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1、免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术CK阳性阳性肿瘤细胞组织来源肿瘤细胞组织来源（中间丝标志物）（中间丝标志物）EMA阳性阳性肿肿瘤瘤的的病病因因和和发发病病机机理理研研究究 HBsAg阳性阳性（病毒及癌基因标志物）（病毒及癌基因标志物）肿肿瘤瘤细细胞胞功功能能分分类类B细细胞胞阳阳性性（淋巴瘤及神经内分泌肿瘤标志）（淋巴瘤及神经内分泌肿瘤标志）肿瘤癌前病变和早期诊断肿瘤癌前病变和早期诊断P53阳性阳性（癌癌胚胚抗抗原原或或肿肿瘤瘤相相关关抗抗原原）肿瘤病理诊断与鉴别诊断肿瘤病理诊断与鉴别诊断HMB45阳性阳性（各各种种肿肿瘤瘤特特异异性性抗抗原原）肿瘤治疗和预后判断肿瘤治疗和预后判断PR阳性
2、阳性（性激素受体，癌基因和细胞增殖活性标志）（性激素受体，癌基因和细胞增殖活性标志）Cer-bB-2Cer-bB-2Ki-67阳性阳性第一节第一节基基本本原原理理 抗抗原原抗抗体体（特特异异性性）酶酶标标记记抗抗体体，通通过过酶酶与与底底物物作作用用生生成成有有色色反反应应物物，定定位位组组织织或或细细胞胞内内抗抗原原的的一门技术。一门技术。免疫酶组化免疫酶组化免疫学免疫学(抗原抗体反应抗原抗体反应)酶细胞化学酶细胞化学(底物显色反应底物显色反应)+特异性特异性敏感性敏感性定位性定位性可视性可视性PAP法法免疫酶组织化学基本组成：免疫酶组织化学基本组成：抗原抗原抗体抗体放大系统放大系统显色系统
3、显色系统ABC法法免疫酶特点：免疫酶特点：信号定位准确信号定位准确标本可长期保存标本可长期保存阳性标记与病变关系阳性标记与病变关系方法简便，易推广方法简便，易推广第二节第二节 酶酶 和和 底底 物物 一、酶及其特点一、酶及其特点 酶选择标准：酶选择标准：该酶用细胞化学易于被检出，该酶用细胞化学易于被检出，能被光镜或电镜观察。能被光镜或电镜观察。酶反应产物须稳定，不扩散，酶反应产物须稳定，不扩散，具有良好定位。具有良好定位。酶易于纯化，获得纯制品。酶易于纯化，获得纯制品。酶与免疫球蛋白结合后，不丧酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。失其活性。酶在酶在PH中性液内较稳定。中性液内较稳定。组织中不应
4、存在与底物作用组织中不应存在与底物作用的内源性酶。的内源性酶。符合上述条件：符合上述条件：辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶硷性磷酸酶硷性磷酸酶葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶（一）辣根过氧化物酶（一）辣根过氧化物酶（HRP）分子量（分子量（40000），不会遮盖抗），不会遮盖抗原的结合部位原的结合部位稳定，易获得较高纯度酶稳定，易获得较高纯度酶具有较高活性及特异性具有较高活性及特异性可溶性佳，生成的产物不扩散可溶性佳，生成的产物不扩散组织中内源性酶较少组织中内源性酶较少可作用于多种底物，产生不同可作用于多种底物，产生不同颜色颜色HRP穿透力强，易进入细胞内穿透力强，易进入细胞内 （二）硷性磷酸酶（二）硷性
5、磷酸酶（AKP）从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取组织穿透能力较弱组织穿透能力较弱内源性内源性AKP较高较高左旋咪唑具有抑制作用左旋咪唑具有抑制作用 （三）葡萄糖氧化酶（三）葡萄糖氧化酶（GODGOD）底物为葡萄糖，终产物稳定底物为葡萄糖，终产物稳定体内无内源性体内无内源性GOD分子量大，穿透力较弱分子量大，穿透力较弱 二、底物及其特点二、底物及其特点酶酶底底物物酶酶底底物物酶酶产物（显色）产物（显色）HRP的底物：的底物：HRP的底物为低浓度的的底物为低浓度的H2O2，供氢体为胺类及酚类化合物。，供氢体为胺类及酚类化合物。HRP显色反应：显色反应：HRPH2O2HRPH
