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1、生物化学生物化学(王镜岩版王镜岩版)第三章第三章核酸化学核酸化学第一节第一节核酸的重要性核酸的重要性(ImportantanceofNucleicAcids)Whatarenucleicacids?Nucleicacidsareakindofveryimportantbiomacromolecule.Theyexistinallorganism(includingvirus).Theyplayveryimportantroleduringorganismlivingactivatesuchas:growthdevelopmentreproducingheredityvariation.Soit
2、canalsosaythatthereisnolifewithoutnucleicAcids.核酸化学研究史：（1）1869年Miescher,博士论文工作中测定淋巴细胞蛋白质组成时,发现了不溶于稀酸和盐溶液的沉淀物,并在所有细胞的核里都找到了此物质,故命名“核质(Nuclein)”,即今天我们所说的脱氧核糖核蛋白，其中脱氧核糖核酸的含量为30%。（2）1889年Altman等人又从酵母和动物的细胞核中得到了不含蛋白质的核酸，并建议将“核质”改名为“核酸”,因为已经认识到“核质”乃“核酸”与蛋白质的复合体。（3）1944年,O.T.Avery等人通过细菌转化实验证明核酸是遗传物质。目前，核酸的
3、的研究已成为生物学研究中最活跃的一个领域，是最重要的生物大分子。第二节核酸的分类及其在细胞内的分布（Classificationanddistributionofnucleicacid）一、核酸的分类一、核酸的分类Nucleicacidsaregroupedintotwotypesnucleicacid：（一）（一）脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid,DNA)（二）（二）核糖核酸（核糖核酸（ribonucleicacid,RNA)1、转移RNA（transferRNA,tRNA)2、核糖体RNA（ribosomalRNA,rRNA)3、信使RNA（mesenge
4、rRNA,mRNA)4、特殊功能的、特殊功能的RNA:SmallnuclearRNA,snRNASmallnucleoarRNA,snoRNASmallcytoplasmicRNA,scRNAAntisenseRNARibozymeRNaseP二、核酸的分布二、核酸的分布Ineukaryotes，DNAmainlyexistinnucleus（morethan98%）；）；mitochondriaandchloroplastsrespectivelyhavetheirownDNA.Inprokaryotes，DNAexistinnucleoid（拟核区）（拟核区）.Everyprokaryot
5、iccellonlycontainonechromsome（染色质），（染色质），whichisdouble-strandcircularDNAmolecule.Inaddition，ItalsocontainplasmidDNA（质粒（质粒DNA）Virusesconsitnucleicacid（DNAorRNA）coatedwithprotein（calledcapsid，病毒衣壳），病毒衣壳）.RNAmainlyexistinthecytosol（90%），），theother10%innucleus.三、核酸的功能（一）DNA是主要的遗传物质1944，O.Avery肺炎双球菌转化实验1
6、952，A.DHershey和M.Chase噬菌体感染实验（二）（二）RNA功能的多样性功能的多样性1、参与蛋白质的合成2、RNA的转录后加工与修饰3、参与基因表达的调控4、生物催化作用第三节第三节核酸的结构核酸的结构核酸（nucleicacid)核苷酸(nucleotide)磷酸(phosphoricacid)核苷(nucleoside)戊糖(pentose)碱基(base)一、核酸的化学组成一、核酸的化学组成两类核酸的基本化学组成RNA：D-核糖，A、G、C、U碱基DNA：D-2-脱氧核糖，A、G、C、T碱基（一）（一）碱基碱基1.嘧啶碱：尿嘧啶胞嘧啶胸腺嘧啶2.嘌呤碱：腺嘌呤鸟嘌呤嘌呤衍
7、生物：3.核酸中的修饰碱基：100余种，多数是甲基化的产物StructureofTandCStructureofAandG（二）（二）核苷与脱氧核苷核苷与脱氧核苷嘧啶碱：C1N1，嘌呤碱：C1N9。核酸中的核苷与脱氧核苷均为-型碱基平面与核糖平面互相垂直2、核酸中的稀有核苷、核酸中的稀有核苷稀有碱基稀有糖苷键：假尿嘧啶核苷（）P481甲基化核糖（三）（三）核苷酸核苷酸核苷中戊糖C2、C3、C5羟基被磷酸酯化1.Bases,Nucleosides,andNucleotidesCytosine,Cytidine,CytidinemonophosphateCMPUracil,Uridine,Urid
