基上培养上培养,以其生长状况作为指标。以其生长状况作为指标。|在培养基中加入哺乳动物的肝细胞微粒体：提高灵在培养基中加入哺乳动物的肝细胞微粒体：提高灵敏度。敏度。|特点：优点：简便、灵敏、快速（简便、灵敏、快速（48h）、费用低；）、费用低；检测结果与对动物的致癌性的相符率达约检测结果与对动物的致癌
35、性的相符率达约90%。缺点：利用微生物作为供试物，不能全面反映哺乳动物的遗利用微生物作为供试物，不能全面反映哺乳动物的遗传信息，仅传信息，仅1/6；微生物的微生物的DNA修复系统与动物有差异；修复系统与动物有差异；微生物无免疫功能。微生物无免疫功能。3232（二）、哺乳动物体细胞突变试验 （1）方法原理与微生物突变类似。）方法原理与微生物突变类似。常用的细胞株：中国地鼠肺细胞中国地鼠肺细胞V79 中国地鼠肺卵巢细胞中国地鼠肺卵巢细胞(CHO）小鼠淋巴瘤小鼠淋巴瘤L5178Y细胞株。细胞株。3333V79、CHO细胞株正常细胞：缺乏利用嘌呤碱的酶缺乏利用嘌呤碱的酶HGPRT，不能在加入类嘌呤碱类
36、物质，不能在加入类嘌呤碱类物质的培养基上生长；的培养基上生长；突变细胞：可在加入类嘌呤碱类物质的可在加入类嘌呤碱类物质的培养基上生长。培养基上生长。L5178Y突变细胞株正常细胞：缺乏胸苷激酶（缺乏胸苷激酶（TK），不），不可在含有细胞毒物可在含有细胞毒物5-溴脱氧尿苷的培养溴脱氧尿苷的培养基上生长。基上生长。突变细胞：可在此种培养基上生长。可在此种培养基上生长。3434(三三)微核试验微核试验 微核微核(Micronucleus)Micronucleus)的产生与染色体损伤有关，的产生与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢
37、失的整个染色体，在细胞分裂后期受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，因几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称微核。比主核小，故称微核。在细胞质中微核来源有在细胞质中微核来源有二：断片或无着丝粒染色体在细胞分裂后期不二：断片或无着丝粒染色体在细胞分裂后期不能定向移动，而遗留在细胞质中；有丝分裂毒能定向移动，而遗留在细胞质中；有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带苔丝粒的染色体环物的作用使个别染色体或带苔丝粒的染色体环和断片在细胞分裂后期被留在细胞质中。和断片在细胞分
38、裂后期被留在细胞质中。微核试验微核试验(Micronucleus testMicronucleus test，MNT)MNT)是观察是观察受试物能否产生微核的试验。其主要可检出受试物能否产生微核的试验。其主要可检出DNADNA断裂剂和非整倍体诱变剂断裂剂和非整倍体诱变剂。观观观观察察察察化化化化学学学学毒毒毒毒物物物物致致致致突突突突变变变变作作作作用用用用的的的的基基基基本本本本方方方方法法法法3535观观观观察察察察化化化化学学学学毒毒毒毒物物物物致致致致突突突突变变变变作作作作用用用用的的的的基基基基本本本本方方方方法法法法(三三)微核试验微核试验3636MNNCE观观观观察察察察化化化
39、化学学学学毒毒毒毒物物物物致致致致突突突突变变变变作作作作用用用用的的的的基基基基本本本本方方方方法法法法3737z(四四)染色体畸变分析染色体畸变分析 z(五五)姐妹染色单体交换试验（姐妹染色单体交换试验（SCE）观观观观察察察察化化化化学学学学毒毒毒毒物物物物致致致致突突突突变变变变作作作作用用用用的的的的基基基基本本本本方方方方法法法法3838染色体畸变试验：染色体畸变试验：直接在显微镜下观察染色体结构和直接在显微镜下观察染色体结构和数目的改变情况。生殖细胞或体细胞、数目的改变情况。生殖细胞或体细胞、体外或体内试验。体外或体内试验。体外：体外：CHO细胞细胞:分裂快、数目适分裂快、数目适
