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1、液相色谱基本原理液相色谱基本原理陕西科仪科技有限公司陕西科仪科技有限公司一、概论一、液相色谱理论发展简况一、液相色谱理论发展简况色谱法的分别原理是：溶于流淌相色谱法的分别原理是：溶于流淌相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、安排、离子发生作用（吸附、安排、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。又称为色层法、层析法。色谱法最早是
2、由俄国植物学家茨维特（色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在在1906年探讨用碳酸钙分别植物色素时发觉的，年探讨用碳酸钙分别植物色素时发觉的，色谱法色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。法、液相色谱法。二、基本原理液相色谱法起先阶段是用大直径的玻璃管柱在室温顺常压下用液位差输送流淌相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在
3、经典液相色谱法的基础上，于60年头后期引入了气相色谱理论而快速发展起来的。它与经典液相色谱法的区分是填料颗粒小而匀整，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流淌相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。色谱法分类色谱法分类按两相的物理状态可分为：气相色谱法按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法和液相色谱法(LC)。气相色谱法适用于分别挥发性化合物。气相色谱法适用于分别挥发性
4、化合物。GC依据固定相依据固定相不同又可分为气固色谱法不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法和气液色谱法(GLC)，其中以，其中以GLC应用最广。液相色谱法适用于分别低挥发性或非挥发性、应用最广。液相色谱法适用于分别低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。热稳定性差的物质。LC同样可分为液固色谱法同样可分为液固色谱法(LSC)和液液和液液色谱法色谱法(LLC)。此外还有超临界流体色谱法。此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临，它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流淌相（常用界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流淌相（常用CO2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析
5、时间短，），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短，特殊适用于手性化合物的拆分。特殊适用于手性化合物的拆分。按原理分为吸附色谱法按原理分为吸附色谱法(AC)、安排色谱法、安排色谱法(DC)、离子交换色、离子交换色谱法谱法(IEC)、排阻色谱法、排阻色谱法(EC，又称分子筛、凝胶过滤，又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法。（此外还有电泳。）和亲和色谱法。（此外还有电泳。）按操作形式可分为纸色谱法按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法、薄层色谱法(TLC)、柱色、柱色谱法。谱法。四、色谱分别原理四、色谱分别原理高效液相色谱法按分别机制的不同
6、分为液固吸附色谱法、高效液相色谱法按分别机制的不同分为液固吸附色谱法、液液安排色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子液液安排色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。对色谱法及分子排阻色谱法。1液固色谱法运用固体吸附剂，被分别组分在色谱柱液固色谱法运用固体吸附剂，被分别组分在色谱柱上分别原理是依据固定相对组分吸附力大小不同而分别。上分别原理是依据固定相对组分吸附力大小不同而分别。分别过程是一个吸附解吸附的平衡过程。常用的吸附剂分别过程是一个吸附解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度为硅胶或氧化铝，粒度510m。适用于分别分子量。适用于分别分子量2001
7、000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分别同分异构体。化合物易产生拖尾。常用于分别同分异构体。2液液色谱法运用将特定的液态物质涂于担体表面，液液色谱法运用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分别原理是依据或化学键合于担体表面而形成的固定相，分别原理是依据被分别的组分在流淌相和固定相中溶解度不同而分别。分被分别的组分在流淌相和固定相中溶解度不同而分别。分别过程是一个安排平衡过程。别过程是一个安排平衡过程。涂布式固定相应具有良好的惰性；流淌相必需预先用固定相饱和，以削减固定相从担体表面流失；温度的
8、变更和不同批号流淌相的区分常引起柱子的变更；另外在流淌相中存在的固定相也使样品的分别和收集困难化。由于涂布式固定相很难避开固定液流失，现在已很少接受。现在多接受的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。液液色谱法按固定相和流淌相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。正相色谱法接受极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流淌相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调整组分的保留时间。常用于分别中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。反相色谱法一般用非极性固定相（如反相色谱法
