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1、二园艺植物cDNA文库的构建ppt课件 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望二、园艺植物cDNA文库的构建(一)普通cDNA文库的构建3.双链cDNA的合成置换合成法利用Rnase H将杂交双链中的mRNA降解,形成多段仍与cDNA第一链保持杂交的RNA片段.利用这些RNA片段作为引物,引导合成第二链cDNA.随着合成产物的延伸,除5末端的RNA引物外,所有作为引物的RNA片段均被新合成的互补链所置换.通过DNA连接酶作用,将各段互补链连接成完整DNA链
2、。除去残存的5末端RNA片段，并用T4DNA聚合酶削平3端突出的单链cDNA,得到一个双链形式的cDNA片段.该方法直接利用第一链反应产物,避免了中间处理和纯化过程造成的cDNA损失,是目前合成cDNA第二链的常用方法.二、园艺植物cDNA文库的构建(二)新型cDNA文库的构建1.PCR介导的cDNA文库原理:以cDNA第一链为模板,设计一组引物,通过PCR扩增获得多拷贝双链cDNA。优点：增加低丰度mRNA的克隆机会;利用仅有的几个细胞或微量的mRNA建立较大的cDNA文库。缺点：PCR合成的片段一般较短，大片段的全长扩增困难；扩增过程中错误掺入率甚高；由于PCR对短片段的扩增效率高于长片段
3、，故mRNA的原始丰度难以在文库中体现。应用：适合于克隆来源困难的组织或细胞的基因。(二)新型cDNA文库的构建2.标准化cDNA文库定义:某一特定组织或细胞的所有表达基因均包含其中,且含量相等的cDNA文库。优点：增加了克隆丰度极低的mRNA的机会。能发现普通cDNA探针所不能发现的稀有转录区。能估计大多数基因的表达水平，并发现组织特异性基因。二、园艺植物cDNA文库的构建二、园艺植物cDNA文库的构建(二)新型cDNA文库的构建2.标准化cDNA文库构建方法用基因组DNA做选择杂交,所捕获的cDNA丰度与对应的基因组DNA丰度一致,其缺点是约20%的非单一拷贝基因在构建的文库中丰度偏高。根
4、据cDNA退火的二级动力学特征，即稀有拷贝的cDNA较丰度拷贝的cDNA复性或杂交慢,使未复性部分的单链cDNA渐趋等化。三、目的基因的筛选1.根据目的基因的核苷酸序列筛选根据基因序设计引物,以基因组DNA或mRNA反转录的cNDA为模板进行PCR扩增.如果得到的只是基因部分序列,可以将其克隆至载体,作为探针筛选cDNA文库和基因组文库获得全长基因.用探针直接筛选库,若能得到其它植物已分离的相关基因,则可以直接用作探针筛选cDNA文库和基因组文库,获得研究植物的目的基因.三、目的基因的筛选2.根据目的基因的核苷酸序列筛选如果已知基因表达产物(蛋白质)的氨基酸序列,就可以反推出原来基因的核苷酸序
5、列。从N端对10多个连续的氨基酸进行序列测定，选择连续6个以上简并程度最低的氨基酸，按各种可能的序列结构合成寡核苷酸探针库，从cDNA文库和基因组文库中筛选全长的基因.缺点:在实验中得到纯度高、数量足够的目的基因表达产物(蛋白质)是很困难的,蛋白质测序也花费较高,难度较大.三、目的基因的筛选3.PCR法筛选基因文库将基因文库分装96孔培养板.培养一段时间后，分别从同一行或同一列孔中吸取少量培养物合并。以此混合物为模板进行PCR扩增，根据凝胶电泳的结果判定相应行或列混合孔中是否含有阳性克隆。对含有阳性克隆的行或列孔中培养物再次分装，经培养后进行第二轮PCR扩增。如此反复操作，直至获得阳性克隆。一
