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1、实验一 蛙的胚胎发育【目的】1.了解和掌握蛙的胚胎发育过程。2.掌握蛙胚胎不同发育阶段的特征。【原理】 蛙是完全变态发育。蛙的胚胎发育是指从一个受精卵开始，到发育成一尾卵黄尚未耗尽，可以自由活动，但还没有摄取外界食物为止的整个过程。这个过程根据外部形态特征和生理上新的显著特征出现，共划分为26个时期。早期胚胎发育是个体发育连续的演变过程、当前一个时期完成时，后一个时期已经开始，前后两个时期的特征有延续性，因此在各个时期之间存在着过渡形态，很难情晰地划分。胚胎发育各时期外部形态:简要将蛙胚胎发育过程中各时期的主要形态特征描述如下（见图）：受精卵期：从卵受精到第一次卵裂沟出现为止。一般在受精后51
2、0 min，出现动物极朝上，植物极朝下，该现象称为翻正。通常蛙胚的动物极呈棕黑色，植物极星乳白色，但少数蛙类的胚胎色素少，翻正后不易区分动植物极（图1，背面观）2细胞期：从第1次卵裂沟出现到第2次卵裂沟出现为止。经裂，卵裂沟从动物极开始，向植物极延伸，裂后形成两个大小几乎相等的分裂球。（图2，背面观）4细胞期：从第2次卵裂沟出现到第3次卵裂沟出现为止。经裂，并垂直于第一次卵裂面，形成四个大致相等的分裂球。（囹3，背面观）8细胞期：从第3次卵裂沟出现至第4次卵裂沟出现为止。经裂或纬裂，如果是经裂，裂沟基本上平行于第1次裂沟而垂直于第2次裂沟，如虎纹蛙、棘胸蛙和花臭蛙；如果是纬裂，裂沟则偏于动物极
3、，裂后形成上下两层共8个分裂球，如黑斑蛙和其他大多数蛙类。（图4，背面观）16细胞期：从第4次卵裂沟出现至第5次卵裂沟出现为止。纬裂或经裂，第3次卵裂为纬裂者，第4次卵裂则为经裂，反之亦然。裂后形成上下两层共16个分裂球，位于动物半球的分裂球小于植物半球的分裂球。（图5，背面观）32细胞期：从第5次卵裂开始至囊胚早期开始。经裂或纬裂，各细胞分裂开始不同步且不规则，裂后的分裂球排列均不一致。（图6，背面观） 囊胚早期：经多次卵裂后，分裂球的数目增多且体积逐渐变小，胚胎表面呈高低不平，细胞界限清楚，随着囊胚腔的形成及扩大，胚胎的直径开始变大，但并不明显。（图7，背面观）（图8，侧面观） 囊胚晚期：
4、细胞继续分裂，体积更小，数目更多，细胞界限不明，胚胎表面光滑。（图9，背面观）原肠早期：在赤道板附近的地方出现唇形凹陷，其背侧即为背唇。（图10，侧面观）（图11，腹面观）原肠中期：由于动物极细胞分裂的速度较植物极细胞快，所以处于背唇位置的动物极细胞分裂后形成下包之势，将植物极逐渐包入，植物极细胞就逐渐内卷，背唇向两侧扩展加深，形成半圆形的侧唇，并继续延伸直至形成一圈为止，即形成圆形胚孔，位于胚孔位置的卵黄被称为卵黄栓。（图12，侧面观）（图13，腹面观）原肠胚晚期：随着动植物极细胞的继续外包和内卷，胚孔逐渐变小，卵黄栓也随之缩小，直至最后被包入。（图14，腹面观）神经板期：胚体纵轴开始伸长，
5、背部变为平坦并逐渐形成一前宽后窄的勺状神经板，其狭小部分与原口相连接。（图15，背面观）神经褶期：胚体继续伸长，从神经板前端两侧开始隆起并向后延伸形成神经褶，中间凹陷形成浅而宽的神经沟。（图16，背面观）胚胎转动期（神经沟期）：两侧神经褶逐渐向中间合拢，神经沟变深而窄，直至愈合形成神经管为止。此时胚胎表面出现纤毛，纤毛的摆动使胚胎转动，但有些种类由于胚体较大，转动微弱，暂未出现可见性胚胎转动，如虎纹蛙。（图17，背面观）神经管期：从神经管出现至尾芽形成为止。神经褶完全愈合形成神经管，前端两侧出现感觉板和鳃板雏形，胚体纵轴继续延长。（图18，侧面观）（图19，背面观）尾芽期：从尾芽翘起至肌肉效应
6、出现为止。尾芽明显翘起并伸长，鳃板更加明显，肾原基出现并逐渐明显，肌节出现，鳃板有明显凹陷而分二叶，视泡也较明显。（图20，背面观）肌肉效应期：从肌肉效应开始至心脏开始跳动为止。身体逐渐伸长，尤其尾部，肌节明显，胚体若受机械或强光刺激，躯干及尾会左右扭动，口部略呈窝状，出现吸盘雏形。（图21，侧面观）心脏跳动期：从心脏开始跳动至鳃血循环出现为止。鳃板形成明显的两对外鳃，肌节增多，视泡更明显，在胚胎的头部和躯干部之间可见心脏微微搏动。（图22，侧面观）鳃血循环期：从鳃丝内出现血液循环至开口为止。此期大部分胚胎孵化出卵胶膜，侧卧水底，有时在水中可作短距离的螺旋状游动，每侧外鳃两对，每对外鳃各分出许
