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1、微生物标本采集技术 临床微生物 环境微生物感染办张瑞芳正确的微生物标本采集和运输，是精确的病原学诊断的前提基本原则1、刚好采集微生物标本作病原学检查2、在抗菌药物运用前采集标本3、采样时严格执行无菌操作4、采样后马上送检5、棉拭子标本宜用运输培育基6、标本容器须灭菌处理，但不得运用消毒剂7、送检标本时应注明来源和检验目的8、混有正常菌群的标本，不行置肉汤培育如何提高细菌阳性检出率、标本采集时机、标本采集方法、标本的质与量、标本的运输与保存、镜检筛选合格标本、高质量、多种分别培育基培育环境一、痰标本采集关于咳痰标本在抗菌素应用前采集标本标本采集后12h内必需马上进行试验室处理痰标本应用最早且广泛
2、，但也是最受争议的标本采集标本过程中要有专业的医务人员指导使下呼吸道感染病原诊断成犯难题细菌（包括防线菌与奴卡菌，厌氧菌与分枝杆菌）真菌（包括肺孢子菌）病毒支原体、衣原体与立克次体原虫寄生虫痰标本采集自然咳痰标本患者早晨起床后，用清水或冷开水反复漱口去除过量的口腔细菌，有假牙者应取下假牙先轻咳，咳出口腔中的痰液弃去，再用力深咳，从气管咳出呼吸道深部的痰，干脆吐入清洁、无菌的容器中无痰可用3%-5%NaCI5ml雾吸约5min导痰也可用物理疗法。体位引流等法取痰几种下呼吸道干脆采集的标本经气管穿刺吸引经胸壁针刺吸引经支气管镜采样支气管肺泡灌洗经支气管镜干脆吸引开胸肺活检经人工气道吸引分泌物痰标本
3、采集吸痰吸痰：无法咳痰或不合作者、人工气道者，戴好无菌手套，无菌集痰器分别连接吸引器和无菌吸痰管。按吸痰法将痰吸入无菌集痰器内，加盖送检经支气管镜干脆吸引：留意严格无菌操作二、尿标本的正确采集清洁中段尿标本应保证尿液在膀胱内至少停留4h以上。最好留取早晨清洁中段尿标本方法：患者睡前少饮水，早晨起床后先用肥皂水清洗会阴部，女性应用手分开大阴唇，男性上翻包皮，细致清洗，再用清水冲洗尿道口四周；起先排尿，将前段尿排出，弃去，不要停顿，干脆将中段尿10-20ml干脆排入专用的无菌容器中，马上送检。容器内是无菌的，所以打开容器盖后，应拿在手中，不要随意乱放。记录留取标本的时间，保证在留取标本后1小时内送
4、至检验科尿标本正确采集-留置导尿消毒导尿管外部（接头上端近会阴部），按无菌操作方法用注射器穿刺导尿管吸取尿液10ml，操作时留意防止混入消毒剂（举荐用三步消毒法：75%酒精-2%碘酒-75%酒精脱碘待干）留意不能从收集袋中采集尿液三、血培育标本采集1、手清洁：无明显污染运用速干手消毒液进行手卫生2、血培育瓶口消毒：75%酒精消毒一遍，待干60s3、静脉穿刺消毒：举荐用三步法用75%酒精消毒采集部位用2%碘酒从穿刺点向外画圆消毒，至消毒区域直径达5cm以上，涂擦穿刺皮肤2遍，待干75%酒精脱碘：用75%酒精由内向外涂抹去碘酒液，待酒精挥发干燥后采血操作留意事项：从静脉采血，不建议从动脉采血用注射
5、器无菌穿刺取血后，勿换针头（假如行其次次穿刺，应换针头）干脆注入消毒后的血培育瓶血抽到培育瓶后，轻轻颠倒混匀以防血液凝固，马上送检，切勿冷藏！多次采血应在不同部位的血管穿刺以解除皮肤菌丛污染的可能。除非无法作静脉穿刺取血，否则不应从留置导管内取血。抽血前应将标签贴于血培育瓶颈上，标签内容包括病人基本信息、采血时间、采血部位。留意不要把标签贴在培育瓶条形码上，否则仪器无法识别。血培育次数和采血时间采血培育应当尽量在运用抗菌药物之前进行，在患者发热期间越早越好，以发热高峰前1h内或病人寒战和发热起先时采集为宜。在10分钟内与不同部位采集外周血23份培育（有助于推断是污染还是感染，提高检出阳性率）留
