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1、.毕 业 论 文题 目：乙肝表面抗原的 ELISA 法定量分析方法学验证 姓 名： 学 号： 系 别： 年 级： 专 业： 指导教师： 二 一 一 年 十二 月目 录中文文献 .英文摘要 .前 言 .。1. 材料与方法 .。1.1 试剂盒 .1.2 仪器 .1.3 方法 .1.3.2铺板方案 .1.3.3加样步骤 .2. 结果 .2.1 标准曲线与线性范围 .2.2 准确度（回收率）的验证 .22.3 精密度的验证 .2.3.1 板内精密度的验证 .2.3.2 板间精密度的验证 .2.4 检测限（LOD）计算 .53. 讨论 .53.1 乙肝表面抗原定量分析的意义 .53.2 常用定量分析方法
2、 .63.3 方法概述 .63.4 方法学验证内容 .63.5 结果分析及应用评价 .7参考文献 .7.乙肝表面抗原的 ELISA 法定量分析方法学验证摘 要目的：对福州蓝图生物工程有限公司生产的 HBsAg 的 ELISA 法定量分析试剂盒进行方法学验证，以判断是否能用于临床样本分析。方法：ELISA 法定量分析，应用试剂盒 HBsAg 标准品从浓度为 8ng/ml 做 2 倍稀释的 6 个浓度梯度做标准曲线，以 6，3，1.5ng/ml 3 个浓度梯度 5 复孔做准确度，精密度和检测限等方法学验证。结果：标准曲线 R2=0.997，准确度 97.07%，1.5ng/ml 的 RSD为 16
3、.78%，不满足 ng/ml 级水平的 RSD 一般应LOD，此标准曲线上最低浓度点为 0.25，大于LOD（ 0.172） ，故此标准曲线线性好。3. 讨论3.1 乙肝表面抗原定量分析的意义乙肝表面抗原是乙肝两对半的其中一项，乙 肝 两 对 半 定 性 检 测 对 乙 肝 疾 病的 诊 断 ， 病 情 监 测 ， 疗 效 观 察 起 到 了 一 定 的 作 用 。 但 随 着 临 床 医 学 的 发 展 ，乙 肝 两 对 半 定 性 检 测 已 经 远 远 不 能 满 足 临 床 及 患 者 的 要 求 ， 特 别 是 在 疗 效 观察 以 及 乙 肝 疫 苗 注 射 后 抗 体 产 生 情
4、 况 的 观 察 上 有 明 显 的 不 足 。 随 着 检 验 医 学的 发 展 ， 乙 肝 两 对 半 定 量 测 定 成 为 可 行 ， 大 大 弥 补 了 乙 肝 两 对 半 定 性 检 测 的不 足 。 而 且 乙 肝 两 对 半 定 量 检 测 可 与 HBV DNA荧 光 测 定 相 互 补 充 ， 综 合评 价 患 者 病 情 与 药 物 疗 效 ， 为低含量的慢性乙肝、病毒携带者提供了正确判断病情的依据 【2】 。 这 在 目 前 的 临 床 治 疗 中 应 用 十 分 广 泛 。3.2 常 用 定 量 分 析 方 法此次实验只是对一种试剂盒的可用性进行方法学验证， 而目前常
5、用的定量方法已有很多，如TRFIA，TRFIA法又称解离增强镧系荧光免疫分析，是近十年发展起来的一种微量分析方法。此技术集酶标记、同位素标记技术的优点于一身，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好，且测定范围更宽，试剂盒货架寿命长，操作简便和非放射性等特点，成为最有潜力的一种标记免疫分析方法 【3】 。全自动酶免分析仪目前也广泛应有，自动化、标准化的操作手段使实验达到了全过程控制和全过程标准化分析，大大提高了实验的精密度 【4】 ，使检测结果更趋稳定，从而保证了实验结果的可靠性。.3.3 方 法 概 述目前普遍使用的HBsAg试剂尽管在制备时采用了高亲和力的单克隆抗体，并且使包被抗体、酶标抗体的结合