7、多鳃丝，口窝加深，鳃丝内有血液作脉冲式流动。（图23，背面观）（图24，侧面观）开口期：口内的口板膜穿通，口呈裂缝状，角质颂开始形成但通常还未出现色素。眼的角膜透明，黑色的视杯显露，外鳃的鳃丝伸长。（图25，腹面观） 尾血循环期：在尾部与腹部交界之处可见到微弱的血液循环，并且随着胚胎的发育，血液流动愈来愈明显，颌齿雏形出现，眼珠明显，蝌蚪能作长距离游泳。（图26，背面观）鳃盖褶期：在每侧外鳃基部出现皮肤糟，并逐渐向腹面会合形成一条完整的肤褶，即鳃盖褶，晶体明显，肠管形成，口吸盘开始退化，身体及尾部的色素增加，尾长占全长的一半以上。（图27，背面观）（图28，腹面观）右鳃封闭期：右侧外鳃丝逐渐缩
8、短，直至被鳃盖褶所遮盖，口部移向吻端，出现黑色角质颌，肠管出现12圈弯曲。（图29，背面观）（图30，腹面观）鳃盖完成期：左侧外鳃完全被鳃盖褶所封盖，留下一个小孔，称出水孔，眼能自由转动，口吸盘退化消失，日能开闭自如，肠管卷曲成23圈。（图31，背面观）（图32，腹面观）【实验材料】蛙受精卵团，无氯水，培养皿，体视显微镜【实验步骤】在体视显微镜下连续观察2-3天，在此期间观察蛙的变态发育的各时期，并绘图。早期胚胎发育图 胚后发育图实验二 哺乳动物的卵细胞和精子发生【目的】1.掌握卵细胞和精子发生的过程。2.熟知卵细胞和精子各阶段的形态特征【原理】1.卵母细胞的发生卵巢表面为单层立方或扁平的表面
9、上皮，上皮下方为薄层致密结缔组织构成的白膜。卵巢实质分为皮质和髓质。皮质含不同发育阶段的卵泡、黄体和白体，卵泡间结缔组织由低分化的梭形的基质细胞、网状纤维及散在的平滑肌纤维构成。髓质有血管和淋巴管。近卵巢门处有少量门细胞，其结构和功能类似睾丸间质细胞，可分泌雄激素， 在FSH和LH刺激下，每个周期有一批卵泡发育，其中之一发育成熟并排卵。卵泡的发育分为原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡四个阶段。原始卵泡：体积小，由一个初级卵母细胞和一层扁平的卵泡细胞构成。初级卵母细胞为圆形，直径约40m，核大而圆，染色浅，核仁明显，胞质嗜酸性。初级卵母细胞是在胚胎时期由卵原细胞分裂分化形成，并停滞在第一次减
10、数分裂前期，直至排卵前才完成分裂。初级卵泡：为原始卵泡在FSH的作用下发育形成。初级卵母细胞增大，在靠近质膜的胞质中出现电子致密的溶酶体，称皮质颗粒。卵泡细胞增生，由扁平变为立方形或柱状，由单层变为多层；最内一层卵泡细胞为柱状，呈放射状排列，称放射冠。在初级卵母细胞与放射冠的卵泡细胞之间出现一层均质状、嗜酸性的透明带。构成透明带的蛋白中，ZP3为精子受体。次级卵泡：其内出现卵泡腔，腔内充满卵泡液；初级卵母细胞、透明带、放射冠及部分卵泡细胞突入卵泡腔内形成卵丘；卵泡腔周围的数层卵泡细胞形成卵泡壁，称颗粒层，卵泡细胞改称颗粒细胞。初级卵泡和次级卵泡合称生长卵泡，其周围形成卵泡膜。卵泡膜内层有多边形
11、或梭形的膜细胞，具有分泌类固醇激素细胞的特征；外层有胶原纤维和平滑肌纤维，膜细胞合成雄激素，雄激素进入颗粒细胞，转化为雌激素，故雌激素由两种细胞联合产生。成熟卵泡：在LH刺激下，次级卵泡发育为成熟卵泡。初级卵母细胞直径可达150m。由于卵泡液急剧增多卵泡体积显著增大，直径可超过2cm，并向卵巢表面突出。在排卵前3648小时，初级卵母细胞完成第一次减数分裂，形成次级卵母细胞和第一极体。第一极体很小，含极少量胞质。次级卵母细胞迅速进入第二次减数分裂，停滞在分裂中期。绝大多数卵泡不能发育成熟，它们在发育的各个阶段停止生长并退化，退化的卵泡称闭锁卵泡。2.精子的发生精子发生的全过程是在精巢内进行的。各