8、inemonophosphateUMPThymine,Thymidine,ThymidinemonophosphateAMPAdenine,Adenosine,AdenosinemonophosphateAMPGuanine,Guanosine,GuanosinemonophosphateGMP2、细胞内的游离核苷酸及其衍生物细胞内的游离核苷酸及其衍生物核苷5-多磷酸化合物ATP、GTP、CTP、在能量代谢和物质代谢及调控中起重要作用。环核苷酸3,5-cAMP，3,5-cGMP信号分子，cAMP调节细胞的糖代谢、脂代谢。二、二、DNA的结构的结构一级结构：脱氧核苷酸分子间连接方式及排列顺序。二
9、级结构：DNA的两条多聚核苷酸链间通过氢键形成的双螺旋结构。三级结构：DNA双链进一步折叠卷曲形成的构象。（一）（一）DNA的一级结构的一级结构蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5-核苷酸牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3-核苷酸P482图13-1磷酸二酯酶对核酸的水解作用DNA是dAMP、dGMP、dCMP、dTMP通过3、5-磷酸二酯键连接起来的线形或环形多聚体。P483图13-2DNA中多核苷酸的一个片段及缩写符号写法：53：5-pApCpTpG-3，或5ACTG3（二）（二）DNA的二级结构的二级结构1953年，Watson和Crick根据Chargaff规律和DNANa盐纤维的
10、X光衍射分析提出了DNA的双螺旋结构模型。PhotobyA.C.BarringtonBrown,courtesyofColdSpringHarborLaboratoryArchives.1962FrancisCrick,JamesWatson,andMauriceWilkinsreceivetheNobelPrizefordeterminingthemolecularstructureofDNA.Chargaff规律规律1950年年a.所有生物的DNA中，A=T，G=C且A+G=C+T。b.DNA的碱基组成具有种的特异性。c.DNA碱基组成没有组织和器官的特异性。d.年龄、营养状况、环境等因素
11、不影响DNA的碱基组成。StructureofDNADoubleHelix1、Watson-Crick双双螺螺旋旋结结构构模模型型(B-DNA)（1）DNA分子为两条多核苷酸链以相同的螺旋轴为中心，盘绕成右旋、反向平行的双螺旋.（2）磷酸和戊糖组成的骨架位于螺旋外侧，碱基位于螺旋内侧，并且按照碱基互补的原则，碱基之间通过氢键形成碱基对，A-T间形成二个氢键、G-C间形成三个氢键.（3）双螺旋的直径是2nm，每10个碱基对旋转一周，螺距为3.4nm，所有的碱基平面都与中心轴垂直.（4）维持双螺旋的力是碱基堆积力和氢键.3.4nm（1.2nm,0.85nm）（0.6nm,0.75nm）Double
12、helixRight-handed10basepairs/turn3.4nm/turnDiameter:ca.2.0nm磷酸与脱氧核糖彼此通过3、5-磷酸二酯键相连接，构成DNA分子的骨架。磷酸与脱氧核糖在双螺旋外侧，嘌呤与嘧啶碱位于双螺旋的内侧。碱基平面与纵轴垂直，糖环平面与纵轴平行两条核苷酸链之间依靠碱基间的氢链结合在一起。螺圈之间主要靠碱基平面间的堆积力维持每圈螺旋10.4nt，碱基堆积距0.34nm，双螺旋平均直径2nm，大沟：宽1.2nm，深0.85nm，小沟：宽0.6nm，深0.75nm2、稳定双螺旋结构的因素、稳定双螺旋结构的因素碱基堆积力形成疏水环境（主要因素）。碱基配对的氢键
13、。GC含量越多，越稳定。磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子或组蛋白的正离子之间形成离子键，中和了磷酸基上的负电荷间的斥力，有助于DNA稳定。碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，可免受水溶性活性小分子的攻击。3、DNA二级结构的多型性二级结构的多型性P489表13-6A-、B-、Z-DNA的比较相对湿度92%：BDNA相对湿度75%：ADNA。（1）BDNA：典典型型的的Watson-Crick双双螺螺旋旋DNA右手双螺旋每圈螺旋10.4个碱基对螺距：3.32nm（2）A-DNA右手双螺旋，外形粗短。RNA-RNA、RNA-DNA杂交分子具有这种结构。（3）Z-DNA左手螺旋，外形细长。天然B-DNA
14、的局部区域可以形成Z-DNA。（4）三股螺旋三股螺旋DNAK.Hoogsteen1963通常是一条同型寡核苷酸与寡嘧啶核苷酸-寡嘌呤核苷酸双螺旋的大沟结合：oligo(Py):oligo(Pu)oligo(Py/Pu)第一股是寡嘧啶，中间是寡嘌呤，第三股可以是寡嘧第一股是寡嘧啶，中间是寡嘌呤，第三股可以是寡嘧啶或寡嘌呤啶或寡嘌呤T=A:A,CG：C+T=A:TCG：G第三股与寡嘌呤之间同向平行，并按第三股与寡嘌呤之间同向平行，并按Hoogsteen配对配对DNA三股螺旋结构常出现在DNA复制、转录、重组的起始位点或调节位点，如启动子区。第三股链的存在可能使一些调控蛋白或RNA聚合酶等难以与该区
