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1、RNA干扰技术在肿瘤基因治疗中的应用进展摘要 RNA 干扰(RNA interference ,RNAi) 是指由双链RNA (double-strand RNA , dsRNA) 引发的转录后基因沉默机制(posttranscriptional gene silencing ,PTGS) ,具有序列特异性和高效性,RNAi 作为一门新的基因阻断技术,是一种有广阔应用前景的抗肿瘤基因治疗方法,近年来受到人们的广泛关注。本文将RNAi 作用机制及其在肿瘤治疗中的研究进展作一综述。关键词 RNA干扰；基因治疗；肿瘤RNA 干扰(RNA interference ,RNAi) 技术,也称为基因沉寂疗
2、法( Gene Silencing) , 是利用双链RNA ( double-st randedRNA , dsRNA) 诱发对宿主细胞特异性RNA 转录的抑制,从而抑制特异目的基因表达的方法。也即双链RNA 在细胞内RNA 酶的作用下,被裂解成2123 个核苷酸( nucleotide ,nt) 的小干扰性RNA ( small interference RNA , siRNA) ,进而启动细胞内RNAi 反应,特异性地阻断靶基因表达的过程。此技术在功能基因组研究和抗肿瘤、抗病毒治疗方面得到了广泛应用。本文综述RNAi 技术及其在肿瘤基因治疗方面的研究进展。1 RNAi 现象的发现早在199
3、5 年Guo 和Kemphues 在用反义RNA 研究华丽新小杆线虫(C. elegans ) par1 基因功能时,意外地发现了反义和有义RNA 混合物能更显著地抑制特定基因的功能 1 。1998 年Fire 对此进行了深入研究,他将针对特定基因的双链RNA(dsRNA) 注射入华丽新小杆线虫,同样抑制了特定基因产物的表达,而且针对靶基因的dsRNA 可产生较反义RNA更强的基因阻抑效应。由于这是一种在RNA 水平的基因表达抑制,因而Fire 将此现象命名为RNA 干扰(RNA interference , RNAi) 2 。随后在许多生物中相继发现存在RNAi 现象,如果蝇( drosop
4、hila) 、线虫( caenorhabditis elegans) 、锥虫(trypanosomes) 等 3 。直到最近人们才发现在植物中被称为共抑制(cosuppression) ,真菌中被称为抑制(Quelling) 的现象与动物中RNA 干扰( RNAi) 具有很大的相似性,都与转录后基因沉默现象(post-transcriptional gene silencing , PTGS) 有关 4 。PTGS 是生物在长期进化过程中产生的抗病毒感染、保持基因组中转座子和其它可转移核酸稳定性的防御系统,并在某些生物生殖细胞的发育过程中起重要作用。研究发现从低等生物到高等生物中都存在RNAi
5、 现象,提示RNAi 可能是一种进化上保守的基因组水平的免疫监控机制 5 。2 RNAi的作用机制自RNAi 现象发现以来,许多研究者对其作用机制进行了大量研究,现在普遍认为其可能机制为: (1) 启动阶段:长dsRNA 进入细胞被切割成2123 个核苷酸组成的片断,即小干涉片断( siRNA) 。切割细胞内双链RNA 的酶是一种被称为Dicer 的核酸内切酶,Dicer 酶是RNase 家族成员之一,带有2个催化结构域、1 个螺旋结构域和1 个PAZ 结构域,外源dsRNA 被Rde-1 编码蛋白识别后与Dicer 结合形成Dicer-dsRNA复合物,Dicer 酶的RNase 活性作用将
6、长双链RNA 变成siRNA 从而引发RNA 干扰的能力 6 ,7 ,Dicer 酶在RNAi 的调控途径中起着关键作用。(2) 效应阶段: siRNA 形成后与RNAi特异性酶Ago-2 等结合,形成RNA 诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex , RISC) , RISC 经ATP 酶激活后,与之结合的双链siRNA 开始变性并解旋、解链,在siRNA 指导下序列特异性降解与siRNA 同源的靶mRNA , 达到阻止靶基因表达,使基因沉默的目的 8 。(3) 扩增阶段:在研究中人们发现小剂量的dsRNA 分子就足以引起整个机体同源基因表达的抑制,而且