12、种动物的精巢结构不同，精子的形态也各种各样，但是精子发生的规律基本相似。精子发生都必须经历增殖期、生长期、成熟期和精子形成期这几个阶段。生精细胞包括精原细胞（spermatogonium）、初级精母细胞（primary spermatocyte）、次级精母细胞（secondary spermatocyte）、精子细胞（spematid）和精子（sperm）。在生精细胞之间还分布着一种称之为支持细胞（sertoli cell）的体细胞。它对生精细胞具有支持、营养和分解残余物质的作用，也具有调节精子发生和诱导精子形成的作用。 精子的发生是一个连续的过程。在哺乳类精巢中有许许多多的生精细管，在生精细
13、管上有规律地分布着各期生精细胞。而在两栖类或鱼类，精子的发生有着明显的季节性变化。在精巢中生精细胞分布在精小叶中，各期生精细胞以精小囊为单位。在同一个精小囊中的生精细胞往往为同一发育期的生精细胞，不同精小囊的生精细胞发育不同步。 取哺乳类精巢切片，置显微镜下先用低倍镜观察，可见在整个精巢外表有一层较厚的结缔组织膜，称白膜（tunica albuginea），白膜的结缔组织伸到精巢内形成一些结缔组织小隔，称精巢小隔（septula testis），把精巢分隔成许多锥形小叶，每个小叶有1-4条生精细管。在切片中可见生精细管多呈横切面，每个生精细管外有一薄层的结缔组织。选一生精细管置高倍镜及油镜下仔
14、细观察，注意生精细管的管壁由数层发育不同时期的生精细胞所构成，自管壁向管腔依次排列如下：精原细胞：为生精细管管壁上最外层的生精细胞，紧附于结缔组织之内，通常为一层细胞，呈圆形，胞核染色深。精原细胞经过若干次有丝分裂后，最后一代的细胞长大为精母细胞。初级精母细胞：初级精母细胞位于精原细胞的内方，为生精细管上各期生精细胞中体积最大的细胞，有二、三层。核非常明显，可见到处于减数分裂前期不同时期的变化，有时还可见到正在进行第一次成熟分裂。次级精母细胞：初级精母细胞经第一次成熟分裂后形成次级精母细胞，大小为初级精母细胞的一半，位于初级精母细胞的内方。次级精母细胞的染色体已减少一半，为单倍体，细胞染色较浅
15、。由于次级精母细胞存在的时间很短，所以在切片中数目有时也少，通常为一、二层。精子细胞：次级精母细胞经过第二次成熟分裂，形成精子细胞。精子细胞位于次级精母细胞的内方，接近生精细管的管腔。精子细胞较次级精母细胞小，细胞呈卵圆形，细胞核染色深，有的可见到精子细胞在精子形成中的不同形态变化。精子：精子细胞完成分化过程形成精子。精子位于生精细管的管腔中，精子聚集成束，一般头部朝向管壁或深埋在支持细胞的细胞质中。精子具有染色很深的头部和鞭毛状的尾部。【实验材料】 哺乳动物卵巢和精巢的切片，显微镜，香柏油，擦镜纸。【实验步骤】1.在低倍镜下观察卵巢的结构，同时在卵巢的皮质层寻找不同发育阶段的卵泡，观察其结构
16、特征，绘图。2.在油镜下观察精巢的结构，从精巢的管壁向管腔依次寻找精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精细胞。并绘图。【作业】1.卵巢和精巢的组织构成（描述）2.各阶段卵母细胞和精巢细胞的形态特征（描述或绘图）实验三 鸡胚的发育【目的】1.观察鸡胚的发育过程。2.学会根据鸡胚的发育形态特征判断发育时期。【概述】未受精蛋：种蛋中通常被称为“卵黄”的部分，实际上只是一个细胞，即雌性生殖细胞或卵子。卵黄绝大部分是营养物质，细胞核和大部分细胞质集中为一个不规则的小白点，浮于卵黄上面和卵黄膜下面，如图中箭头所示。这个蛋经孵化不能发育，称未受精蛋。受精蛋：鸡的卵子在输卵管的漏斗部与精子相遇而受
17、精，受精卵在母体内滞留期间不断分裂，到种蛋产出体外时已分裂成一团细胞，此时为胚胎发育的囊胚期，从正面看囊胚像覆盖在卵黄表面的圆盘，中央为明区，边缘为暗区，通常称为胚盘。第l天：胚胎开始发育，胚盘直径由0.30.5mm 发育到约0.7mm，胚重约0.0002g。首先在胚盘明区的后端形成半月形的胚质，然后胚质逐渐加厚变长，在胚盘中央形成原条，胚体以原条为中轴进行发育、分化，直到形成脊索，然后原条逐渐消失。中胚层的细胞在沿着神经管的两侧，形成左右对称的呈正方形薄片状的体节四五对。中胚层进人胚盘的暗区，在胚的边缘分化形成许多红点，称血岛。照蛋时，可见“鱼眼珠”样的结构。第2天：胚盘直径约为10mm，胚
