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1、动物营养学报2008,20(4):388-396 Chinese Journal of Animal Nutrition营养水平对妊娠早期母猪胚胎存活和瘦素、孕酮分泌及基因表达影响郑爱荣1吴德徐盛玉1刘忠臣张果1张明2(1.四川农业大学动物营养研究所，雅安625014,2.四川农业大学动物科技学院，雅安625014)摘K:本试验选用63头长白-大白杂交初产母猪，研究营养水平对初产母猪妊娠早期胚胎存活和瘦素(leptin)、 孕酮分泌及胚胎瘦素、瘦素受体(Ob-R),信号传导和转录活化因子-3(STAT-3)、孕飼受体(PGR)、DNA甲基化转 移SS-l(DNMT-l)基因表达的影响。将配种后
2、的母猪随机分到高、中、低3个营养水平组按2倍、1. 2倍和0.6倍维 持需要(分别记为2. 0M.1. 2M和0. 6M)供给饲粮，妊娠12,25和35 d屠宰母猪收集血清和胚胎，用ELISA方法测 定血清中痩素、孕酮水平，用RT-PCR方法研究目的基因在胚胎中的表达差异。结果表明：胚胎存活率，妊娠 12、25和35 d时,1.2M组均显著高于2. 0M组(P 0.05),而妊娠25,35 d高于0. 6M组(P0.05):血清瘦素水平，妊娠12 d时,2.0M组显著高于1.2M组(PC 0. 05),极显著高于0.6M组(P0. 01),妊娠25和35 d时,2. 0M组极显著高于1. 2M
3、和0. 6M组(P0.01)； 1.2M组极显著高于0.6M组(P0.01)0血清孕酮水平，妊娠12,25和35 d时,2. 0M组极显著低于1. 2M组和 0.6M组(P0.05)；营养水平对胚胎存活重要基因表达的影 响,leptin和Ob-R基因mRNA的相对表达量在妊娠12,25和35 d时，2.0M组显著高于1.2M和0. 6M组 (P0. 05).妊娠12和25 d时,2.0M组胚胎STAT-3基因的相对表 达极显著高于0.6M组(P0. 01)；妊娠35 d时,2. 0M和1.2M组极显著高于0. 6M组(P0.01).妊娠12,25和 35 d时,2.0M组胚胎DNMT-1的相对
4、表达显著高于0. 6M组(P0.05)，妊娠25 d时,0.6M组极显著高于2.0M组(P0.01),显著高于L 2M组(P0.05)，妊娠 35 d时,1. 2M组极显著高于2. 0M和0.6M组(P0.01) ,0.6M组显著高于2. 0M组(PR、 STAT3、PGR、DNMT-1基因表达变化，降低胚胎存活率.关键词：营养水平;初产母猪;胚胎存活;瘦素;基因表达胚胎损失高峰期发生在母猪妊娠早期，营养 调控是降低早期胚胎死亡的重要途径之一口辺。因 而,妊娠前期的主要营养目的是实现顺利着床、成功 妊娠，提高早期胚胎的存活率。影响胚胎存活的因 素较多，研究发现瘦素(leptin )和/或其受体
5、(obesity receptor, Ob-R)在人和动物的卵母细胞、附植 前胚胎“句、子宫内膜团和胎盘组织等多种组织均 有表达，二者可调节早期胚胎发育并且在胚胎着床 和维持妊娠方面有重要作用。孕酮及其受体(progesterone receptor, PGR)在促进子宫发育、改变子 宫分泌液成分、妊娠识别、妊娠维持等方面有重要作 用。Leptin发挥信号传导作用主要与信号传导和 转录活化因子-3(signal transducer and activator of transcription-3, STAT-3)有关，STAT-3 参与胚 胎发育调控，对胚胎发育是必需的。DNA甲基转 移酶-
6、1 基因(DNA methyltransferase-1, DNMT-1) 编码的DNA甲基转移酶-1对于维持正确的基因印 迹和胚胎发育发挥着重要的作用，胚胎发育阶段 DNMT-1基因的断裂将会导致早期胚胎的死亡Jindal等価研究表明，1.5倍维持需要的低 营养水平饲喂妊娠母猪较2倍维持需要营养水平显 著提高妊娠早期胚胎的存活率，说明低营养水平有 利于胚胎存活，然而营养水平是否越低越好以及限 饲对胚胎存活产生的影响还需要进一步的研究。因收糖日期：2008-01-18基金项目：国家自然科学基金资助项目(30471257)四川省教委应用基础研究资助项目(2004A009)作者简介:郑爱荣(197