9、一般用非极性固定相（如C18、C8）；流淌）；流淌相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调整保留时间。适用于分氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调整保留时间。适用于分别非极性和极性较弱的化合物。别非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的应用的80%左右。左右。随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围渐渐扩大，随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围渐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为限制样现已
10、应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为限制样品在分析过程的解离，常用缓冲液限制流淌相的品在分析过程的解离，常用缓冲液限制流淌相的pH值。值。但须要留意的是，但须要留意的是，C18和和C8运用的运用的pH值通常为值通常为2.57.5（28），太高的），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有新商品柱可在值会使键合的烷基脱落。有新商品柱可在pH 1.512范围范围操作。操作。3离子交换色谱法固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分别组分在色谱柱上分别
11、原理是树脂上可电离离子与流淌相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，依据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分别。缓冲液常用作离子交换色谱的流淌相。被分别组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分别子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流淌相的pH值和离子强度影响。pH值可改变更合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流淌相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。4离子对色谱法又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是依据被测组分别子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度
12、增大，从而使其分别效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。离子对色谱法常用ODS柱（即C18），流淌相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入310 mmol/L的离子对试剂，在确定的pH值范围内进行分别。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流淌相组成及其pH值、离子强度有关。5排阻色谱法固定相是有确定孔径的多孔性填料，流淌相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中
13、，干脆随流淌相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻实力的差异而完成分别。常用于分别高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等被分别组分在柱中的洗脱原理二、二、HPLC的特点和优点的特点和优点HPLC有以下特点：有以下特点：高压高压压力可达压力可达150300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。以上。高速高速流速为流速为0.110.0 ml/min。高效高效可达可达5000塔板每米。在一根柱中同时分别成份可达塔板每米。在一根柱中同时分别成份可达100种。种。高灵敏度高灵敏度紫外检测器灵敏度可达紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品。同
14、时消耗样品少。少。HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：与经典液相色谱相比有以下优点：速度快速度快通常分析一个样品在通常分析一个样品在1530 min，有些样品甚至在，有些样品甚至在5 min内即可完成。内即可完成。辨别率高辨别率高可选择固定相和流淌相以达到最佳分别效果。可选择固定相和流淌相以达到最佳分别效果。灵敏度高灵敏度高紫外检测器可达紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器，荧光和电化学检测器可达可达0.1pg。柱子可反复运用柱子可反复运用用一根色谱柱可分别不同的化合物。用一根色谱柱可分别不同的化合物。样品量少，简洁回收样品量少，简洁回收样品经过色谱柱后不被破坏样品经过色谱柱后不被
15、破坏*，可以，可以收集单一组分或做制备。收集单一组分或做制备。三、高效液相色谱仪高效液相色谱仪由 高压输液系统、进样系统、分别系统、检测系统、数据处理系统 等五大部分组成。见下图分析前，选择适当的色谱柱和流淌相，开泵，冲洗柱子，待柱子达到平衡而且基线平直后，用微量注射器把样品注入进样口，流淌相把试样带入色谱柱进行分别，分别后的组分依次流入检测器的流通池，最终和洗脱液一起排入流出物收集器。当有样品组分流过流通池时，检测器把组分浓度转变成电信号，经过放大，用记录器记录下来就得到色谱图。色谱图是定性、定量和评价柱效凹凸的依据。一、高压输液系统 高压输液系统由 溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置和压力表