18、重达0.003g。卵黄囊、羊膜、浆膜开始形成。血岛合并形成血管。入孵25h，心脏开始形成，3042h 后，心脏开始跳动，形成卵黄囊血液循环。照蛋时可见卵黄囊血管区，形似樱桃，俗称“樱桃珠”。此时有2527 对体节。第3天：胚长5.5mm，胚重0.02g，尿囊开始从胚胎后肠的腹侧突起。羊膜已形成，并包围胚胎于羊膜腔中。此时胚胎的头尾已能区分，脑泡原基出现，眼的色素开始沉着。已有35对体节，前后肢芽开始形成，内脏器官开始发育。卵黄由于蛋白水分的渗入而明显增大。照蛋时，可见卵黄囊血管形似蚊子，俗称“蚊虫珠”。第4天：胚长7.7mm，胚重0.05g。卵黄囊血管包围卵约13，肉眼可见尿囊。羊膜腔形成；胚
19、胎头部明显增大，舌开始形成。照蛋时蛋黄不易随蛋转动，俗称“钉壳”；胚胎卵黄囊血管向四周伸展，形似蜘蛛，俗称“小蜘蛛”。第5天：胚长达10mm，胚重达0.13g。生殖腺已分化，组织学上可确定胚的性别。胚体弯曲呈“C”状，四肢发育，可见指（趾）原基，照蛋时，可见黑色的眼点，称“单珠”。第6天：胚长13.8mm，胚重可达0.29g，卵黄囊包围卵黄囊表面12 以上，尿囊接触浆膜，形成尿囊浆膜，羊膜开始收缩，胚胎开始活动，卵黄达最大重量。喙原基出现，躯干部增大。照蛋时，可见胚胎周围有羊水，头部和躯干部增大，胚体呈电话筒状，俗称“双蛛”。第7天：胚长14.2mm，胚重约0.57g。胚胎的特征已十分明显，羊
20、膜腔扩大，羊水较多，口腔、肌胃、鼻孔已形成，性腺雏形已出现。照蛋时，蛋的正面布满血管，但胚胎活动不强。第8天：胚长15mm，胚重1.15g。胚胎活动增强，像在羊水中浮游，右侧卵巢开始退化，四肢已发育成形，用放大镜已可看到胚胎皮肤表面的羽毛原基。照蛋时，卵黄囊已扩大到蛋的背面，转动蛋时，两边的卵黄不易晃动，称边口发硬。第9天：胚长20mm，胚重1.53g，喙开始角质化，软骨开始骨化，眼睑已达虹膜。心、肝、胃、肾、肠已发育良好，尿囊几乎包围整个胚胎。照蛋时，可见到卵黄边易晃动，尿囊血管伸展越过卵黄囊。第10天：胚长21mm，胚重约2.26g。蛋白部分由于水分渗入卵黄，体积减小，并移到蛋的锐端，并被
21、尿囊浆膜包围，形成蛋白囊。尿囊血管在蛋的小头合拢。照蛋时整个胚蛋除气室外，布满血管，俗称“合拢”。胚胎龙骨突形成。第11天：胚长25.4mm，胚重3.68g。胚胎各器官进一步发育。背部出现绒毛，尿囊液达最大量。照蛋时，可见血管加粗，颜色变深。第12天：胚长35.7mm，胚重5.07g，躯体覆盖绒毛，开始用喙吞食蛋白。肠、肾开始有功能。照蛋时，可见血管变粗，背面左右卵黄在钝端相接。第13天：胚长43.4mm，胚重7.37g，锐端的蛋白由浆羊膜道输入羊膜腔中，羊水变浊，胚胎吞食蛋白，尿囊中有白色絮状物出现。胫、趾部出现角质磷等原基。眼睑达瞳孔。照蛋时，可见小头发亮的部分逐渐减少。第14天：胚长47
22、mm，胚重9.74g。胚胎全身覆盖绒毛，头朝向气室，胚胎开始改变横着的位置，逐渐与蛋的长轴平行。第15天：胚长达58mm，胚重12g，翅已完全成形，胫、趾部鳞片开始形成，眼睑闭合。体内外各器官基本形成。第16天：胚长62mm，胚重16g。绝大部分蛋白进入羊膜腔，胚胎的冠和肉髯明显。照蛋时，小头发亮的部分继续减少。第17天：胚长65mm，胚重18.6g。羊水、尿囊液开始减少，蛋白全部输入羊膜腔。喙伸向气室，胚胎在蛋的小头长满。照蛋时，蛋的小头看不到发亮的部分，俗称“封门”。第18天：胚长70mm，胚重21.8g。羊水、尿囊液明显减少，胚头弯曲在右翼下，眼开始睁开；胚胎转身，喙朝向气室。照蛋时，可
23、见气室倾斜，俗称“斜口”。第 19 天：胚长73mm，胚重25.6g。胚胎大转身，颈部及翅部突人气室。尿囊动、静脉开始枯萎。卵黄囊收缩，剩余的卵黄大部分已进入腹中。喙进气室，开始肺呼吸。此时胚胎头埋于右翼下，两腿弯曲朝头部，呈抱头姿势。照蛋时，可见气室内有翅、喙、颈部的黑影闪动，俗称“闪毛”。雏鸡开始啄壳。可闻雏鸡鸣叫。第 20 天：胚长80mm，胚重约30.2g。尿囊完全枯萎，剩余卵黄与卵黄囊全部进入腹腔，雏鸡啄壳，开始出雏。第 21 天：雏鸡孵出，胚重为3537g。【操作步骤】1受精蛋的鉴别1.1检查并区分鸡的受精蛋与未受精蛋。1.2 试将几个受精蛋的胚盘完整地转移到培养皿上观察，描绘其典