15、段结合，从而阻遏有关遗传信息的表达。(三）三）DNA的三级结构的三级结构DNA在双螺旋的基础上通过扭曲和折叠形成的构象超螺旋是DNA三级结构的主要形式1、环状环状DNA的三种典型构象的三种典型构象P491图图13-12（1）、）、松弛环形松弛环形DNA线形DNA直接环化（2）、）、解链环形解链环形DNA线形DNA拧松后再环化（3）、）、正超螺旋与负超螺旋正超螺旋与负超螺旋DNA2、三种环形三种环形DNA的拓扑学特性的拓扑学特性连环数（连环数（linkingnumber,L）DNA双螺旋中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数扭转数（扭转数（twistingnumber,T）DNA分子中的Wat
16、son-Crick螺旋数目，以T表示超螺旋数（缠绕数超螺旋数（缠绕数,writhingnumber,W）连环数（L）缠绕数（T）扭曲数W松驰环25250解链环23230超螺旋2325-2L=T+W负超螺旋DNA是由于两条链的缠绕不足引起（L），很易解链，易于参加DNA的复制、重组和转录等3、真核生物染色体的结构、真核生物染色体的结构染色质、染色体常染色质、异染色质永久性异染色质、功能性异染色质核小体（nucleosome):146bp,组蛋白：H2A、H2B、H3、H4P495图13-17真核生物染色体真核生物染色体DNA的组装层次的组装层次MOV：MCB4.0threedimensional
17、packingofnuclearchromosomes三、三、RNA的结构的结构（一）（一）RNA的一级结构的一级结构P483AMP、GMP、CMP、UMP通过3、5磷酸二酯键形成的线形多聚体。组成RNA的戊糖是核糖RNA的U替代DNA中的T，此外，RNA中常有一些稀有碱基。天然RNA分子都是单链线形分子，只有部分区域是A-型双螺旋结构。TransferRNASmallpolynucleotidechains-73to94residueseachSeveralbasesusuallymethylatedmethylatedEacha.a.hasatleastoneuniquetRNAwhich
18、carriesthea.a.totheribosome3-terminalsequenceisalwaysCCA-a.a.AminoacyltRNAmoleculesarethesubstratesofproteinsynthesis假尿嘧啶核苷假尿嘧啶核苷二氢尿嘧啶核苷二氢尿嘧啶核苷胸腺嘧啶核糖核苷胸腺嘧啶核糖核苷4-硫尿核苷硫尿核苷次黄嘌呤核苷次黄嘌呤核苷1-甲基鸟苷甲基鸟苷N-6-异戊烷腺苷异戊烷腺苷二级结构：二级结构：三叶草型三叶草型氨基酸臂二氢尿嘧啶环反密码环额外环TC环（假尿嘧啶环）三级结构：三级结构：倒倒L形（酵母形（酵母tRNAphe)tRNA的功能：转运氨基酸识别密码子参与翻
19、译起始参与DNA的反转录参与基因表达调控（三）（三）mRNA的结构的结构原核：多顺反子（原核：多顺反子（polycistronicmRNA)真核：单顺反子，断裂基因（真核：单顺反子，断裂基因（splitedgene)EukaryoticmRNADNAistranscribedtoproduceheterogeneousnuclearRNA（hnRNA核内不均一RNA）mixedintronsandexonswithpolyAintron-interveningsequenceexon-codingsequencepolyAtail-stability?Splicingproducesfinal
20、mRNAwithoutintrons5-帽子：帽子：m7G5-ppp5-Nm（Nm）p-O型：m7G5-ppp5-Np-I：m7G5-ppp5-Nmp-Np-II:m7G5-ppp5-Nmp-Nmp-Np-甲基鸟苷5，5-三磷酸（四）（四）rRNA的结构的结构细菌：16SrRNA、5SrRNA、23SrRNA组成30S转录单位真核：18SrRNA、5.8SrRNA，28SrRNA组成45S的转录单位，5SrRNA单独转录。Ribosomesareabout2/3RNA,1/3proteinrRNAservesasascaffoldforribosomalproteins23SrRNAinE.c
21、oliisthepeptidyltransferase!大肠杆菌5SrRNA结构P498图13-2016S、5SrRNA的结构rRNA的功能：的功能：组成核糖体催化肽键形成的转移酶活性存在于23SrRNA上参与tRNA与mRNA的结合第三节第三节核酸的物理化学性质核酸的物理化学性质一、核酸的水解一、核酸的水解（一）酸水解对酸的敏感性：糖苷键磷酸酯键嘌呤糖苷键嘧啶糖苷键利用酸水解可以研究核酸的碱基组成（二）（二）碱水解碱水解RNA的磷酸酯键对碱敏感室温，0.31mol/LKOH，24h，可将RNA完全水解。DNA抗碱水解生理意义：DNA更稳定，遗传信息。RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。