7、9-),女，河南上蔡人，硕士，主要从事动物营养与饲料科学研究.E-maUiairong_79yahoo. *通讯作者:吴德，博士，教授，博士生导fit .E-mail： pig2pigsina. com4期郑爱荣等:营养水平对妊娠早期母猪胚胎存活和痩素、孕酮分泌及基因表达影响395而本研究设计3个营养水平即2倍、1. 2倍和0. 6 倍(限饲)维持需要(2. 0M、L 2M和0. 6M),考察不 同营养水平对血清瘦素和孕酮分泌影响，并在此基 础上进一步开展营养水平对与胚胎存活密切相关基 因的表达的研究,探讨营养水平、激素及基因三者的 关系，为营养与繁殖的基础研究提供理论依据。1材料与方法1.1
8、试验设计母猪妊娠早期釆用高、中、低3个营养水平，即 通过维持需要的2倍、1. 2倍、0. 6倍确定母猪的不 同营养水平。维持需要的采食量由每天维持需要的 消化能与每千克饲粮消化能含量之比确定。维持需 要的消化能计算公式为:DE = 0.46 MJX BW0 75，其 中BW=配种时体重+ 1/2妊娠预期增重，妊娠期预 期增重为45 kg。试验母猪采用同种饲粮，按NRC (1998)母猪营养需要配制，所配制饲粮消化能为 13. 4 MJ/kg,粗蛋白质为13.1%.配方见表1.1.2试验动物及处理试验选取血源相同、日龄和体重相近的长白-大 白二元杂交初产母猪63头。配种前所有母猪饲喂同 一饲粮，
9、供给量为2倍维持需要。母猪第3个情期的 “静立反射”开始后12和24 h由同一操作熟练的技 术人员实施人工授精2次，精液来源一致。配种后第 1天开始，试验猪按体重随机分到3个营养水平组 中，每组21头母猪。不同营养水平组母猪分别在妊 娠后12、25和35d屠宰。13饲养管理母猪进舍前猪舍彻底清洗、消毒。试验期内每日 分别在08:00 44:00饲喂母猪2次，自由饮水。准确 称量记录每夭每头母猪的采食量。保持舍内清洁卫 生，每周消毒1次。14测定指标及方法1.4.1血样收集及激素水平测定分别在母猪妊娠12,25和35 d时，早08：00 经母猪前腔静脉取血10 mL,离心后取血清 -20t保存待
10、测。血清中激素水平的测定用酶联 免疫吸附测定法(enzyme-linked immuneosorbent assay, ELISA)，采用试剂盒(Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI； Leptin EIA Kit,Cayman-500600 t Progesterone EIA Kit, Cayman- 582601) 在酶联免疫测定仪(Thermo Electron Corporation) 进行。表1试验饲粮组成及营养成分(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels ofexperimental die
11、ts(air-dry basis9 %)项目Items含量 Content原料 Ingredients玉米Corn70.00豆粕 Soybean meal11.20麦赧 Wheat bran14.40鱼粉 Fish meal1.60磷酸氢钙CaHPO,1.10碳酸钙CaCOa0.16食盐NaCl0.40胆碱 Chline chloride0.10维生素预混料Vitamin premix。0.04矿物质预混料Mineral premix251. 00合计Total100.00营养成分 Nutrient levels消化能DE(MJ/kg)13. 40粗蛋白质CP13.10赖氨酸Lys0.60蛋氨
12、酸Met0.20钙Ca0. 75磷P0.60有效磷AP0.37粗纤维CF3.30维生素预混料可为每千克全价料提供Vitamin premix provides for per kilogram of diet： VA 4 000 IU; VD3 200 IU, VE 44 IU； VK 0.000 5 mg； VB, 1 mg； VBz 3.75 mg； VB12 0. 015 mg；烟酸 nicotinic 10 mg；泛酸 pan- tothen 12 mg；叶酸 folic acid 1.3 mg.”矿物质预混料可为每千克全价料提供Mineral premix provides for
13、per kilogram of diet： Fe 80 mg； Cu 5 mg； Zn 50 mg； Mn 20 mg Se 0.15 mg, 10.14 mg.1.4.2繁殖性能指标测定前腔静脉采血后屠宰母猪，取出卵巢、子宫，记录 黄体数、胚胎数，计算胚胎存活率。计数结束将胚胎 在液氮中速冻后转移至-80C保存,待提取总RNA. 1.4.3总RNA的提取和cDNA的合成-80C保存的胚胎按试剂盒(Trizol Reagent, Invitrogen)操作说明进行总RNA的提取。用无 RNase的DNase I处理,消除总RNA中痕量DNA 的污染，用琼脂糖凝胶电泳检査RNA的完整性，核 酸蛋