40、中、形态清晰；中、形态清晰；人类外周血淋巴细胞体内：受试动人类外周血淋巴细胞体内：受试动物骨髓细胞或其他（胸腺、脾、精原物骨髓细胞或其他（胸腺、脾、精原细胞）染色体畸变率的变化。细胞）染色体畸变率的变化。3939试验方法：试验方法：a.体外培养：体外培养：CHO细胞或人类外周血淋巴细胞与细胞或人类外周血淋巴细胞与化学物，在细胞培养液（化学物，在细胞培养液（DMEM,RPM,1640或或1999）中，）中，370C下培养下培养24h(CHO)或或72h(人类细胞）。观察前人类细胞）。观察前2h加入秋水仙碱（中期分裂阻断剂），加入秋水仙碱（中期分裂阻断剂），制片，镜检观察。制片，镜检观察。b.体内
41、染色体畸变分析：大鼠、小体内染色体畸变分析：大鼠、小鼠，染毒饲养，观察骨髓细胞染色体畸鼠，染毒饲养，观察骨髓细胞染色体畸变情况。变情况。4040|二、常用的致突变试验二、常用的致突变试验z(五五)果蝇伴性隐性致死试验果蝇伴性隐性致死试验z(六六)显性致死试验显性致死试验z(七七)程序外程序外DNA台成试验台成试验 z(八八)转基因动物致突变试验转基因动物致突变试验z(九九)哺乳动物细胞基因突变试验哺乳动物细胞基因突变试验观观观观察察察察化化化化学学学学毒毒毒毒物物物物致致致致突突突突变变变变作作作作用用用用的的的的基基基基本本本本方方方方法法法法4141|三、致突变试验中的一些问题三、致突变试
42、验中的一些问题 z(一一)阴性和阳性对照的设立阴性和阳性对照的设立 1 1阴性对照阴性对照 它是空白对照，即不加任何处理。它是空白对照，即不加任何处理。或者是溶剂对照。阴性对照除了无处理因素外，或者是溶剂对照。阴性对照除了无处理因素外，与实验组完全相同。其目的是获得实验的基础与实验组完全相同。其目的是获得实验的基础数据。例如，数据。例如，AmesAmes试验的阴性对照可了解所用试验的阴性对照可了解所用的细菌的自发回复突变率；证实除处理因素外的细菌的自发回复突变率；证实除处理因素外无任何使回复突变率增加或减少的因素。无任何使回复突变率增加或减少的因素。2 2阳性对照阳性对照 是用某种已知能产生阳
43、性反应是用某种已知能产生阳性反应的物质作为对照。其目的是通过对阳性物质的的物质作为对照。其目的是通过对阳性物质的试验证明实验方法的可靠；验证实验者在本实试验证明实验方法的可靠；验证实验者在本实验条件下，完成技术和鉴定致突变物的能力；验条件下，完成技术和鉴定致突变物的能力；证实经一段时间后，本实验的重复性。例如，证实经一段时间后，本实验的重复性。例如，AmesAmes试验中阳性对照未出现阳性结果，应考虑试验中阳性对照未出现阳性结果，应考虑突变菌株可能发生问题，另一种可能是代谢活突变菌株可能发生问题，另一种可能是代谢活化能力不足。所以，当阳性对照结果未呈阳性，化能力不足。所以，当阳性对照结果未呈阳
44、性，其实验组的实验数据可靠性亦大大降低。其实验组的实验数据可靠性亦大大降低。观观观观察察察察化化化化学学学学毒毒毒毒物物物物致致致致突突突突变变变变作作作作用用用用的的的的基基基基本本本本方方方方法法法法4242|三、致突变试验中的一些问题三、致突变试验中的一些问题z(二二)体外试验的活化系统体外试验的活化系统 1 1哺乳动物细胞介导哺乳动物细胞介导 使用完整的细胞，特别是使用完整的细胞，特别是大鼠肝原代细胞，与测试细菌或细胞一起培养。这大鼠肝原代细胞，与测试细菌或细胞一起培养。这也是一种活化系统。它有完整的细胞结构和各种酶也是一种活化系统。它有完整的细胞结构和各种酶及内源性辅助因子，代谢能力