6、意报阳时间，阳性瓶数。在实行血培育后的2-5天内，不须要再重复实行血培育，因为进行治疗后的2-5天血液中的感染细菌不会立刻消逝。四、对可疑中心静脉导管相关血流感染1、保留导管2、外周静脉血一份，中心静脉导管血1分，不用弃去导管起始部分的血液。3、拔除导管：4、2个外周静脉血、导管尖端5cm(在进行中心静脉导管血和四周静脉血培育时应记录报阳时间）血管内导管尖段标本的采集、送检程序用75%酒精清洁导管四周皮肤无菌操作移动导管，剪取尖端末端5cm,干脆置入无菌试管内或干脆置入血平板内。马上送检（不超过15min),防止干燥如因怀疑CRBSI移除皮下埋置式静脉输液港，港内容物及导管尖端作定量培育。血培
7、育常见错误 培育瓶放冰箱 瓶橡胶塞上小盖未打开干脆穿刺 抽血后未刚好混匀血液凝固五、如何正确运输标本1、运输培育基温度应适当2、原则：保持细菌活力3、血培育、脑脊液标本：应刚好送检；不能刚好送检的标本应置温箱或室温中，切不能放入冰箱中保存（除病毒、霉菌、分支杆菌培育样本置4)4、痰、尿等标本：如不能刚好送检可置冰箱，以抑制细菌生长，但时间不能超过6h.六、各种标本储存的环境标本实行后应当马上送检，如不能马上送检，储存的环境要求：储存环境标原来源4冰箱-痰、尿液、粪便、活检组织、气枪冲洗物、导尿管、心包积液、脓和伤口分泌物等室温（25）-血液培育、脑脊液、泌尿生殖道、眼、耳、鼻、喉、血管导管尖、
8、体液、厌氧菌培育标本。美国的理念1970年以前，美国的医院定期对空气和环境表面（如地面、墙壁、台面）进行培育。到了1970年，CDC和美国医院协会（AHA）主见停止对环境的常规培育，因为医院感染发生率与空气或环境表面中总的微生物污染水平不相关。且环境表面或空气中微生物含量的允许水平也没有有意义的标准。1970-1975年，美国有25%的医院削减了这种常规的环境培育工作-一个已经持续的趋势。什么状况下要求进行环境采样四种状况下要求进行环境采样：一、是当环境中的宿主或媒介物被认为在疾病传播中有流行病学意义时，供应疾病或感染爆发的依据二、是在探讨过程中进行适当的环境采样三、是为了监测潜在的危急环境条
9、件，确认有害的化学或生物因素的存在，并验证危急因素的成功消退四、是为了质量保证（QA）而采样，以评估变更感染限制措施取得的效果或是确保设施或系统依据规范或预期结果执行。一、物体表面采样物体表面细菌总数的检测评价被污染程度主要依据消毒效果物体表面采样-涂抹法涂抹法：将5cm5cm的标准灭菌规格板，放在被检测物品表面，用浸有无菌生理盐水的棉拭子在规格板内来回匀整涂抹整个方格，并随之转动棉拭子，剪去手接触部分，将棉拭子放入盛有10ml生理盐水的试管中，充分振摇1min,作适量稀释后，接种于一般养分琼脂平板上进行计数，然后依据平板上菌落数得出物品表面每平方厘米的细菌数物体表面采样-斑贴法斑贴法：按无菌
10、操作方法将5cm5cm的无菌滤纸用灭菌生理盐水浸湿，匀整贴附与物体表面，1min取下放入盛有25ml灭菌生理盐水试管中，充分振摇1min，作适量稀释后，接种于一般养分琼脂平板上作菌落计数，同样得出物品表面每平方厘米的细菌数二、消毒物品表面的监测：1、采样时间：消毒处理后4小时内进行采样2、采样面积：被采面积100平方厘米，取全部表面；100平方厘米，取100平方厘米。3、采样方法：用5cm*5cm的标准灭菌规格板放在被检消毒物品表面，用含相应中和剂无菌洗脱液（5ml)的棉拭子在规格板内横竖来回匀整涂擦各5次并随之转动采样棉拭子，剪去手接触部位，将棉拭子投入王景洗脱液中，马上送检。小型物体表面的
