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1、大肠杆菌感受态细胞的制备、大肠杆菌感受态细胞的制备、1.实验目的和要求实验目的和要求 通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受体转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。了解细胞转化的概念及其在分子生物了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。学研究中的意义。（2）每每组组取取培培养养液液1-4ml转转入入离离心心管管中中，在在冰冰上上冷冷却却5min(可可省省略略）,5000rmin离离心心2min（3）倒倒 净净 上上 清清 培培 养养 液液，用用 1ml冰冰 冷冷 的的
2、0.1mo1L CaCl2溶溶液液轻轻轻轻悬悬浮浮细细胞胞，冰冰浴浴30min；（4）5000rmin离心离心2min；（5）弃弃 去去 上上 清清 液液，加加 入入 400l冰冰 冷冷 的的0.1mo1L CaCl2溶溶液液，小小心心悬悬浮浮细细胞胞。5000rmin离心离心2min；（6）弃弃去去上上清清液液，加加入入200l冰冰冷冷的的0.1mo1L CaCl2溶溶液液，小小心心悬悬浮浮细细胞胞，冰冰上上放放置置片片刻刻后，即制成了感受态细胞悬液；后，即制成了感受态细胞悬液；（7）制制备备好好的的感感受受态态细细胞胞悬悬液液可可直直接接用用于于转转化化实实验验，也也可可加加入入占占总总体
3、体积积15左左右右高高压压灭灭菌菌过过的的甘甘油油，混混匀匀后后分分装装于于1.5ml离离心心管管中中，置置于于-70条件下，可保存半年至一年。条件下，可保存半年至一年。2）细胞转化）细胞转化(1)分别取分别取3个个200l感受态细胞悬液感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作则需化冻后马上进行下面的操作)，(2)第一组，第一组，转化实验组转化实验组 加入加入5 l重组质粒重组质粒DNA+200l感受态细胞感受态细胞 第二组，第二组，插入插入插入插入DNADNA片段对照组片段对照组片段对照组片段对照组，插入插入插入插入DNADNA片段片段片段片段+200l感
4、受态细胞悬液；感受态细胞悬液；第三组，质粒第三组，质粒DNA对照组对照组 1ng 质粒质粒DNA十十200l感受态细胞悬液。感受态细胞悬液。(2)将将以以上上各各样样品品轻轻轻轻摇摇匀匀，冰冰上上放放置置30min，于于42水水浴浴中中保保温温1.5min，然然后后迅迅速速冰冰上上冷却冷却2min(3)立立即即向向上上述述管管中中分分别别加加入入0.6ml LB液液体体培培养养基基（不不需需在在冰冰上上操操作作），使使总总体体积积到到0.8ml，该该溶溶液液称称为为转转化化反反应应原原液液，摇摇匀匀后后于于37振振荡荡培培养养约约45min，使使受受体体菌菌恢恢复复正正常生长状态常生长状态 3
5、)平板培养（有时需要稀释）平板培养（有时需要稀释）(1)取取各各样样品品培培养养液液0.1ml，分分别别接接种种于于含含抗抗菌菌素素LB平平板板培培养养基基上上，涂涂匀匀（如如果果用用玻玻璃璃棒棒涂涂抹抹，酒酒精精灯灯烧烧过过后稍微凉一下再用，不要过烫后稍微凉一下再用，不要过烫）。）。(2)菌液完全被培养基吸收后菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，倒置培养皿，于于37恒温培养箱内培养过夜恒温培养箱内培养过夜(12-16小时小时)，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养 用用 CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微法制备的感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒克超
6、螺旋质粒 DNA产生产生5 106-2 107个转化个转化菌落。在实际工作中，每微克有菌落。在实际工作中，每微克有105以上的转以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验。化菌落足以满足一般的克隆实验。n n为了提高转化效率为了提高转化效率,实验中要考虑以下几实验中要考虑以下几个重要因素：个重要因素：n nn n 1.细胞生长状态和密度细胞生长状态和密度:不要用经过多不要用经过多次转接或储于次转接或储于的培养菌，最好从的培养菌，最好从70或或-20甘油保存的菌种中直接转接甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。用于制备感受态细胞的菌液。n nn n2.质粒的质量和浓度质粒的质量和浓度:n
7、n 用于转化的质粒用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源。转化效率与外源DNA的的浓度在一定范围内成正比浓度在一定范围内成正比 n n 加入的外源加入的外源DNA的量过多或体积过大的量过多或体积过大时时,转化效率就会降低。转化效率就会降低。n n 1ng的的cccDNA即可使即可使50l 的感受态细的感受态细胞达到饱和。一般情况下胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体溶液的体积不应超过感受态细胞体积的积不应超过感受态细胞体积的5。n nn n3.试剂的质量试剂的质量:n n 所用的试剂所用的试剂,如如CaCl2 等均需是最高纯等均需是最高纯度
8、的度的(GR.或或AR.),并用超纯水配制并用超纯水配制,最好分最好分装保存于干燥的冷暗处。装保存于干燥的冷暗处。n nn n4.防止杂菌和杂防止杂菌和杂DNA的污染：的污染：n n 整个操作过程均应在无菌条件下进行整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿所用器皿,如离心管如离心管,tip头等最好是新的头等最好是新的,并经高压灭菌处理并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂酶或杂DNA所污染所污染,否则均会影响转化效率或杂否则均会影响转化效率或杂DNA的转入的转入,为以后的筛选、鉴定带来不为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻
9、烦。必要的麻烦。重组质粒克隆的鉴定重组质粒克隆的鉴定鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有 -互补互补 小规模制备质粒小规模制备质粒DNA进行酶切分析进行酶切分析 插入失活插入失活 PCR 杂交筛选的方法杂交筛选的方法最常用的方法是小规模制备质粒最常用的方法是小规模制备质粒DNA进行进行酶切分析，对于带有酶切分析，对于带有LacZ基因的载体还可基因的载体还可以结合以结合-互补现象来筛选。互补现象来筛选。组组组组含抗菌素的平板含抗菌素的平板含抗菌素的平板含抗菌素的平板结果说明结果说明结果说明结果说明 转化实验组转化实验组转化实验组转化实验组 白色白色白色白色菌落和少
10、量菌落和少量菌落和少量菌落和少量蓝色菌落蓝色菌落蓝色菌落蓝色菌落说明有重组质粒导入说明有重组质粒导入说明有重组质粒导入说明有重组质粒导入细细细细胞中（有时还需要酶切胞中（有时还需要酶切胞中（有时还需要酶切胞中（有时还需要酶切进一步鉴定进一步鉴定进一步鉴定进一步鉴定插入插入插入插入DNADNA片片片片段对照组段对照组段对照组段对照组无菌落或极少量无菌落或极少量无菌落或极少量无菌落或极少量白色菌落白色菌落白色菌落白色菌落说明插入片段比较纯或说明插入片段比较纯或说明插入片段比较纯或说明插入片段比较纯或有少量模板有少量模板有少量模板有少量模板DNADNA存在存在存在存在 质粒对照组质粒对照组质粒对照组质粒对照组 蓝色菌落蓝色菌落蓝色菌落蓝色菌落可以判断感受态细胞的可以判断感受态细胞的可以判断感受态细胞的可以判断感受态细胞的效率效率效率效率各实验组在培养皿内菌落生长状况及结果分析各实验组在培养皿内菌落生长状况及结果分析n n思考题思考题 n n1.制备感受态细胞的原理是什么？制备感受态细胞的原理是什么？n n2.如果实验中对照组本不该长出菌如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种现象？解释这种现象？