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1、柔嫩艾美耳球虫TA4抗原基因cDNA在乳酸乳球菌中的克隆与表达张 莉1，秦泽荣2，崔尚金3，何召庆2，刘尚高2（1. 北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京 ；2.中国农业大学动物医学院，北京 ；3.中国农科院哈尔滨兽医研究所，黑龙江 哈尔滨 )摘要：用PCR技术特异扩增了柔嫩艾美耳球虫TA4抗原基因cDNA序列，克隆至质粒pMD18-T中，获得重组质粒pMD18-T-TA4，采用Kpn I/Sa cI双酶切法及PCR确认正确后，将TA4基因cDNA目的片段亚克隆到乳酸乳球菌表达载体pMG36n中，电穿孔法转化乳酸乳球菌LM0230，获得重组质粒pMG36n-TA4，采用Kpn I/Sac I双
2、酶切法及DNA测序证明cDNA序列完全正确。 获得TA4乳酸乳球菌表达株，经SDS-PAGE电泳分析，结果表明表达产物与预期大小的TA4蛋白分子量一致。关键词：柔嫩艾美耳球虫；TA4抗原基因cDNA；乳酸乳球菌；克隆与表达Cloning and expression of TA4 antigen from Eimeria tenella in Lactococcus lactis ZHANG li1, QIN Ze-rong2, CUI Shang-jin3, HE Zhao-qing2, LIU Shang-gao2(1. Beijing Municipal Academy of Agric
3、ulture & Forestry, Beijing , China; 2. China Agricultural University, Beijing , China; 3. Harbin Veterinary Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin , China)Abstract: TA4 antigen cDNA of E.tenella was amplified by PCR and cloned into a vector pMD18-T. The positive plasm
4、id contained TA4 antigen cDNA was determinded by restriction enzyme analysis and PCR. The plasmid pMD18-T-TA4 and the vector pMG36n were both digested by Sac I and Kpn I. The cDNA encoding TA4 antigen was subcloned into pMG36n and transferred into Lactococcus lactisLM0230 by electroporation. It prov
5、ed that the positive recombinant plasmid pMG36n-TA4 contained cDNA encoding TA4 antigen by restriction enzyme analysis and sequence determination. In the positive transformants, the TA4 antigen was expressed as a fusion protein in Lactococcus lactis LM0230, which was verified by SDS-PAGE .Key words:
6、 Eimeria tenella ; TA4 Antigen; Lactococcus lactis; cloning and expression 球虫子孢子表面的一种抗原TA4为25 Ku的糖蛋白，是由8 Ku和17 Ku两条多肽通过二硫键连接而成的。在孢子化开始后1624合成1。Files2等利用一段标记的寡聚核苷酸序列作探针，首先从基因文库中筛选出了TA4抗原的基因（ta4），其后Brothers3利用ta4基因片段克隆出了该基因的全长cDNA，并将此在大肠杆菌中直接表达或作为-半乳糖苷酶基因融合蛋白的一部分表达。近年来乳酸菌分子生物学进展迅速，探索一些有价值的基因在乳酸菌中克隆和表达
7、已成为乳酸菌分子遗传学研究的热点46。因此，乳酸菌基因工程菌在功能食品、医疗保健及微生态制剂、人工口服疫苗等领域的应用均具有诱人的前景5。本研究主要采用分子克隆技术，进行TA4抗原cDNA在乳球菌中克隆和表达的基础性工作，构建TA4抗原的cDNA重组表达质粒，并用电穿孔法导入乳球菌中，筛选到能表达TA4的工程乳酸菌，将外源基因表达产物与有益菌集为一体，为球虫基因疫苗发展的新途径奠定基础。收稿日期：2005-04-13基金项目：本课题为国家自然科学基金资助项目（）作者简介：张莉（1973-），女，汉族，新疆乌鲁木齐人，博士，助研，从事畜禽传染病的分子防制.1 材 料1.1 菌株和质粒 乳酸乳球菌