11、结果计算用cfu/件表示。物表监测结果范围1、类、类环境：5cfu/cm22、类、类环境：10cfu/cm2GB15982-2012医院消毒卫生标准三、手消毒效果监测1、采样时间：在接触病人和从事医疗活动前进行采样或消毒后马上采样2、采样面积及方法（棉拭方法）被检人五指并拢，用含相应中和剂无菌洗脱液（5ml)的棉拭子在双手指手监测标准范围1、外科手消毒：5cfu/cm22、卫生手消毒：10cfu/cm2GB15982-2012医院消毒卫生标准4.2四、空气消毒效果监测1、采样时间段：在消毒处理后，操作前进行采样2、采样方法：按面积定数、打开、盖搭皿体边缘3、采样高度：距地面1.5米（80-15
12、0）4、布点方法：室内面积30，设内、中、外对角线三点;室内面积30设4角及中心5点均距墙壁1米5、收取方法：由外往里逐一收取，避开穿过培育皿从里往外收取1、监测时间：每季度一次3、类环境监、测标准：非干净手术部(室)、产房、重症监护病房，空气中的细菌菌落总数4CFU(15min直径9cm平皿)4、类环境、监测标准：儿科病房、母婴同室、妇产科检查室、人流室、治疗室、换药室、消毒供应中心、血液透析中心(室)、急诊室、化验室、各类一般病房、感染疾病科门诊及其病房，空气中的细菌菌落总数4CFU(5min直径9cm平皿)G B50333-2013G B50333-2013医院干医院干净净手手术术部建筑
13、技部建筑技术规术规范范3.0.2-23.0.2-2类环境：干净手术室、级：级手术区0.2cfu/30min.90皿周边区0.4cfu/30min.90皿（100级）6号手术间级手术区0.75cfu/30min.90皿周边区1.5cfu/30min.90皿级手术区2cfu/30min.90皿周边区4cfu/30min.90皿（10000级）5号手术间级6cfu/30min.90皿五、消毒液监测1、采样方法：用无菌注射器按无菌操作方法:10ml培育基吸取1ml被检消毒液；5ml培育基吸取0.5ml被检消毒液，加入培育剂中混匀。2、消毒液标准：运用中灭菌用消毒液：无菌生长运用中皮肤黏膜消毒液染菌量：
14、10cfuml其他运用中消毒液染菌量：100cfuml消毒液监测标准范围1、运用中灭菌剂：无菌生长2、运用中皮肤黏膜消毒液：10cfu/ml3、其他运用中消毒液：100cfu/ml六、紫外线强调监测方法1、日常记录：运用后进行消毒时间累积，运用超过1000小时的应加强监测或更换建立紫外线消毒运用登记本，每周用75%酒精擦拭灯管并记录2、照射强调：一般30W直管型紫外线灯，新灯管的辐照强度90Wcm2为合格符合GB19258要求;运用中紫外线灯照射强度70Wcm2为合格；3、强调监测：每半年一次监测前用75%酒精清洁灯管表面，开灯，待其稳定5分钟后，放置强度监测卡于灯管下垂直1米处，正面朝上，照