14、白检测仪(Beckman DU-800, USA)检测 RNA的水平和纯度。采用10 ML反转录反应体系： 5 x Prime script Buffer 2 ML, Prime script RT Enzyme Mix I 0.5 PL, Oligo dT Primer (50 Mmol/L) 0.5 ML, Random 6 mers(100 Mmol/L) 0. 5 VLIbtal RNA 4 L,RNase Free dH2O 2.5 ML 反转录反应参数：37C、15 min,85C、5s。反应结 束后立即进行PCR反应或-20C保存备用。1.4.4 Real time PCR 反应
15、实时荧光定量PCR采用25 ML的反应体系： TaKaRa SYBR Premix Ex Taq （2 x ）, 12. 5 ML； 上、下游引物各（10 Mmol/L）,0.5 ML；cDNA模板， 2 L；ddH2O,9.5 ML0 荧光定量 PCR 仪为 iQ5TM 荧光定量 PCR 仪（Bio-Rad,Inc,USA） 0 利用 NC- BI在线资源、Primer5与Oligo6.0进行引物设计， 由TaKaRa公司合成,引物序列见表2。反应程序： 95C预变性1 min；95C变性5 s；不同目的基因釆用 不同温度退火30 s；72*C,30 s；共40个循环。应用 巢式PCR检测l
16、eptin基因在胚胎中的表达，反转录 和PCR的操作如前所述,第二轮PCR使用巢式引 物（表2）。融解曲线用于确定扩增产物的特异性, 融解曲线反应程序：95C ,0 s；50C,30 s；95C,0 s （温度变化速率为0.5C/s）。H2A为管家基因，因 RA基因表达稳定可以用作内标对不同样品进行 半定量分析。每个样品至少重复3次。衰 2 Leptin、OIR、STAT-3、PGR、DNMT-l 和 H2A 的巢式 PCR.PCR 的引物序列Table 2 Primers used for PCR and nested PCR for detection of leptin, Ob-R, S
17、TAT-3, PGR, DNMT-1 and H2A目的基因Genes引物序列Primer sequences(5x-3z)扩增片断大小Size of amplified fragment(bp)基因库编号 Genbank accession numberLeptin( round 1)F： TTGGCCCTATCTGTCCTACGR： GAGGTTCTCCAGGTCATTCG277AF102856Leptin(round 2)F： CAAGACGATTGTCACCAGGAR： TTGGATCACATTTCTGGAAGG184AF102856Ob-RF： CTCTTGCCTGCTGGAGGAA
18、CTTCR： TTCCAGTTTGCACCTGTTTG250AF092422STAT-3F： CCCGTACCTGAAGACCAAGTR； GGTTCAGCAGCTTCACCATT129AW652539PGRF： ATGAAAGCAAGCCCTAAGCR： GGCAGTGACTTAGACCACTTGAC180CDD922DNMT-1F； AGGTGAGGACATGCAGCTTTR： AACTTGTTGTCCTCCGTTGG213BF198895h2aF： GTGGCAAACAAGGAGGAAAGR： ATGCGGGTCTTCTTGTTGTC226BP45963315数据处理与分析胚胎存活率为存
19、活胚胎占黄体总数的百分 比。目的基因的相对表达量用值方法计 算啊，血清瘦素水平及目的基因相对表达量用 SPSS 11.0统计软件进行方差分析和多重比较。试 验结果用平均值土标准差表示。2结果与分析2.1营养水平对胚胎存活率的影响由表3可知，妊娠12 d时,1.2M组胚胎存活率 显著高于2.0M组（P0.05）；妊娠25和35 d时,1.2M 组胚胎存活率显著高于2.0M和0.6M组（PV 0. 05） ,2. 0M和0. 6M组间差异不显著（P0. 05）。2.2营养水平对血滑瘦素、孕嗣水平的影响由表4可知，母猪妊娠12 d时，血清leptin水 平2. 0M组显著高于1. 2M组（PV0.