6、、分离基因的程序(一)图位克隆技术的定义及原理定义:根据目标基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法.原理:首先找到一个是以与目标基因相连的DNA分子标记,然后通过染色体步移技术克隆分离出目标基因.当基因与标记之间的距离小于基因组文库中克隆的平均插入片段大小时,就要可直接筛选到含有目标基因的克隆,这种方法称为染色体登陆(chromosome landing)一、分离基因的程序(二)分离基因的程序目的基因的初步定位 利用分子遗传图谱确定与目的基因连锁的分子标记。目的基因区域的物理作图 将分子标记之间的遗传距离（cM）转化为物理距离(碱基数),构成该基因区域的物理图谱.构建并筛选含有大插入片段的
7、基因组文库.用与目标基因连锁的分子标记为探针筛选大片段基因组文库，获得阳性克隆。一、分离基因的程序(二)分离基因的程序构建目的基因区域跨叠克隆群 以阳性克隆的末端作为探针筛选基因组文库，获得含有目标基因两侧分子标记的大片段跨叠群目的基因的精细定位和染色体登陆 以目标基因两侧的分子标记为探针，通过染色体登陆获得含目标基因的阳性克隆。外显子的分离和鉴定 利用筛选cDNA文库,外显子捕捉等技术获得候选基因，通过功能互补实验确定目标基因。二、cDNA末端快速扩增技术1.基本步骤从GenBank等公共数据库中,比较分析待克隆基因的保守序列区段。以此保守序列设计特异或简并引物，从待测植物组织的cDNA中进
8、行PCR扩增,获得待分离基因的cDNA片段.通过RACE技术获得cDNA的5和3端,并与已知基因序列进行同源性比较.转化鉴定是否为待分离的基因。二、cDNA末端快速扩增技术2.3RACE利用绝大部分mRNA的3末端具有poly(A),以oligo(dT)和一个接头组成的接头引物(adaptor primer,AP)反转录mRNA,得到加接头的第一链cDNA根据已获得的待分离基因cDNA片段设计两条特异引物GSP1(gene specific primer 1,GSP1)和GSP2，分别与已知的接头引物进行巢式扩增，从而获得该基因的3端。二、抑制性消减杂交技术1.原理以抑制PCR为基础的cDNA
9、消减杂交.所谓抑制PCR是利用非目标基因片段两端的长方向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构，无法作为模板与引物配对，选择性地抑制了非目的基因片段的扩增。二、抑制性消减杂交技术2.基本步骤提取含有目的基因的待测组织(tester)和不含目的基因的对照组织(driver)的mRNA,并反转录为cDNA.用限制性内切酶将两种不同的cDNA切割为小片段.将test cDNA分为两份,分别连接不同的接头。用过量的driver cDNA分别与这两种test cDNA进行第一次消减杂交,会产生:单链tester,双链tester/tester,双链tester/driver,单链driver及 双链dr
10、iver/driver二、抑制性消减杂交技术2.基本步骤混合两份杂交样品,并加入新的变性driver cDNA进行第二次消减杂交,从而形成一种新的杂交组分,即分别含有不同接头的双链cDNA分子(tester-adaptor 1/tester-adaptor 2).补平变性后分子的黏性末端.以接头1和接头2序列为引物对其进行第一轮PCR。用与接头内侧序列互补的另一对引物进行第二轮PCR，富集差异表达的目的基因片段。用第二轮PCR产物构建相应的差减cDNA文库，克隆差异表达基因。二、抑制性消减杂交技术优缺点优点：假阳性率大大降低，阳性检出率为50%以上；目的序列富集程度较高，且丰度相对一致，确保了低丰度表达的cDNA有被检测的可能极大地提高了检测效率;灵敏度高,重复性强.缺点:需要较多的起始材料的mRNA,因而某些特殊样本不容易获得;更多地依赖于PCR技术;不能同时对数个材料进行比较;材料之间存在的过多差异及小片段缺失也不能有效地被检测.三、代表性差异分析法1.原理以差减杂交为基础，从基因组水平筛选和克隆基因的方法；充分利用了PCR反应中双引物以指数形式扩增双链模板，而单引物仅以线性形式扩增单链模板这一特性，并通过降低cDNA群体复杂性和多次更换cDNA两端接头等方法,特异地扩增目的基因片段.