24、型情况。2孵化前的准备工作2.1调整孵化器的温度与湿度。（1）温度：最适孵化温度为37.8（100）。整批入孵可采取前高后低的原则，孵化的15 天以38.2为宜，610 天38，1115 天37.8，1619 天37.6，2021 天37.3。（2）湿度：一般为40%70%。整批入孵时可采取“两头高、中间低的原则”。孵化初期（17 天），50%60%；孵化后期（1018 天），50%55%；出雏期（1920天），70%左右。2.2 取出几个蛋进行透照。2.3 放蛋种蛋应大头朝上，小头朝下，不能平放，更不能小头朝上孵化。2.4 核准孵化器的温度与湿度，记录放蛋的日期和时刻。【注意：孵化过程既要注
25、意温度、湿度，也要做好通风和翻蛋工作（一般每天翻2次；翻蛋角度以水平位置前俯后仰各45 度为宜；翻蛋时动作要轻、稳、慢）。】3.每隔一天取出几个蛋用照蛋器进行透照，描述其典型者。胚胎位置的鉴定一、头在蛋的大端1头转向右侧，喙在右翼下。2头转向右侧，但喙不在右翼下。3头转向右侧，但远离气室：（1）喙在翼下；（2）喙不在翼下。4头夹在两腿之间。5头转向左侧，喙在左翼下。6头转向左侧，但喙不在左翼下。7脚盖在头上：（1）喙在右翼下；（2）喙不在右翼下，但转向右侧；（3）喙在左翼下；（4）喙不在左翼下，但转向左侧。二、头在蛋的小端1头转向右侧，喙在右翼下。2头转向右侧，但喙不在右翼下。3头夹在两腿之间
26、。4头转向左侧，喙在左翼下。5头转向左侧，但喙不在左翼下。6脚盖在头上：（1）喙在右翼下；（2）喙转向右侧，但不在右翼下；鸡蛋孵化与鸡胚发育口诀一天上了盘，日头卵黄中；两天放花纹，心脏开始动；三天血管成，象只小蚊虫；四天定了位（钉壳），血管向外伸；五天显眼点（起眼），软骨已长成；六天胚胎动，头躯可分清；七天离了壳，沉入孵黄中（七沉）；八天口发硬（边口发硬），鱼浮羊水中（八浮）；九天发了边（发边），头尾来回动（九摇头）；十天一道线（羽毛），血管合了拢（合拢）；十一见骨硬，头颈腹毛生；十二毛齐全，上下颚已分；十三躯体长，气室更分明；十四蛋白少，胎雏活动慢；十五体长大，头向大端伸；十六气室显，绒毛盖
27、全身；十七尾不亮（封门），肺大待利用；十八口已斜，今天见转身；十九见起影，肺脏开始动；二十闻鹰叫（雏鸣），陆续破开壳；二十一脱壳，摊上加小心。 实验四 蚕的生长与发育【目的】1.观察了解蚕不同发育阶段。2.识别不同发育阶段蚕的形态特征。【概述】桑蚕一个世代中所经过的生长发育和繁殖的过程，就是生活史。桑蚕属完全变态昆虫，在一生中经过卵、幼虫、蛹、 成虫四个形态和机能完全不同的发育阶段。不完全变态昆虫没有蛹期，仅卵、幼虫、成虫三个发育阶段。如：蝉类、 蜂类等。 卵期：繁育后代，卵期是胚胎发生、发育形成幼虫的阶段。卵期长短，因越年卵与非越年卵及产卵期而异，在自然条件下， 春季制的蚕种要到来年春天4月
28、份孵化，卵期达10个月，秋制春种也是到4月份孵化， 卵期67个月，若夏用种，则又长3个月。 幼虫期：指孵化至上蔟。刚孵化的小蚕称蚁蚕。蚁蚕20002500头。蚁蚕经摄食，体躯迅速生长，经24h“疏毛期”。随食桑，继续生长， 至不蜕去旧皮不能继续生长时，蚕就停食，并吐出丝缕，固定腹足，头胸昂起，呈静止状态，称眠蚕。眠的过程：眠期：停食蜕皮。起蚕：眠蚕蜕去旧皮。令期：两次蜕皮之间的时期食桑中：孵化或蜕皮至入眠 ，生产上指饷食至止桑。绝食中：入眠至蜕皮或止桑至饷食。少食期：14食桑中。中食期：14食桑中。盛食期：38食桑中。将眠期：18食桑中。总之，幼虫期是摄取营养生长的阶段。 蛹期：是指蚕儿吐丝终
29、了至羽化出蛾。蚕儿上蔟后，一般经23天吐丝终了，再经23天化蛹蜕皮，再经1014天化蛾。蛹期表面上静止不动，但其内部却进行着激烈的组织解离和组织发生，为成虫化做准备。是由幼虫过渡到成虫的变态阶段。成虫期：又称蚕蛾，由蛹羽化而来。羽化：成虫不再摄取营养，具备发达的生殖器官，经交配产卵后，约经27天死亡。成虫期为繁衍后代的生殖阶段。卵、幼虫、蛹、成虫是桑蚕一生中所经过的四个发育阶段，每一发育阶段的外部形态、内部生理都完全不同，且每一阶段在生活史中都有着不同的生理意义。【操作步骤】1.每人领取2-3颗蚕卵，使其孵化，养育。2.观察各发育期蚕的形态变化和特征。3.将各发育期摄像，并标示蚕身体部位的名称