20、05）、极显著高 于 0. 6M 组（PV0. 01）；妊娠 25 和 35 d 时,2. 0M 组 极显著高于1. 2M和0. 6M组（PV0. 01）,且1. 2M 组极显著高于0. 6M组（PV0.01）。母猪妊娠12、 25和35 d时，血清孕酮水平2.0M组极显著低于 1.2M 组（PV0.01）和 0. 6M 组（PV0. 0D.1.2M 组和0. 6M组之间差异不显著（P0. 05）。营养水平对胚胎存活率的影响Table 3 Effects of feed intake levels on embryo survival rate项目Items妊娠时间Days of pregna
21、ncy (d)高营养水平High nutrition level(2M)中营养水平Medium nutrition level(1.2M)低营养水平Low nutrition level(0. 6M)12554妊娠母猪数25565The number of pregnant sow(n)35655胚胎存活率1270.11 + 10. 89b84.34 3. 9(?74. 53 士 5.6511*2565.20 11.531180.23 9. 92*62.38 9.85bLivability of embryo( % )3562.76 6. 34b78.45 10.10*62. 31 士 9.
22、62b同一时间点大写字母不同表示差异极显著(P0. 01),小写字母不同表示差异显著(P0. 05)o下表(图)同。Values with different small letter in the same time indicate significant difference (P0. 05), with different capital letter indicate extremely significant difference (P0.01). The same as below.表4营养水平对血清中瘦素、孕剖水平的影响Table 4 Effects of feed intak
23、e levels on leptin and progesterone concentration in serum (ng/mL)项目Items妊娠时间 Days of pregnancy (d)高营养水平High nutrition level(2M)中营养水平Medium nutrition level(1.2M)低营养水平Low nutrition level(0.6M)122.54 0.54*1.790.49*1.030.05BLeptin253.08 + 0.43A2.340.35B1.28 + 0.12c353.69 + 0.17*2.99 + 0.30B1.88 + 0.54c
24、123.120.42B3.920.14A4.070.10AProgesterone253.470.31B4.070.36A4.220.21A353.45 0.2妒4.01 + 0.18A4.06 + 0.20A妊娠时间 Days of pregnancy(d)6-4-2-86-4-2o11 11 1i n -u o o Auvsvwqo jo uojssaidxo OBP噸我飛茂黑宅-90 2M25妊娠时间Days of pregnancy(d)352.3实时荧光定BPCR法检测营养水平对与胚胎 存活密切相关的基因表达的影响2.3.1营养水平对leptin基因表达的影响由图1可知，采用实时荧光
25、定量PCR法测定胚 胎中leptin基因的相对表达量,在妊娠12 d和25 d 时,2.0M组极显著高于1.2M和0.6M组(PV 0.01)；妊娠35 d时,2. 0M组显著高于1.2M组 (PV0. 05),极显著高于 0. 6M 组(PV0. 01)。图1 Leptin S因的相对表达ItFig. 1 Relative expression of leptin gene2.3.2营养水平对Ob-R基因表达的影响由图2可知,Ob-R基因的相对表达量在妊娠12 和 35 d,2. 0M 组显著高于 0.6M 组(P0. 05)； 妊娠25 d,2. 0M组显著高于1.2M组(P0. 05),