7、能够将基因沉默的信息传递给下一代。这种作用被认为是在一种RNA 介导的RNA 聚合酶( RNA-directed RNA polymerase , RdRP) 的作用下,以siRNA 中的一条链为引物,靶mRNA 为模板合成dsRNA 的聚合酶链式反应 9,10 ,后者又被降解形成新的siRNA 重新进入上述循环,使干扰信号放大,从而引发强大的RNA 干扰作用。进一步的研究发现RdRP 有3 个同源体,其中,RrpA 是RNAi 所必须的酶,dsRNase 作用下产生的小量siRNA 作为RrpA 扩增引物,以靶mRNA 为模板合成dsRNA ,后者再被dsRNase 降解为siRNA而进入新
8、的扩增循环使RNAi 效应放大 11 。3 RNAi 作用的特点3.1 高序列特异性 12 RNAi 是转录后水平的基因沉默机制, 有高度的序列特异性, 19 nt 的dsRNA几乎可以完全抑制基因的表达, 而将其中的1 nt 突变掉后, 它对基因的抑制作用就消失了 13 , 这种高度的序列特异性能够使dsRNA 能够非常特异地诱导与之序列同源的mRNA 降解, 避免降解与目的mRNA同家族的其他mRNA, 从而实现对目的基因的精确沉默 14 。因此, RNAi 具有重大的医学价值。3.2 高效性 14 RNAi 存在级联放大效应 12, 15 , 由于Dicer 酶切产生的siRNA 与同源
9、mRNA 的结合并降解后者, 产生新的siRNA; 新产生的siRNA 可再次与Dicer 酶形成RISC 复合体, 介导新一轮的同源mRNA 降解的多次利用, 如此循环, 使相对很少量的dsRNA 分子( 数量远远少于内源mRNA 的数量)就能产生强烈的RNAi 效应( 每个细胞仅需几分子siRNA 就可产生RNAi 效应) , 并可达到缺失突变体表型的程度。相比普通的siRNA, 具有短发卡结构的双链RNA ( short hairpin RNA, shRNA ) 产生的RNAi 效应更强 16 。3.3 RNAi 抑制作用迅速RNAi 基因的表达发生在转录后, 通过细胞质中同源mRNA
10、的快速降解,最终使该基因缺少mRNA 而无法产生蛋白质产物 14 。3.4 对于哺乳动物, 目前大多数研究者认为RNAi的有效效应分子是长度为21 23 bp 的siRNA, 大于30 bp 的dsRNA 会引发宿主非特异性的反应, 使哺乳动物细胞蛋白质合成受到广泛抑制, 引起非特异性的细胞凋亡 14 。3.5 RNAi 作用的靶基因位点有选择性外源性dsRNA 的转入只对成熟mRNA 的产生作用, 对mRNA 前体没有或很少具有影响, 以内含子或启动子序列构成的外源dsRNA 无法引起RNAi 效应 14 。4 RNAi在肿瘤治疗中的应用 Kaiyi 等 17 用siRNA 抑制肝癌细胞中细
11、胞周期素E 的表达,效果非常令人满意,抑制率高达90 %。同时,他们还发现用该种方式阻断细胞周期素E 的表达可以增加肝癌细胞的凋亡和阻止肝癌细胞的增生。而且,在裸鼠体内,siRNA 可通过阻断细胞周期素E 的表达而抑制肝细胞性肝癌的生长。这些研究结果表明,RNAi 通过靶向干预癌基因的过度表达,可达到对肝细胞性肝癌的治疗目的。同时也提示细胞周期素E2这一在70 %的肝细胞性肝癌中均会呈现过度表达的基因,可以作为肝细胞性肝癌RNAi 治疗的一个靶点。2连接素和APC 基因是在细胞增生控制中起重要作用的Wnt 信号通路的关键成员,这些基因的突变会改变细胞的增生程度及与结肠癌相关的2连接素蛋白水平
12、18 。最近,RNAi 已成功用于特异性降低哺乳动物细胞这些基因的表达。一项用siRNA 靶向作用于连接素,以确定RNAi 能否改变由于2连接素或APC 突变所致的结肠癌细胞中的相应蛋白表达水平的研究结果显示:靶向siRNA 不仅可直接抑制2连接素蛋白的产生,而且可明显降低连接素依赖性基因的表达,同时也可抑制癌细胞增生16 。比较RNAi 与反义核酸技术抑制2连接素依赖性基因表达的效应作用结果表明,RNAi 具有相对的高效性。siRNA 可直接作用于2连接素的多个区域及大多数其它蛋白,近一半的siRNA 可以引起蛋白水平的表达减少80 %90 % ,而且, 在结肠癌中, 要明显减少2连接素水平
13、, 需要2mol/ L 浓度的寡核苷酸,而引起同样的抑制效应,则仅需要20nmol/ L 的siRNA。这些结果提示siRNA 靶向作用于恶性肿瘤中表达改变的基因,对于肿瘤的基因治疗具有潜在的优势 18 。研究证实,在人乳腺癌细胞MDA2MB2231 中,CXCR4 的表达呈显著性增加。乳腺癌细胞中高表达的CXCR4 和其配体CXCL12 在器官中表达的峰浓度代表着乳腺癌转移的程度,这表明CXCR4 及其配体在乳腺癌的器官特异性转移中有着重要作用。通过RNAi 技术抑制内源性CXCR4 基因的表达明显破坏了在体外具有高度侵袭性的乳腺癌细胞MDA2MB2231 的侵袭力。而达到抗肿瘤转移的目的