30、。【思考题】1.如何根据卵色的变化、区别各类卵？2.如何判断雌雄。附：一、蚕卵1.卵形桑蚕的卵一般椭圆形，略扁平，一端稍尖。刚产下的卵表面隆起，约经23天后，由于卵内水分及营养物质的消耗， 逐渐在卵的表面中央出现浅的凹陷，随着时间延长，凹陷变深，此称“卵涡”， 又称“水引”。卵涡一般呈椭圆形，也有个别形成23条枞褶的，若卵涡呈三角形，或呈有棱角的下凹，则该粒卵为“死卵”。卵涡在孵化之前，由于胚子体躯增大及胚体反转时对卵壳的作用力，而使卵涡膨起。在膨起时，卵壳会发生轻微的声响，称“卵鸣”。桑蚕“卵鸣”较弱，柞蚕较明显。注：现行品种春季催青时，开始卵涡较浅，45天时中央呈不规则凹陷。天时，卵涡较深
31、。89天时卵面隆起，产生“卵鸣”，再经23天孵化。故可借此变化，大致推断胚子发育过程及孵化期。但生产上，均采用“胚子解剖”来判断。若是人工浸酸种，可于浸酸处理3天后，可根据卵涡有无、深浅、整齐度来检查浸酸效果。2.卵壳卵壳：卵的外面包着一层由卵壳质（硬蛋白，无机丁质）构成的坚硬卵壳，对胚子起保护作用。卵壳结实而略有弹性，一般中系卵壳为淡黄色，日系乳白色，且略透明，也有其它色或无色的。卵纹：卵壳的表面布满五角形或六角形的花纹，称卵纹。卵纹的大小、形状以及多角形数目，因品种及卵壳的部位不同而异。卵孔：卵稍尖的一端有卵孔，卵孔周围的卵纹与其它部分明显不同，排列较为规则，呈规则的花瓣状。卵孔是精子进入
32、卵内的通道，以漏斗状向外开口，在卵壳内形成一个小室，最后向内分成数条卵孔管通向卵的内部，各卵孔管均略向内方弯曲。卵孔管最多为7只，一般为24只，其直径为1um左右，其末端呈喇叭形与卵黄膜相连。卵孔是胚胎头部所在，孵化时从此处噬破。精子直径约1um左右，长约400um，故每只卵孔管一次只能进入一条。卵孔的上述构造，可有效的防止病原微生物侵入，同时又可允许几条精子进入卵内。气孔：卵壳的表面有无数微细的针状气孔，它位于34个卵纹的接触点，其剖面呈漏斗状，是蚕卵进行呼吸的通道。（气孔外面开口部的直径为34um，愈内愈细）。每卵气孔的数目也因品种而有差异，一般500010000个。3.卵内容物：卵的内容
33、物有卵黄膜、浆膜、卵黄、胚子等。卵黄膜：紧贴在卵壳的内面，是一层无组织构造的、薄而钧一且透明的薄膜，有两层构造。产卵当时，是卵黄的直接包被物，受精后，在其内形成浆膜，卵黄膜成为间接包被物。浆膜：位于卵黄膜内层，是受精后由合子的分裂核结合原生质而形成的一层大而扁平的多角形细胞。越年卵的浆膜细胞内，经23天就有浆液膜色素沉积，使卵渐变成固有色。不越年卵的浆膜内无色素沉积。卵黄：是卵内除胚胎外的主要内容物，为无色、淡黄色，是胚胎附于的营养来源。（受精后的卵黄，都是以卵黄细胞存在的。）胚胎：也称胚子。胚子是在产卵后形成的，偏在卵较厚的一侧，头向卵孔的一端，被卵黄细胞包围。胚子在卵内摄取卵黄中的营养，将
34、来成为蚁蚕。4.卵色卵色因品种而异，一般的，中系为灰绿色，日系为灰紫色，欧系为灰紫、略带绿色（介入中、日之间），热带多化性系统为浅褐色。（也有的品种为白色等）卵色的组成：是由胚子、卵黄、卵壳、浆膜色素等颜色的综合表现。其中，主要是由浆膜色素决定的，它是由AA经一系列酶的作用下转变生成的。（色AA三羟犬尿酸浆液膜色素）。刚产下的卵都是淡黄色，主要是卵壳和卵黄呈现出的颜色。如果是黑种，产下后23天，渐由淡黄色浅赤豆色深赤豆色固有色。如果是生种，由于浆膜细胞内，缺乏生成浆膜色素的酶系，而不能形成浆膜色素，故产下经27天内不变色。但当胚子发育至转青时，卵色也会有变化，即呈现出转青卵的青灰色。（有的品种
35、为灰色或深绿色）不受精卵由于胚子及浆膜不能形成，故卵色一直呈淡黄色，数月后干瘪。再出卵的卵色变化同黑种，但变成固有色后，于年前陆续孵化成空卵壳。死卵多为赤褐色，且卵涡呈三角形或瘪卵。二、幼虫的形态1.蚁蚕的外形特点刚孵化的蚁蚕，外形与大蚕基本相似，所不同的是：（1）头部比例大，且色深。（2）表面生有很多瘤状突起，每一个突起上有36根刚毛，从而使蚁体体色很深。2.外形及体节蚕体是长圆筒形，由头、胸、腹三个明显体段构成，、胸部腹部又合称体部。头部：较小，位于蚕体的最前方，呈扁园形。胸部：头部后面的三个环节，每环节的腹面有一对足，称胸足。（环节体节）腹部：胸部后面的10个环节，其中第6、7、8、9及