8、（Lactococcus lactis）LM0230、大肠杆菌（E.coli）JM109由本室保存。pMD18-T vector购于TaKaRa生物工程公司。pMG36n本室构建。大肠杆菌的液体或固体培养用LB培养基，乳酸乳球菌培养用GM17培养基，乳酸乳球菌电穿孔转化子用SGM17MC培养基。培养基配制及培养条件等参见文献7。1.2 PCR引物 用于TA4抗原基因cDNA PCR扩增的引物：5端引物（P1）：5-CCGAGCTCATTCAGGATTACCCAACAG-33端引物（P2）：5-CCGGTACCACTCAAGCATTTCACTCAG 3 用于TA4抗原基因cDNA测序的引物：5端
9、引物（P3）：5-CCTCGGGATATGATAAGATT 33端引物（P4）：5-TTTCTCAGTTCAACGACACA 3 1.3 工具酶和化学试剂 Sac I、Kpn I、T4 DNA ligase购自TaKaRa生物工程公司。PCR Master系统为TaKaRa公司产品。其它试剂均为国产分析纯或试剂纯。2 方 法2.1 TA4抗原基因cDNA PCR扩增 PCR扩增引物按已发表的序列设计，以P1为5引物，P2为3引物，用含TA4的质粒为模板。反应条件：94 C预变性3 min，94 C变性1 min，58 C退火1 min，72C延伸50s，反应进行30个循环，72 C延伸7 mi
10、n。2.2 TA4抗原基因DNA PCR产物的连接转化 由于PCR产物的3端多了一个不依赖于模板组成的脱氧核苷酸A，所以利用T-A互补原理将PCR产物与pMD18-T Vector连接，插入片段与载体在一定的浓度下，比值在1:33:1之间即可取得良好结果。将PCR产物纯化后按试剂盒说明书进行连接。再将连接产物转化大肠杆菌JM109。2.3 重组质粒的筛选与鉴定（宿主E.coli）（1）挑转化子若干个，在3ml LB液体培养基中培养12 h -16 h，质粒小抽提后经1 %凝胶电泳，根据DNA分子量的大小，初步筛选阳性质粒；（2）取初步筛选的阳性质粒进行Sac I和Kpn I酶切，1 %的琼脂糖
11、凝胶电泳分析，进一步筛选阳性质粒；（3）将重组质粒进行PCR反应，比较PCR产物与酶切产物的大小。2.4 TA4在乳酸乳球菌中的克隆 （1）将表达载体pMG36n 和含TA4基因目的片段的质粒用限制性内切酶Sac I和Kpn I进行酶切。（2）利用DNA快速纯化回收试剂盒将酶切后的TA4基因目的片段及载体片段回收，目的基因片段及载体片段按3:1混合，用T4 DNA连接酶在14 C16 C连接过夜。（3）取2L连接产物用电穿孔法转化乳酸乳球菌LM0230，脉冲参数为1.25 KV/cm，25 F和200 。恢复培养基用SGM17MC。2.5 重组表达质粒的筛选与鉴定 （宿主L.L.0230） 对
12、初步筛选的阳性菌进行质粒抽提8，Sac I和Kpn I酶切分析，PCR和测序鉴定。2.6 TA4抗原基因的表达 将鉴定为阳性的重组质粒载体在乳酸菌中表达，接种于MG17中，30 C培养过夜，收集菌体，加等量上样缓冲液100 C作用10 min，离心后取上清用于SDS-PAGE电泳。3 结 果3.1 TA4抗原基因cDNA PCR扩增 根据已知的TA4基因序列，设计了PCR扩增引物P1和P2，进行PCR扩增。结果表明扩增的片段大小与预期相符（预期为788 bp），见图1。 1 2 3bp20001000750500250100788 bp1. DL 2000 Marker； 2.空白对照；3.
13、TA4 PCR产物lane1：DL 2000 Marker； lane2：Control；lane3： TA4图1 TA4基因cDNA PCR产物Fig.1 PCR product of TA4 cDNA3.2 pMD18-T-TA4重组质粒的鉴定将TA4的PCR产物通过T-A方式与pMD18-T载体进行连接，转化大肠杆菌JM109。通过蓝白斑筛选，对初筛到的阳性克隆子用碱裂解法进行质粒小抽提。用Sac I和Kpn I进行酶切，产物经1 %的琼脂糖凝胶电泳分析，重组质粒显示两条带，一条大小与750 bp相近，一条与pMD18-T质粒大小相近（箭头所示），结果见图2。由此得到含有目的片段的重组质
14、粒，命名为pMD18-T-TA4。1 2 3 4bp20001000750500250100bp23130941665574361232220277881: DL2000 marker; 2：pMG36n-TA4 Sac I and Kpn I酶切产物 3: pMD18-T-TA4 Sac I and Kpn I酶切产物; 4:DNA Hind marker1: DL2000 marker; 2：pMG36n-TA4 disgested with Sac I and Kpn I；3: pMD18-T-TA4 disgested with Sac I and Kpn I; 4:DNA Hind