22、（三）（三）酶水解酶水解非特异的磷酸二酯酶：蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5-核苷酸牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3-核苷酸特异的磷酸二酯酶：核酸酶1、核酸酶的分类、核酸酶的分类底物专一性：底物专一性：核糖核酸酶RNase脱氧核糖核酸酶DNase作用方式：作用方式：核 酸 外 切 酶（exonuclease)、核 酸 内 切 酶(endonuclease)单链核酸酶、双链核酸酶、杂链核酸酶磷酸二酯键的断裂方式：磷酸二酯键的断裂方式：5-（寡）核苷酸3-（寡）核苷酸2、RNAaseRNaseH作用于DNA-RNA中的RNA链牛胰核糖核酸酶（pancreaticribonuclease
23、),RNaseI最适pH：7.0-8.2产物：以3-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸，高度专一的内切酶RNaseT1耐热、耐酸产物：以3-鸟苷酸结尾的寡核苷酸，专一性更高RNaseT2产物：以3-腺苷酸结尾的寡核苷酸3、DNase核酸酶核酸酶S1作用于单链DNA部分牛胰核糖核酸酶，牛胰核糖核酸酶，DNaseI切断双链或单链DNA产物：以5-磷酸为末端的寡核苷酸5、DNA限制性内切酶限制性内切酶(RestrictionEnzymes)在细菌中发现，主要降解外源在细菌中发现，主要降解外源DNA。具有。具有严格的碱基序列专一性严格的碱基序列专一性Bacteriahavelearnedtorestrictth
24、epossibilityofattackfromforeignDNAbymeansofrestrictionenzymesTypeIIandIIIrestrictionenzymescleaveDNAchainsatselectedsitesEnzymesmayrecognize4,6ormorebasesinselectingsitesforcleavageAnenzymethatrecognizesa6-basesequenceisasix-cutter二、二、核酸的酸碱性质核酸的酸碱性质磷酸和碱基均能发生两性解离。DNA等电点44.5RNA等电点22.5三、三、核酸的紫外吸收核酸的紫外吸
25、收碱基、核苷、核苷酸和核酸在240290nm的紫外波段有强烈的光吸收，max=260nm1、鉴定纯度鉴定纯度纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85）纯RNA的A260/A280应为2.0。若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。2、含量计算含量计算A值为1相当于：50ug/mL双螺旋DNA或：40ug/mL单链DNA（或RNA）或：20ug/mL寡核苷酸四、四、核酸的变性、复性及杂交核酸的变性、复性及杂交(Denaturation、Renaturation and Hybridization)(一一)DNA变性变性(DenaturationofDNA)核
26、酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。DenaturationofDNADouble-strandedDNAA-TrichregionsdenaturefirstCooperativeunwindingoftheDNAstrandsStrandseparationandformationofsingle-strandedrandomcoilsExtremesinpHorhightemperature变性因素：热变性酸碱变性（pH小于4或大于11）变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）变性后的理化性质：260nm吸收值升高。粘度降低，浮力密度升高。二级结构改变，部分失活。增色效应与减色效应增色
27、效应与减色效应增色效应：在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大减色效应：在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小。DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。1、熔解温度（熔解温度（Tm）：）：DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。DNA的Tm一般在8295之间2、影响影响DNA的的Tm值的因素值的因素DNA均一性。均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析DNA的均一性。G-C含量与Tm值成正比。测定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）2.44介质中离子强度介质中离子强度离子强度高，Tm高。(二二)复性复性(Renaturation)变性DNA在适当（一般低于T