6、2O电子供体（氧化型）电子供体（氧化型）电子供体电子供体电电子子供供体体被被氧氧化化后后，迅迅速速改改变变颜颜色色，通通过过聚聚合合等等反反应应，生生成成不不溶溶性有色颗粒，并就地原位沉淀。性有色颗粒，并就地原位沉淀。HRP常用的电子供体：常用的电子供体：3.3-二氨基联苯胺二氨基联苯胺(DAB)棕色棕色氨乙基卡巴唑氨乙基卡巴唑(AEC)红色，易红色，易溶于有机溶剂，易扩散，用水溶于有机溶剂，易扩散，用水溶性封固剂。溶性封固剂。4-氯氯-1-茶酚（茶酚（4CN）蓝色，）蓝色，易弥散，不能久保存易弥散，不能久保存3.3，5.5-四甲基联苯胺四甲基联苯胺(TMB)黄色黄色AKP底物：底物：AKP常
7、常用用的的底底物物为为-萘萘酚酚AS-B1磷酸盐磷酸盐偶联试剂：偶联试剂：固兰固兰BB蓝色蓝色固红固红TR红色红色第三节第三节酶标记抗体法酶标记抗体法酶酶 标标 记记 抗抗 体体 法法（EnzaymeLabelledantibody）是是将将酶酶通通过过共共价价键键结结合合在在抗抗体体分分子子上上，制制备备成成酶酶标标记记抗抗体体，通通过过抗抗体体去去寻寻找找相应抗原。相应抗原。一、直接法一、直接法原理：原理：HRP标记在特异性抗体标记在特异性抗体（第一抗体）上，抗原（第一抗体）上，抗原-抗体抗体HRP复合物复合物组织抗原组织抗原第一抗体第一抗体过氧化物酶过氧化物酶直接法直接法步骤：步骤：一步
8、完成一步完成特点：特点：方法简便、省时，专一方法简便、省时，专一性强，非特异染色轻，性强，非特异染色轻，但敏感性差，一种标记但敏感性差，一种标记抗体只能检测一种抗原。抗体只能检测一种抗原。二、间接法二、间接法原理：原理：HRP标记在第二抗体上，标记在第二抗体上，抗原抗原-特异性抗体特异性抗体-第第二抗体二抗体HRP复合物复合物步骤：步骤：二步法二步法组织抗原组织抗原第一抗原第一抗原第二抗体第二抗体过氧化物酶过氧化物酶间接法间接法特点：特点：敏感性较直接法高，一敏感性较直接法高，一种标记抗体能用于相应种标记抗体能用于相应动物制备的多种特异性动物制备的多种特异性抗体，检测多种抗原。抗体，检测多种抗
9、原。但较直接法费时，非特但较直接法费时，非特异染色稍重。异染色稍重。第四节第四节酶酶抗抗酶酶法法制备抗酶抗体制备抗酶抗体制备制备PAP复合物复合物酶桥法酶桥法组织抗原组织抗原第一抗体第一抗体第二抗体第二抗体第三抗体（抗酶抗体）第三抗体（抗酶抗体）HRP一、一、PAP法法原理：原理：抗原抗原-特异性抗体特异性抗体-第第二抗体（桥抗体）二抗体（桥抗体）-PAP复合物复合物步骤：步骤：三步法三步法组织抗原组织抗原第一抗原第一抗原第二抗体第二抗体PAP复合物复合物PAP法法HRP特点：特点：敏感性较高，背景染色较轻敏感性较高，背景染色较轻但特异性抗体与但特异性抗体与PAP必须为必须为同一种属动物同一种
10、属动物二、双二、双PAPPAP法：法：原理：原理：在在PAP的基础上再重复的基础上再重复第二抗体和第二抗体和PAP复合物复合物抗原抗原-特异性抗体特异性抗体-第二抗第二抗体（桥抗体）体（桥抗体）-PAP-第二抗第二抗体体-PAP复合物复合物组织抗原组织抗原第一抗原第一抗原第二抗体第二抗体PAP复合物复合物双双PAP法法HRP双双PAP法法组织抗原组织抗原第一抗原第一抗原第二抗体第二抗体PAP复合物复合物HRP步骤：步骤：五步法五步法特点：特点：敏感性较高敏感性较高缺点：缺点：但步骤多，费时，非特但步骤多，费时，非特异背景重异背景重三、三、APAAPAPAAP法法原理：原理：抗原抗原-特异抗体特