15、marker图2 重组质粒的酶切产物Fig.2 Agarose gel electrophoresis of recombinant plasmid digested with restriction enzyme3.3 重组表达质粒pMG36n-TA4的鉴定 经初筛后得到阳性克隆子用乳酸乳球菌质粒提取法进行质粒抽提。再将重组表达质粒pMG36n-TA4用限制性内切酶Sac I和Kpn I进行酶切，37 C过夜，得到预期的目的片段，电泳分析，重组质粒显示两条带，一条大小与750 bp相近，一条与pMG36n质粒大小相近（箭头所示），结果见图2，由此得到含有目的片段的重组质粒，命名为pMG36n
16、-TA4。以纯化的pMG36n-TA4重组质粒为模板，用设计的特异引物进行序列测定，结果表明插入的片段与预期设计完全相吻合，阅读框架正确，从而进一步确定了表达重组质粒构建的正确(图3)。GAGCTCATTCAGGATTACCCAACAGCAGTTACGCTGGACTGTAAAGAGGC 50GATGAACAAGCTGAGAAAAGCAGCAGGACTTCCTGCATTCGAAGATGCTG 100TGGGAGACACATTTGTTCTACCAGCATACTCGCATGAAGAGTCTAGGGCG 150GCACCAGTAGCTGAAACTCTCTGGAAGACGGAGATATGCCCCAAAG
17、TCTT 200AGGAGGCGGAAGGTCCAGGAACGTTACTGAAGCTGTCAAGTTAACTGGCA 250ATTTTGCCTACTACCCCGTCACAGACGGCAAAAAGGAGTGCAGCGATGCT 300GTGGAGTACTGGAAAGGCGGACTTTCTCAGTTCAACGACACAATTCCCCC 350AACGTTCCAAGCGTTGAACGACCCCGTTGTGTACAATGGCAGGGCTGTTT 400CCTTTGTCGCCCTATACAACCCCAAAACCAGCCCCGTTGTCAGTTGCGTG 450CTCCTCCAGTGCCCTAATGCAG
18、GTGTTGGTGGACGCAGGCTTGCGGCAGG 500CACGACAGACGCTGTCATTTGCTTGACAAATCCGGCTCCTTTGGAAGCAA 550GGTCACAACCATTCGACGACGAGCAATGGAAGAAAATTGTTGACTCTCTA 600TCTCTCTCTGAGGAAGAGGAAGAGAAGGGCGGAGTTTCTCCAGTCGTCCC 650TTCAGTAGCCCTCATCTCTGCGGCGGTCATCTCCGCTTTCGCTCTCTTTT 700AGGCGGGCGCCGGTTGTTAGTGACACACCAGCATTGGACAGATATGGCGG 7
19、50CGCAAGTTCCTTCCTGAGTGAAATCCTTGAGTGGTACC图3 TA4 抗原cDNA的测序结果Fig. 3 Nucleotide sequence of TA4 antigen cDNA3.4表达产物的SDS-PAGE分析 将TA4表达工程菌按上述方法进行表达，表达产物经SDS-PAGE分析，得到特定的目的蛋白条带，约25 Ku。与所预测的分子量相符(图4)。1 2 3 4 5 25 KU97.4Ku66.2Ku43.0KU31.0Ku1：蛋白Marker 2，3：含pMG36n空质粒的乳球菌裂解物；4，5：含pMG36n-TA4重组质粒的乳球菌裂解物lane1：Prot
20、ein Marker; 2,3：L.lactis LM0230/ pMG36n；lane 4，5：L.lactis LM0230/ pMG36n-TA4图4 TA4抗原在乳球菌中表达产物的SDS-PAGE电泳Fig. 4 SDS-PAGE of TA4 antigen expressed by L.lactis/ pMG36n-TA44. 讨论乳球菌作为一类食品级微生物，近十年来其遗传学及分子生物学在国内外引起广泛关注并获得迅速发展9。其一，乳球菌本身具有大量的染色体外因子如质粒和噬菌体，为其载体系统的发展提供了极好的材料。其二，乳球菌易培养、遗传操作（如电穿孔法转基因等）方法成熟简便。其三，
21、乳球菌本身为绿色菌，并具有分泌蛋白质的能力。综上所述乳球菌在表达异源多肽或蛋白，研制新型功能食品、医药等领域具有极好的应用前景。Brothers等将TA4抗原基因在大肠杆菌中直接表达或作为-半乳糖苷酶基因融合蛋白的一部分表达，证明表达产物可能有活性。本研究组建了TA4抗原cDNA在乳球菌中的组成型表达工程菌，所用载体含有来自乳球菌的强启动子P32，已用该启动子在乳球菌中成功表达了溶菌酶10。我们的研究也表明所构建的转球虫TA4基因活性乳球菌接种雏鸡后，抗球虫指数为160.12，可产生一定保护效果。依此证明重组工程菌具有较好的表达蛋白特性，这为以乳球菌为宿主菌表达有价值的外源基因研究奠定了基础。
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