26、 极显著高于0.6M组(P0.01)。图2 Ob-R因的相对表达fltFig. 2 Relative expression of Ob-R gene2.3.3营养水平对STAT-3基因表达的影响 由图3可知，STAT-3基因的相对表达量在妊娠12 d时,2. 0M组极显著高于1.2M和0. 6M组 (P0.01), 1.2M 组显著高于 0.6M 组(P V0. 05)；妊娠25 d时,2.0M组极显著高于0. 6M组 (PV0. 01),同时1.2M组显著高于0.6M组(PV0. 05)；妊娠35 d时,2.0M和1.2M组极显著高于妊娠时间Days of pregnancy(d)-42-8
27、-6-4-2oL L L0000EJLVS Jo ussJdx0. 6M 组(PV0. 01)。娠25 d时,2.0M组显著高于1. 2M组(PV0.05), 2. 0M和1. 2M组极显著高于0. 6M组(P0. 05)；妊 娠25 d时,0. 6M组孕酮受体表达量极显著高于 2.0M 组(PV0.01),显著高于 1.2M 组(P0. 05)；妊娠 35 d时,1.2M组极显著高于2.0M和0.6M组(P 0.01) ,0.6M 组显著高于 2.0M 组(FV0.05).妊娠时间Days of pregnancy(d)B&Mud=UCHSSaldx0MH1303M5I 槛s.粟gHedS4
28、 PGR基因mRNA的相对表达Fig.4 Relative expression of PGR gene2.3.5营养水平对DNMT-1基因表达的影响 由图5可知,DNMT-1基因的相对表达量在妊娠12 d时,2.0M组极显著高于0.6M组(PV0.01)；妊3讨论本研究表明I- 2倍维持需要显著提高了妊娠早 期胚胎的存活率，配种后母猪2. 0倍维持需要降低 了胚胎存活率，而母猪发情配种后立即降低营养水 平对胚胎存活有利，但严重限饲同样会降低早期胚 胎的存活率。研究表明配种后给青年母猪分别饲喂 1.5倍维持需要和2.0倍维持需要饲粮，妊娠第5 天的胚胎存活率差异显著(86. 5% vs. 74
29、.2%,PV 0.05),妊娠第12天的胚胎存活率也存在不同 (80. 5% vs. 71.8%,P = 0.14)m。而配种后 15 天 给青年母猪分别饲喂1. 5倍维持需要和2. 0倍维持 需要饲粮，妊娠第28天的胚胎存活率分别为 85.93%和 66. 96%(P0. 05)12.以上研究说明 配种后营养水平过高会降低初产母猪早期胚胎存活 率。目前有关低营养水平对猪胚胎存活率影响的报 道不多，而在羊上的研究表明，营养水平过低不利于 胚胎的发育好成。近年来的研究发现，妊娠动物的营养水平显著 影响血清瘦素含量C16-18.本研究也发现妊娠早期各 阶段(12.25和35 d),血清瘦素水平显著
30、受营养水 平的影响，且与母猪营养水平呈显著正相关(PV 0.05).瘦素可调节胚胎植入前的发育及宫腔的准 备并对早期胚胎发育、着床过程和维持妊娠有重要 作用幻。Barroso等制的研究发现，高leptin水 平导致子宫内膜容受性下降，从而着床率降低;而低 营养水平(表现为低leptin水平)则不足以促使母体 分泌足够的雌二醇以维持生育和为着床准备子宫内 膜，同样导致子宫内膜容受性下降,从而着床率降 低。与此类似,本研究表现为1.2M组的胚胎存活 率高于其他两组。肝脏是孕酮代谢的主要器官，流入肝中的血流 量增加以及肝脏中相关氧化酶活性的增强都会导致 孕酮清除率增加。高营养水平提高血液孕酮清除 率
31、，从而降低血液孕酮水平t24-25本研究中随着营 养水平的升高孕酮水平逐渐下降。妊娠早期血浆孕 酮水平可以调节输卵管。句和子宫内膜叮的发育，影 响子宫分泌蛋白的分泌。子宫分泌蛋白可为胚胎发 育提供必需的营养物质,参与胚胎的妊娠识别，为胚 胎提供免疫保护，可刺激胚胎雌激素的分泌，从而影 响胚胎存活率。孕酮的合成变化可导致胚胎和子宫 发育的不同步句而降低胚胎的存活率。Ashworth 等财和Jindal等明证实，在妊娠早期给初产母猪 注射孕酮，能够抵消高营养水平引起的胚胎损失。 本研究结果表明：1.2倍维持需要和2.0倍维持需 要的血清孕酮水平与胚胎存活率呈正相关。由此可 推断，营养水平对胚胎存活