15、射1分钟，取卡，读数。4、留意事项：做好自身防护尤其是眼睛；检测卡要闭光保存。七、高度危急性医疗器械手术器械、穿刺针等：无菌生长GB15982-2012医院消毒卫生标准4.3不举荐医院常规开展灭菌物品的无菌检查八、中度危急性医疗器械：呼吸机管路、口表等：20cfu/件，不得检出致病性微生物每季度监测九、低度危急性医疗器械听诊器、血压计袖带等：20cfu/件，不得检出致病性微生物每季度监测十、消毒内镜胃镜、肠镜等：20cfu/件WS507-2016软式内镜清洗消毒技术规范7.3每季度监测十一、透析用水细菌：100cfu/ml每月监测内毒素：0.25EU/ml每季度监测YY0572-2015血液透
16、析及相关治疗用水4.1十二、透析液细菌：100cfu/ml每月监测内毒素：0.5EU/ml每季度监测YY0598-2015血液透析及相关治疗用水53.54每季度卫生学监测培育基统计表 十三、环境管理净化系统进行：每天干净手术室的净化系统应在术前30min开启，术后30min关闭。净化系统应连续运行至清洁消毒工作完成连台手术的最短自净时间要求：I级：15minII级：25minIII级：30minIV级：40min 环境管理压差限制干净手术室在手术中应保持正压装态，干净区对非干净区的静压差为10pa.高干净室对低干净室应保持正压不同时开启干净手术室（包括缓冲间）的两道门手术过程中，应保证门关闭：
17、以避开常见的开关门时空气流淌污染，通向外走廊的门，术中禁止打开，按专科相对固定手术间，全部物品应定位放置，削减进出手术间的次数清洁、无尘、无污染维持无关物品不得进入手术室，干净区的物品需经清洁消毒处理方可进入干净区物品如被服、床垫、清洁消毒工具等材质选择应遵循产尘少的原则手术室墙、地光滑、无裂隙手术用房各种物体表面在每日术前和术后湿式擦拭清洁、消毒；手术过程中严格限制血迹、体液污染扩散（医疗废物密闭收集和转运），一旦污染马上消毒和局部清理，接受覆盖消毒方法：蘸有消毒剂（不流淌为宜）的布类或多层纸巾覆盖污物，或接受蘸有消毒剂（不流淌为宜）的布类或纸巾由污染物外四周2米处擦抹，消毒时间30min后
18、，将布类或纸巾包袱污物丢弃不同区域及不同手术间清洁、消毒工具分开运用医院空气净化管理规范空气干净技术维护与保养要求空气处理机组、新风机组应定期检查，保持清洁。新风机组粗效滤网宜每2天清洁一次；粗效过滤器宜1月2月更换1次；中效过滤器宜每周检查，3个月更换1次；亚高过滤器宜每年更换。发觉污染和堵塞刚好更换末端高效过滤器宜每年检查一次，当阻力超过设计初阻力160pa或已经运用3年以上时宜更换排风机组中的中效过滤器宜每年更换，发觉污染和堵塞刚好更换定期检查回风口过滤网，宜每周清洁一次，每年更换一次，如遇特殊污染，刚好更换，并用消毒剂擦拭回风口内表面设特地维护管理人员，遵循设备的运用说明进行维护保养；
19、并制定运行手册，有检查和记录做好洁污限制无菌手术与污染手术必需分室，假如不得不同室进行，应先行无菌术，后做污染手术接台手术人员在2台之间需严格进行洗手，消毒手臂及更换无菌手术衣、手套两台手术之间，应尽量做好环境净化和药液湿式消毒，包括湿式地面落实责任制各手术间定人负责，物品等进入干净手术室前，必需拆除外装，设备应安装完毕，擦拭干净方可进入。手术人员隔离鞋每日用消毒液浸泡消毒1次每月对室内空气、物体表面、手术人员的手进行细菌培育，以检测净化效果，并分析不合格缘由，制定有效整改措施基础环节质量管理外科手消毒是限制感染的有效措施术中严格遵守无菌操作原则骨科手术后不应在干净区打石膏，以避开石膏粉尘污染室内空气，引发院内感染事务或须要运用高成本的高分子石膏如须要打石膏者要求术后将病人移到清洁区的麻醉复原室进行