45、优于无细胞系统如及内源性辅助因子，代谢能力优于无细胞系统如S9S9，但不如体内活化系统。但不如体内活化系统。2 2S9 S9S9 S9指经酶诱导剂处理后制备的肝匀浆，再指经酶诱导剂处理后制备的肝匀浆，再经经90009000g g离心分离所得上清液，加上适当的缓冲液离心分离所得上清液，加上适当的缓冲液和辅助因子。它主要含有混合功能氧化酶和辅助因子。它主要含有混合功能氧化酶(MFO)MFO)，是国内常规应用于体外致突变试验的代谢活化系统，是国内常规应用于体外致突变试验的代谢活化系统，其缺点是其缺点是S9S9随实验动物种属或器官不同而有差异；随实验动物种属或器官不同而有差异；S9S9含有的大量亲核物
46、质有可能影响试验的敏感性。含有的大量亲核物质有可能影响试验的敏感性。3 3纯化酶和基因工程纯化酶和基因工程 应用纯化细胞色素应用纯化细胞色素P-450P-450、谷胱苷肽转移酶及过氧化物水解酶，可严格控制代谷胱苷肽转移酶及过氧化物水解酶，可严格控制代谢产物诱发突变的条件，但技术难度大。利用基因谢产物诱发突变的条件，但技术难度大。利用基因工程，将人的细胞色素工程，将人的细胞色素P-450P-450基因，插入组合细胞基因，插入组合细胞内，用上述细胞进行致突变试验，使细胞具有代谢内，用上述细胞进行致突变试验，使细胞具有代谢活化系统。活化系统。观观观观察察察察化化化化学学学学毒毒毒毒物物物物致致致致突
47、突突突变变变变作作作作用用用用的的的的基基基基本本本本方方方方法法法法4343|三、致突变试验中的一些问题三、致突变试验中的一些问题z(三三)致突变试验与致癌试验的关系致突变试验与致癌试验的关系 已知大多数化学致癌物具有致突变作用，遗已知大多数化学致癌物具有致突变作用，遗传学改变在原癌基因激活和抑癌基因失活上起传学改变在原癌基因激活和抑癌基因失活上起主要作用，致癌物诱致关键靶基因遗传改变的主要作用，致癌物诱致关键靶基因遗传改变的直接作用等在哺乳动物实验中证实。直接作用等在哺乳动物实验中证实。发现人类接触致癌物与发现人类接触致癌物与DNADNA加合物，同其肿瘤加合物，同其肿瘤中癌基因和抑癌基因的
48、特异碱基对突变之间具中癌基因和抑癌基因的特异碱基对突变之间具有相关性。有相关性。传统的长期致癌试验，花费大，周期长，不传统的长期致癌试验，花费大，周期长，不能适应化学物质快速增长的需要。此外，致癌能适应化学物质快速增长的需要。此外，致癌试验所用动物数量有限，难以检出弱的致癌物。试验所用动物数量有限，难以检出弱的致癌物。需要发展多种体内和体外短期试验，用于对化需要发展多种体内和体外短期试验，用于对化学物质致癌性进行筛检。学物质致癌性进行筛检。观观观观察察察察化化化化学学学学毒毒毒毒物物物物致致致致突突突突变变变变作作作作用用用用的的的的基基基基本本本本方方方方法法法法4444|三、致突变试验中的
49、一些问题三、致突变试验中的一些问题z(四四)试验结果在毒理学安全性评价中的作用试验结果在毒理学安全性评价中的作用 阴性结果判定条件：阴性结果判定条件：最高剂量应包括受试物溶解度许可或灌胃量最高剂量应包括受试物溶解度许可或灌胃量许可的最大剂量。如该剂量毒性很大，则体内许可的最大剂量。如该剂量毒性很大，则体内试验和细菌试验应为最大耐受量。使用哺乳动试验和细菌试验应为最大耐受量。使用哺乳动物细胞进行体外试验，常选物细胞进行体外试验，常选LDLD5050或或LDLD8080为最大剂为最大剂量。溶解度大、毒性低的化学物，在细菌试验量。溶解度大、毒性低的化学物，在细菌试验中可以中可以50005000gg皿
50、作为最高剂量。皿作为最高剂量。各剂量组的组间差距不应过大，以防漏检仅各剂量组的组间差距不应过大，以防漏检仅在非常狭窄范围内才有突变能力的某些化学毒在非常狭窄范围内才有突变能力的某些化学毒物。满足上述条件，仍为阴性，才慎重下结论。物。满足上述条件，仍为阴性，才慎重下结论。观观观观察察察察化化化化学学学学毒毒毒毒物物物物致致致致突突突突变变变变作作作作用用用用的的的的基基基基本本本本方方方方法法法法4545|三、致突变试验中的一些问题三、致突变试验中的一些问题z(四四)试验结果在毒理学安全性评价中试验结果在毒理学安全性评价中的作用的作用阳性结果应具有剂量阳性结果应具有剂量反应关系，即随反应关系，即