14、20 。Ellen 21 研究发现, 用siRNA 靶向作用于在人类大多肿瘤中均明显过度表达的FASE(fatty acid synthase ,FASE) 基因,能使人前列腺癌细胞株LNCap(lymph node carcinomaof the prostate) 中FASE 基因的表达和活性降低4 倍。而且单一转染的siRNA 即能使FASE 下调的效应维持4 天,FASE 基因被干扰后,人前列腺细胞株LNCap 形态会发生较大的改变:细胞变小,细胞间联系差,呈现出多重纺锤体样延伸。RNAi 对FASE 表达的抑制明显抑制了LNCap 细胞的生长最终引起肿瘤细胞的凋亡。最近又发现 22
15、,在前列腺癌的发生发展进程中促进细胞增生、保护细胞免受凋亡的stat3 亦可作为RNAi 的靶基因。实验中,用RNAi 技术封闭stat3 的表达活化及其对前列腺癌细胞的效应,发现,stat3 siRNA 既能抑制前列腺癌细胞的生长及stat3 介导的基因表达,又能诱导抗凋亡细胞死亡。另外,stat3 siRNA 还能抑制雄激素介导的前列腺特异抗原(prostate specific antigen , PSA) 在前列腺癌细胞中的表达。Butzk 23 在实验室将HPV 转化细胞作为模型系统,观察RNAi 介导的基因沉默是否可用于克服癌细胞的抗凋亡。最后发现,不管是载体产生的还是合成的siR
16、NA ,均能直接特异性地作用于HPVE6 癌基因,抑制其抗凋亡作用,恢复HPV 阳性癌细胞中静止的肿瘤抑制途径,选择性作用于HPV 阳性的癌细胞,最终引起大量抗凋亡细胞的死亡。所以,RNAi 可以有效的灭活细胞内的E6 功能,从而为肿瘤的治疗提供一个强有力的分子治疗策略。因此E6 可作为最有希望的治疗靶基因,通过siRNA 作用能有效纠正癌细胞的凋亡缺陷。一种叫做Brk 的细胞内蛋白酪氨酸激酶,其过量表达于大多数乳腺癌而促进癌细胞的增生,通过RNAi 技术抑制Brk 的表达,可作为乳腺癌治疗的又一新靶 24 。同样,在卵巢癌中,运用RNAi 技术抑制在卵巢癌的发病机制中起重要作用并能下调主要信
17、号通路的ERK基因,导致相应的ERK1/ 2 蛋白抑制,可以完全抑制卵巢癌细胞的增生 25 。Milner 等 26 应用RNAi 技术成功地沉默了感染HPV 的宫颈癌细胞中的HPV 基因,使宫颈细胞内的P53和RB 蛋白功能恢复?,从而恢复宫颈细胞内正常的防御功能,使已感染HPV 的宫颈癌细胞凋亡,而对其他健康细胞的正常生长和生物学行为无影响。因此Milner 教授宣称“RNAi 现象将是一个令人激动的事情”,在未来的325 年内siRNA 将有可能用于宫颈癌病人的临床治疗实验。癌基因bcr-acl 可表达于慢性粒细胞性白血病( chronicleukemic ,CML) 和急性淋巴细胞白血
18、病,已发现化学合成的、针对bcr-acl 癌基因的siRNA 能显著减少CML 病人中bcr-acl 阳性细胞及原始细胞中的bcr-acl mRNA 的表达约87 % ,而细胞内的c-abl 及c-bcr mRNA 的水平保持不变,表明这种mRNA 减少是特异针对bcr-acl 的。通过siRNA 作用,可致bcr-abl 阳性细胞及正常CD34+ 细胞中的bcr-acl 蛋白及核纤素A/ C 的表达减少80 % ,抑制bcr-acl 依赖性的bcr-acl 阳性细胞增生,从而特异、高效干扰造血细胞中癌融合基因的表达,抑制肿瘤生长 27 。Wilda 等 28 运用RNAi 技术成功杀伤了表达
19、bcl-abl 融合基因的白细胞,这也为进一步研究运用RNAi 技术杀伤伴有特异性基因异常的肿瘤细胞,作为肿瘤的基因治疗策略开辟了一片新天地。4 展望 从植物到哺乳动物, RNAi 已经引起了实验生物学的根本变革。由于其独特的作用机制和简便的技术流程, RNAi 正在替代反义核酸技术及基因敲除技术在基因功能研究上的地位, 而且作为肿瘤基因治疗的新方法, 其前景也是十分诱人的 19 。虽然要真正使用RNAi 技术应用于人类肿瘤的临床治疗目前条件尚不成熟, 但相信随着研究的广泛细致深入, 越来越多的与肿瘤生长增殖密切相关的高特异性靶基因及能使外源性治疗基因高效表达的载体的发现, RNAi 技术在不
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