11、异抗体-第二第二抗体抗体-APAAP复合物复合物步骤：步骤：三步法三步法APAAP法法特点：特点：非特异背景较轻，不受内非特异背景较轻，不受内源性酶的干扰。源性酶的干扰。但产物易溶于有机溶剂但产物易溶于有机溶剂第五节第五节卵白素卵白素-生物素法生物素法Avidin为一种硷性糖蛋白，由为一种硷性糖蛋白，由四个相同亚基组成四个相同亚基组成Biotin小分子维生素小分子维生素Avidin和和Biotin具有较高亲和力具有较高亲和力一一 、ABC法法AvidinBiotinComplex原理：原理：酶标记酶标记Biotin形成酶素化形成酶素化Biotin酶素化酶素化BiotinAvidin-ABC复合
12、物复合物抗原抗原-特异抗体特异抗体-Biotin标记标记第二抗第二抗-AvidinBiotinHRP组织抗原组织抗原第一抗体第一抗体第二抗体第二抗体HRP生物素生物素卵白素卵白素ABC法法步骤：步骤：三步法三步法特点：特点：敏感性较高，特异性强，敏感性较高，特异性强，应用范围广应用范围广某些脏器存在内源性生物素某些脏器存在内源性生物素干扰干扰Avidin与核酸及细胞膜中磷脂与核酸及细胞膜中磷脂有非特异反应有非特异反应SABC法法Streptavidin biotin Peroxidase ComplexSABC法已代替法已代替ABC法法 二、二、LSAB法法Labelled Streptavi
13、din BiotinMethod原理：原理：Biotin标记第二抗体标记第二抗体LSAB法法HRP标记标记Avidin抗抗原原-特特异异性性抗抗体体-Biotin标标记记第二抗体第二抗体-AvidinHRP复合物复合物步骤：步骤：三步法三步法特点：特点：敏感性高，特异性强，敏感性高，特异性强，方法简便方法简便第六节第六节 多聚合物酶法多聚合物酶法多聚合物酶法多聚合物酶法 HRP-HRP-多聚合物多聚合物-抗体抗体 一、一、Epos法法Enhanced polymer one-stepstaining组织抗原组织抗原一抗一抗HRP多聚骨架多聚骨架EPOS方法方法原理：原理：采用一种具有惰性的多聚
14、采用一种具有惰性的多聚化合物作为骨架，将特异化合物作为骨架，将特异性抗体和性抗体和HRP，同时标记，同时标记在多聚合物分子上，形成在多聚合物分子上，形成HRP-多聚合物多聚合物-特异性特异性抗体。抗体。步骤：步骤：一步法一步法特点：特点：快速，简便，特异性强，快速，简便，特异性强，敏感性高敏感性高但商品化种类不全，但商品化种类不全，价格昂贵价格昂贵二、二、EnVision法法EnhancedLabelledPolymerSystem原理：原理：HRP-多聚合物多聚合物-第二第二抗体抗体组织抗原组织抗原一抗一抗二抗二抗酶酶多聚骨架多聚骨架第一步第一步第二步第二步EnVisionTM方法方法特点：
15、特点：敏敏感感性性高高：（1mole复复合合物物中中含含70moleHRP和和10mole第第二二抗体）抗体）特异性强：特异性强：复合物内无内源性复合物内无内源性Avidin和和Biotin的干扰。的干扰。第七节第七节基本操作步骤基本操作步骤 抗原修复抗原修复内源性过氧化物抑制内源性过氧化物抑制正常血清封闭正常血清封闭第一抗体第一抗体第二抗体第二抗体酶标记体酶标记体DAB-H2O2显色显色第八节第八节抗原定位及非特异染色抗原定位及非特异染色 组织细胞组织细胞固定问题固定问题脱蜡不彻底脱蜡不彻底内源性过氧化物内源性过氧化物内源性生物素内源性生物素抗原抗原抗原弥散抗原弥散抗原异常表达抗原异常表达共同抗原决定簇共同抗原决定簇特异性抗体特异性抗体非特异吸附非特异吸附抗体不纯抗体不纯交叉反应交叉反应第二抗体第二抗体IgG交叉反应交叉反应二抗不纯二抗不纯标记物标记物质量质量纯度纯度标记水平标记水平底物溶液底物溶液DABH2O2操作操作复染复染抗体稀释度抗体稀释度孵育时间孵育时间PAS洗涤洗涤第九节第九节免疫酶方法评价免疫酶方法评价ESAVIMCA125INVVIMCKCD20VIMHPCPRPCNATOPOKi-67P21