36、最末环节（13）的腹面各有一对腹足。第11环节的背面中央有一突起，称尾角。气门：及18环节的两侧各有一对黑褐色椭圆形的气门，共9对。3.雌雄性特征雌蚕在第8、9腹节的腹面各有一对乳白色的小圆点，前一对称前生殖芽（石度氏前腺）后一对称后生殖芽。雄蚕第8、9腹节的腹面交界处的中央，有一乳白色的飘形囊状体，也称赫氏腺。三、蛹的形态刚蜕皮的蛹，体壁柔软，体色乳白，以后随着发育逐渐便硬，体色渐变黄褐，最后变成浓褐色。1.蛹的外形蛹体呈长纺棰形，分头、胸、腹三部分。头部：很小，前端白色部分背方的一小部分称头顶。前方略呈方形的白色部分称额，额的下方（腹面）为唇基，唇基的后方接上唇，额的两侧有一对向下方弯曲的
37、触角，触角的基部有一对复眼。（上唇两侧可见有黑褐色的退化上腭，下唇被遮盖在下腭下面）。胸部：仍由三个体节组成。从蛹体背面看，前胸呈扁六角形，中胸呈五角形，后胸呈凹字形，最小。胸部的腹面各有一对胸足，但外观上，仅能看见前足及中足的一部分，后足被翅遮盖。中胸和后胸的两侧各有一对翅，粘附于蛹体上，后翅被前翅掩盖，仅露一点。前胸的两侧有一对气门。腹部：由于幼虫9、10腹节彻底愈合，故外观上有9个环节，其中4、5、6节最大，前后的环节渐缩小。腹面1、2、3被翅盖住。第4、5、6、7环节之间能活动，称运动体节。第17腹节的两侧各有一对气门，8腹节上的气门已经闭塞，故蛹外观上只有7对气门。 2. 雌雄性特征
38、雌蛹腹部肥大而末端较钝，在第8腹节腹面的正中线上，有一条纵线，与该环节腹面的前后缘形成略呈“X”形纹。（肛门在第9腹节腹面）雄蛾腹部较尖，在第8、9腹节腹面正中线的交界处，有一个褐色小点。（肛门在小点后方。）四、成虫的形态1.外形和体节蛾体也分为头、胸、腹三部分，除节间膜外，全身披有白色鳞片。实验五 斑马鱼的生长发育表1. 早期发育的各时期时期h描述合子0新受精的卵子完成首个合子细胞周期卵裂0.75细胞周期2至7快速同步发生囊胚2.25快速间时同步（metasynchronous）细胞周期（8，9）在原肠中期转变中变为延长的异步（asynchronous）周期；随后外包（epiboly）开始原
39、肠5.25内卷（involution）、聚合(convergence)和延伸（extension）等形态学运动形成上、下胚层和胚轴；持续到外包运动结束分节10体节、原始咽弓和神经原节（neuromeres）发育；原始器官发生；开始运动；尾部出现咽囊24种系期（phylotypic-stage）胚胎；体轴由先前绕卵黄囊的弯曲状态开始伸直；循环系统、色素沉着和鳍开始发育孵化48原始器官系统完成快速形态发生；软骨在头和鳍中发育；陆续开始孵化早幼72鳔膨胀；觅食及积极的躲避行为实验六 精子获能的鉴定实验【目的】1.熟知精子获能的生物学意义。2.掌握精子获能染色的方法【概述】精子在离开雄性生殖系统时，虽
40、有完整的形态和独立运动能力，但不能立刻与卵子受精，必须在雌性生殖道或在体外的特定介质中进行最后成熟，即“获能”（Sperm Capacitation），才能与同种动物的卵子受精，这是受精过程最基本的一步，特别在体外受精技术中是相当关键的一步。精子在若干生殖道获能因子的作用下，精膜发生一系列变化（吸附于精子膜表面精清蛋白的去除和膜表面蛋白重组等），进而产生生化和运动方式的改变。获能后精子穿越卵母细胞周围的滤泡细胞和透明带的能力提高，是精子发生顶体反应的前奏。精子一旦获能,其运动类型发生显著改变,精子头部侧摆幅度和频率明显增加,尾部振幅加大,频率加快,呈现一种特殊的超激活运动(HAM)或鞭打样运动
41、。考马斯亮蓝染色法，CBB是常用的蛋白质染色剂，经考马斯亮蓝染色后，完整的精子即未获能的精子顶体外膜内含有的大量糖蛋白，精子头部顶端顶体区呈深蓝色，而获能后的精子其顶体膜破裂，糖蛋白被释放出来，顶体区不着色，反差明显，容易辨别。CBB染色结果在普通光学显微镜下观察:染色后，所有精子尾部均染成紫蓝色，头部则呈A型和B型两种染色类型。A型为没有发生顶体反应的精子，顶体区染成紫蓝色而顶体后区不染色或呈浅紫色，少量精子顶体后区也呈紫蓝色;B型为已发生顶体反应的精子，顶体区不染色或染浅紫色，其余部位染色与A型相似。两类精子的根本差别是顶体区是否染成紫蓝色。【实验器材】 冻置装置 水浴锅 培养皿 5ml注