32、的影响可能是孕酮调控 子宫机能变化引起的。胚胎的发育需要许多基因在时间和空间上的准 确表达，这些基因的作用是胚胎存活所必需的。如， 在胚胎发育早期STAT-3和DNMT-1基因的断裂 将导致胚胎的死亡3诃。胚胎存活能力低下将会表 现为基因的表达差异。在鼠上的研究已证实JAK/STAT途径可由 leptin激活，而leptin必须与其受体Ob-R结合 后才能发挥作用。本研究中,leptin,Ob-R基因在 胚胎中的表达随着母体营养水平的升高显著极显著 提高，这与Guay等,Thomas等、Ekert等的 研究结果一致。本研究中各营养水平组胚胎 STAT-3 mRNA的表达差异显著，且随营养水平的
33、 升高而呈现上升趋势，与leptin和Ob-R的表达一 致,进一步证实了 leptin作用的主要途径通过JAK- STAT实现。STAT-3是细胞因子信号转录中的重要细胞质 转录因子,STAT-3的活性是使与特定STAT-3识 别位点的基因转录活化入与STAT家族的其他 成员不同，切除STAT-3将导致小鼠胚胎的死亡，说 明STAT-3在胚胎的发育中发挥着关键性的作用， 是胚胎发育所必需的途径本研究中2.0M、 1. 2M组STAT-3的表达较0. 6M组高,STAT-3调 节胚胎存活的功能可能是其诱导了抗凋亡基因Bcl-2 和Bcl-X的表达。胚胎中STAT-3表达的上调 可能对胚胎的存活起
34、到了保护作用，因而本研究中 0. 6M组（STAT-3表达水平低）的胚胎存活率表现 为较其他两组低。尽管STAT-3上调可能促进胚胎 的存活，但其他基因的表达变化可能影响了 2. 0M 组的胚胎存活情况，本研究中L2M组的胚胎存活 率表现为最高。PGR属于核受体,是类固醇和甲状腺激素受体 超家族（受体超家族 receptor superfamily）的一 员，是受孕酮调节的一种转录因子囹与DNA特定 序列结合调控下游基因表达。本研究中，不同营养 水平在不同妊娠时间点对胚胎PGR的影响不同。 孕酮在胚胎着床，维持妊娠方面发挥着重要作用，但 孕酮对胚胎是直接作用还是间接作用一直存在争 议。本研究发
35、现PGR的表达量在妊娠12.25和35 d 时随着妊娠时间的增加表达量增加。Ying等研 究表明,PGR mRNA在猪胚胎2细胞期有发现,4 细胞期开始下降，至8细胞期，桑甚胚和胚泡期消 失。但Hou等眺报道，胚泡期检测到鼠胚孕酮受 体mRNA的表达，且其后一直都有表达。本试验 在着床开始时检测到孕酮受体的表达，妊娠25和 35 d时也有表达，这与Hou等人的试验结果一致， 说明孕酮除改变子宫内环境外还可直接作用于胚胎 而影响其存活。DNA的甲基化模式是通过两种DNA甲基化 转移酶（DNMT）来建立和维持。DNMT-1敲除将 导致整个基因组的低甲基化致使印记基因单等位基 因表达丢失，最终导致妊
36、娠中期的胚胎死亡在 维持和甲基化重新开始的过程中DNMT-1的过度 表达与DNA的甲基化错误相关联，并且这种错误 的甲基化将会直接传递给子代细胞讲，进而影响胚 胎的存活。有研究发现体外培养的胚胎较体内胚胎 表达更多的DNMT-1,但胚胎存活率却更低。本 研究发现，母体营养水平显著影响胚胎中DNMT-1 mRNA的表达状况，随着营养水平的升高,DNMT-1 的表达水平也逐渐升高，并达到显著甚至极显著的 水平。2.0M、0.6M组胚胎存活率较1.2M组均较 低，说明1.2M组有利于DNMT-1的适宜表达进而 有利于胚胎的存活。4结论妊娠早期母猪的营养水平显著影响胚胎存活 率，妊娠35 d以内给予母
37、猪1. 2倍的维持需要的营 养水平有利于胚胎的存活，而高营养水平和严重限 饲均会导致早期胚胎存活率降低。营养水平显著影 响母猪血清瘦素和孕闱水平，瘦素和孕酮过高或过 低的分泌均对早期胚胎存活不利。营养水平显著影 响早期胚胎中 leptin,Ob-R,STAT-3,PGR 和 DN-MT-1基因的表达水平，影响胚胎存活。参考文献：C 1 Novak S, Almeida F R C L, Cosgrove J R, Dixon W T, Foxcroft G R. Effect of pre- and postmating nutritional manipulation on plasma p
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