28、m2025）条件下，两条链重新缔合成双螺旋结构。DNAreassociation(renaturation)Double-strandedDNADenatured,single-strandedDNASlower,rate-limiting,second-orderprocessoffindingcomplementarysequencestonucleatebase-pairingFaster,zipperingreactiontoformlongmoleculesofdouble-strandedDNA热变性DNA在缓慢冷却时可以复性，快速冷却不能复性。DNA片段越大，复性越慢；DNA浓度
29、越大，复性越快。复性速度可用Cot衡量Co为变性DNA原始浓度molL-1，t为时间，以秒表示。P352图5-22，不同DNA的复性动力学曲线。Cot1/2表示复性一半的Cot值。根据复性动力学可以测定基因组的大小和重复序列的拷贝数(三三)核核酸酸的的杂杂交交加热加热双链双链DNADNA单链单链DNA杂交杂交杂化双链杂化双链在在DNADNA复性过程中复性过程中,双链分子的再形成既可以发生在序列完全互补双链分子的再形成既可以发生在序列完全互补的核酸分子之间的核酸分子之间,也可以发生在碱基序列部分互补的不同的也可以发生在碱基序列部分互补的不同的DNADNA之之间或间或DNADNA与与RNARNA之
30、间之间,这种现象称为这种现象称为分子杂交分子杂交。核核酸酸杂杂交交可可以以是是DNA-DNA，也也可可以以是是DNA-RNA杂交。杂交。不不同同来来源源的的，具具有有大大致致相相同同互互补补碱碱基基顺序的核酸片段称为顺序的核酸片段称为同源顺序同源顺序。利利用用核核酸酸的的分分子子杂杂交交，可可以以确确定定或或寻寻找找不不同同物物种种中中具具有有同同源源顺顺序序的的DNA或或RNA片段。片段。第四节第四节核酸研究技术核酸研究技术一、一、核酸的分离纯化和定量核酸的分离纯化和定量尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。抑制核酸酶。（三）核酸的定量（三）核酸的定量P5
31、14紫外分光光度法紫外分光光度法硫酸硫酸钼酸钼酸还原剂还原剂定磷法定磷法有机磷有机磷P磷钼酸磷钼酸钼蓝钼蓝盐酸盐酸苔黑酚苔黑酚定糖法定糖法RNA糠醛糠醛鲜绿色物鲜绿色物盐酸盐酸定糖法定糖法DNA蓝色物蓝色物二苯胺二苯胺二、核酸的沉降特性与超速离心二、核酸的沉降特性与超速离心不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来这一方法常用于质粒DNA的纯化。（一）密度梯度超速离心测定核酸的浮力密度：（一）密度梯度超速离心测定核酸的浮力密度：8MCsCl，45000rpm，16h密度梯度：1.80g/ml1.55g/ml平衡
32、时：浮力密度=CsCl密度=离心力=0+4.22（r2-r02）10-10：浮力密度0：为标准DNA的密度：角速度（弧度/秒）r：样品到转轴的距离（二）密度梯度超速离心测定（二）密度梯度超速离心测定DNA的的G-C含量含量G-C含量与含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系的浮力密度之间呈正比关系=0.1xG-C+1.658xG-C=（-1.658）10但是5-甲基胞嘧啶多的DNA，其实际浮力密度会降低，低于理论值。（三）密度梯度超速离心研究核酸的构象（三）密度梯度超速离心研究核酸的构象RNADNA变性DNA双链DNA蛋白质，变性程度越大，浮力密度越大（四）密度梯度超速离心纯化（四）密度梯度超速离
33、心纯化RNA或不同构象或不同构象的的DNA超螺旋超螺旋DNADNA或或三、三、核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳（一）（一）琼脂糖电泳琼脂糖电泳用于大片段用于大片段DNA的分离，精度低，但分离范围广的分离，精度低，但分离范围广影响迁移率的因素：核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比凝胶浓度DNA的构象，超螺旋最快，线形其次，环形最慢。电压，不大于5V/cm染色：0.5ug/mlEBRNA的琼脂糖凝胶电泳一般要加入甲醛或戊二醛琼脂糖电泳可以用于琼脂糖电泳可以用于DNA分子量的测定分子量的测定琼脂糖电泳可以用于琼脂糖电泳可以用于DNA的制备与纯化的制备与纯化（二）（二）PAGE电泳电泳用于小片段用于小片段DNA的分析，精度非常高的分析，精度非常高六六、DNA聚聚合合酶酶链链式式反反应应PolymeraseChainReactionPCRPCR是以DNA聚合酶在体外扩增DNA片断技术，经历DNA变性、退火、聚合酶催化DNA链的延伸等三个步骤周而复始的过程。1993Dr.KaryMullisdiscoveredthePCRprocedure,forwhichhewasawardedtheNobelprize.