42、射器 1ml移液枪 枪头 倒置显微镜 载玻片 PH试纸, 冻精【实验试剂】 生理盐水、M199、 双抗、无水乙醇、 95%乙醇 、考马斯亮蓝G250染液(100mg考马斯亮蓝G-250溶于50m1 95%乙醇，加入85%磷酸100ml，然后，用蒸馏水补充至1000ml，此染液放4至少6个月保持稳定)、肝素【实验步骤】1）冷冻精子的复苏：恒温水浴锅温度调至37，等水温恒定后将冷冻精液管放入其中5分钟。取精液1 ml加培养液1-2 ml混匀置于倒置显微镜下观察精子的形态特征和运动状况。2）获能精子的制备：让精液流入5mL离心管底部, 将离心管倾斜45度放置, 沿管壁缓慢加入1-2mL培养液，注意形
43、成界面。放入37培养箱，上浮30 40 min 分离精子，将浮游至上层的精子吸出，2000r/ min 离心10 min，取沉淀，加培养液洗涤2次。显微镜下观察精子的形态特征和运动状况。（洗涤的目的是去除死精，杂质，冻精保护液等）3）获能精子的涂片染色观察：用移液管取少量稀释液置于载玻片上，然后推开稀释液，风干以后将涂片浸染于考马斯亮蓝染色液中10min，然后用流水冲干净，在显微镜下观察精子的染色情况。记录精子获能情况，并计算精子获能率。4）观察结果：描述精子的形态特征，运动状况，绘制精子考马斯亮蓝涂片染色示意图。描述获能精子与未获能精子在考马斯亮蓝染色上的不同，计算精子获能情况。（头部顶体区
44、染成蓝色且顶体边缘光滑的精子为顶体完整的精子, 其他均为发生了顶体反应的精子。）精子总数获能精子数获能率123【作业】1）实验报告2）查阅相关资料，描述精子获能的鉴定方法以及各自鉴定的对象（精子死活鉴定、精子顶体反应鉴定等）。附1：表1 各种培养液培养液的制备：1)配制培养基最好使用新制备的三蒸水。一般在试验前当天或前一天制备为好。调节pH值的酸碱溶液也应该使用这种水配制。2) 制备培养基的器皿清洗要绝对干净，烤干后备用（滤器、滤膜、量筒、移液管及盛放培养基的小瓶等存放和转移培养基液体的器具都应进行灭菌）。3)溶解培养基：将干粉培养基溶于总量1/3的水中，再用水洗包装袋内面两次，倒入培养液中。
45、振荡或超声助溶，一般不要加热助溶。4) 补加试剂：根据包装袋说明和试验需要加入NaHCO3（2.0g）、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等其他试剂。5) 加抗生素：一般抗生素终浓度为青霉素100U/ml，链霉素100U/ml。市售青霉素为80万U瓶，可溶于4ml体积，每一升培养液中加0.5ml即可。市售链霉素为100万U瓶，可溶于5ml体积，每一升培养液中也加0.5ml即可。无链霉素的情况下，用庆大霉素代替，终浓度调为50200U/ml。6) 调pH值：加水到900ml（在需要加10小牛血清的情况下），然后用5 NaHCO3调节pH到7.2。7) 过滤除菌：宜采用0.45um和0.22um滤膜各
46、一张，上层为0.45um，下层为0.22um，以保证过滤效果。注意滤膜正面（光面）朝上。过滤后分装于小瓶中（100或200ml）。8) 加小牛血清：根据培养基配制的量将小牛血清分装，冷冻保存（20）。临用前将加入小牛血清(10%20%)。【注意事项】 每次配液时，需要的其他辅助性液体（Hanks，胰蛋白酶消化液，PBS，抗生素溶液等）也可以同时配制，分别过滤。 市售小牛血清使用前都应该灭活（56，30min），以消除补体活性。动物血清个体差异大，故而每一批血清都进行严格检测，同时进行无菌试验。优质血清应该为淡黄色，透明，无溶血，无沉淀，灭活后颜色稍深。生化检测总蛋白含量3.54.5g/100ml，球蛋白不高于2g100ml。选定一个效果较好的批号后，可一次多购该批号的血清，保证试验条件的稳定。 由于市售小牛血清pH未知，但大多偏酸。试验中加入小牛血清后，培养基的pH可能还会变化，故亦可先加入小牛血清