16、 等组成。1.溶剂贮存器 溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为1到2 L，用来贮存足够数量、符合要求的流淌相。2.高压输液泵 高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一，其功能是 将溶剂贮存器中的流淌相以高压形式连绵不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分别过程。由于液相色谱仪所用色谱柱径较细，所填固定相粒度很小，因此，对流淌相的阻力较大，为了使流淌相能较快地流过色谱柱，就须要高压泵注入流淌相。对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流量恒定、无脉动，流量精度和重复性为0.5%左右。此外，还应耐腐蚀，密封性好。高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。恒流泵是能给出恒定流量的泵，
17、其流量与流淌相粘度和柱渗透无关。恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变更而变更，假如系统阻力不发生变更，恒压泵就能供应恒定的流量。目前恒流泵正渐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。3.3.梯度洗脱装置梯度洗脱装置 梯度洗脱就是在分别过程中使两种或两种以上不同极性的梯度洗脱就是在分别过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按确定程序连续变更它们之间的比例，从而使流淌相的溶剂按确定程序连续变更它们之间的比例，从而使流淌相的强度、极性、强度、极性、pHpH值或离子强度相应地变更，达到提高分别效值或离子强度相应地变更，达到提高分别效果，缩短分析时
18、间的目的。果，缩短分析时间的目的。梯度洗脱装置分为两类：梯度洗脱装置分为两类：一类是外梯度装置（又称低压梯度），流淌相在常温常压一类是外梯度装置（又称低压梯度），流淌相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。另一类是内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分别另一类是内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱系统。再输至柱系统。梯度洗脱的实质是通过不断地变更流淌相的强度，来调整混梯度洗脱的实质是通过不断地变更流淌相的强度，来
19、调整混合样品中各组分的合样品中各组分的k k值，使全部谱带都以最佳平均值，使全部谱带都以最佳平均k k值通过色值通过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k k值的变更是通过溶值的变更是通过溶质的极性、质的极性、pHpH值和离子强度来实现的，而不是借变更温度值和离子强度来实现的，而不是借变更温度（温度程序）来达到。（温度程序）来达到。二、进样系统二、进样系统 进样系统包括进样口、注射器和进样进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送阀等
20、，它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分别。进样装置要求：入色谱柱上进行分别。进样装置要求：密封性好，死体积小，重复性好，保证密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力、中心进样，进样时对色谱系统的压力、流量影响小。流量影响小。HPLC进样主要方式可分进样主要方式可分为：阀进样（手动）、自动进样。为：阀进样（手动）、自动进样。三、分别系统三、分别系统 分别系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。分别系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为2 6mm，柱长为，柱长为10 50cm，柱形多
21、为直形，内，柱形多为直形，内部充溢微粒固定相。柱温一般为室温或接近室温。部充溢微粒固定相。柱温一般为室温或接近室温。色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长530cm，内径为，内径为45mm，凝胶色谱柱内径，凝胶色谱柱内径312mm，制备往内径较大，可达，制备往内径较大，可达25mm 以上。一以上。一般在分别前备有
22、一个爱护柱，爱护柱内填充物和般在分别前备有一个爱护柱，爱护柱内填充物和分别柱完全一样，这样可使流淌相由于经过爱护分别柱完全一样，这样可使流淌相由于经过爱护柱为其中的固定相饱和，使它在流过分别柱时不柱为其中的固定相饱和，使它在流过分别柱时不再洗脱其中固定相，保证分别技的性能不受影响。再洗脱其中固定相，保证分别技的性能不受影响。四、检测器四、检测器 检测器是液相色谱仪的关键部件之一。检测器是液相色谱仪的关键部件之一。对检测器的要求是：灵敏度高，重复性好、对检测器的要求是：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变更不敏感等。的变更不敏感等。在液
23、相色谱中，有两种类型的检测器，在液相色谱中，有两种类型的检测器，一类是溶质性检测器，它仅对被分别组分一类是溶质性检测器，它仅对被分别组分的物理或物理化学特性有响应。属于此类的物理或物理化学特性有响应。属于此类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等；检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等；另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理和化学性质响应。属于此类检测总的物理和化学性质响应。属于此类检测器有示差折光检测器、电导检测器、蒸发器有示差折光检测器、电导检测器、蒸发光散射检测器等。光散射检测器等。五、数据处理和计算机限制系统五、数据处理和计算机限制系统早期的早期的HPLC仪器是用记录仪记录检测信号，再仪器是用记录仪记录检测信号，再手工测量计算。其后，运用积分仪计算并打印出手工测量计算。其后，运用积分仪计算并打印出峰高、峰面积和保留时间等参数。峰高、峰面积和保留时间等参数。80年头后，计年头后，计算机技术的广泛应用使算机技术的广泛应用使HPLC操作更加快速、简操作更加快速、简便、精确、精密和自动化，现在已可在互联网上便、精确、精密和自动化，现在已可在互联网上远程处理数据。计算机的用途包括三个方面：远程处理数据。计算机的用途包括三个方面：采集、处理和分析数据；采集、处理和分析数据；限制仪器；限制仪器；色谱系色谱系统优化和专家系统。统优化和专家系统。