6、位点尽可能的远。以避免竞争抑制，最大程度地解决钩状效应（HOOK）的问题 【5】 。 本 次 实 验 是 对 实 验 室 的一种试剂盒，即福州蓝图生物工程有限公司生产的HBsAg的ELISA 法定量分析试剂盒进行方法学验证，以判断是否能用于临床样本分析。试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验。往预先包被HBsAg捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本，标准品，HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物的催化下转化为蓝色，并在酸的作用下最终转化为黄色。颜色的深浅和样品中得HBsaAg呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度 OD值，计算样品浓度。应用试剂盒
7、HBsAg标准品从浓度为8，4，2，1, 0.5 ，0.25ng/ml 6个浓度梯度做标准曲线，以6，3，1.5ng/ml 3个浓度梯度5复孔做质控，进行准确度，精密度和检测限等方法学验证。选择最低浓度为0.25ng/ml的原因是因为，绝大多数HBV感染者外周血中可出现HBsAg，含量在5ng/ml 600ug/ml之间，高者可达2000ugml以上 【6】 ，满足了现阶段文献报道的最低浓度值。3.4 方法学验证内容方法学验证内容一般包括标准曲线，准确度，精密度和检测限。标准曲线亦称校正曲线，系指生物样品中所测定的样品浓度与响应的相关性，通常用回归分析方法所得的回归方程来评件，此实验所用了6个
8、浓度点建立标准曲线。方法准确度指待测浓度与真实浓度的接近值了，一般用相对回收率表示，限度要求在85%115%的范围内。精密度则表示分析方法的可重复性，是对同一样品每次测定结果的一致性，用标准偏差和相对标准偏差表示，可做板内和板间的验证，对于ug/ml级水平的相对标准偏差一般应10%, ng/ml级水平的相对标准偏差一般应15% 。检测限则表示分析低浓度样品的能力，通常又称为灵敏度。3.5 结果分析及应用评价第一组数据标准曲线 R2=0.9973，显示具有良好的相关性，HBsAg 浓度为6ng/ml 和 3ng/ml 的回收率分别为为 97.58%，符合 113.07%，符合限度要求在85%11
9、5%的范围内。但是 HBsAg 浓度为.5ng/ml 的回收率为 80.56%，显示此试剂盒对于低浓度样品的检测准确度差。在精密度方面，6，3，1.5ng/ml 变异系数 CV 分别为 12.73% ，3.69% ，3.50%，而 HBsAg 6ng/ml 的 5 个复孔的变异系数 CV 值为 12.73%，显示孔间差异较大，精密度不高，但是也符合ng/ml 级 RSD 水平的一般应 15%的要求，其中有一孔浓度为 4.55，与其它孔比较差异较大，可能是由于操作引起例如加样不准不属于试剂盒的问题，故可以认为此试剂盒对于批内高、低浓度样品的检测精密度还是可以的。在做 3 个组数据的批间的精密度分
10、析时，发现 6，3，1.5ng/ml 变异系数 CV 分别9.10%，12.06% ，16.78%，分布方式从低到高，前 2 个浓度满足对 ng/ml 级水平的 RSD 一般应15%的要求。1.5ng/ml 的 RSD 为 16.78%，不满足 ng/ml级水平的 RSD 一般应15%的要求，显示低浓度的孔间重复性差，精密度不是很高。综上分析，该试剂盒对于高浓度样品的检测具有良好的准确性和较高的精密度，而对于低浓度样品（1.5ng/ml）的检测在准确性和精密度方面都低于高浓度样品，不适合低浓度样品的检测。目前绝大多数 HBV 感染者外周血 HBsAg浓度很低，该试剂盒不能全面检测出此类人群，故该试剂盒不能用于临床标本