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1、第八章第八章第八章第八章多倍体与单倍体植物多倍体与单倍体植物多倍体与单倍体植物多倍体与单倍体植物1 染色体工程染色体工程 依据确定的设计，有支配地消减、添加或替换同种或异种整条或部分染色体，从而达到定向变更遗传性和选育新品种的一种技术。在真核生物的体内，染色体是遗传物质DNA的载体。当染色体的数目发生变更时（缺少，增多）或者染色体的结构发生变更时，遗传信息就随之变更，带来的就是生物体的后代性状的变更，这就是染色体变异。它是可遗传变异的一种。依据产生变异的缘由，它可以分为结构变异和数量变异两大类。染色体发生整倍性增加，就产生多倍体细胞或生物体。2 多倍体植物多倍体植物2.1 多倍体的概念和种类多
2、倍体的概念和种类2.1.1 概念概念染色体组：一个属内，各个种特有的、染色体组：一个属内，各个种特有的、维持生物体生存最低限度数目维持生物体生存最低限度数目 的一组染色体。的一组染色体。染色体基数：一组染色体组内的染色体数目染色体基数：一组染色体组内的染色体数目 以以X表示表示 高粱高粱 X=10 小麦小麦 X=7 棉属棉属 X=13 玉米玉米 X=10 甘薯甘薯 X=15 豌豆豌豆 X=7 稻属稻属X=12 现在的栽培小麦现在的栽培小麦(Triticum vulgaris)是异源多倍体，具体地讲是六倍是异源多倍体，具体地讲是六倍体。大约体。大约10000年前，一种有年前，一种有14个染色体个
3、染色体(二倍体二倍体)的野生小麦，称为一粒的野生小麦，称为一粒小麦小麦(Triticummonococcum)，与一种杂草山羊草，与一种杂草山羊草(Aegilops sp)杂交。这杂交。这种杂草的正常二倍体也是种杂草的正常二倍体也是14个染色体，但是它们与一粒小麦的个染色体，但是它们与一粒小麦的14个染色体个染色体不同不同(不同源不同源)，因此不能配对，所以杂交后代是不育的。但是，由于低温，因此不能配对，所以杂交后代是不育的。但是，由于低温，这个杂交后代突然染色体加倍，形成了一个异源多倍体，即二粒小麦这个杂交后代突然染色体加倍，形成了一个异源多倍体，即二粒小麦(Triticum dicocco
4、ides)。二粒小麦具有。二粒小麦具有28个染色体，或个染色体，或14对染色体。约对染色体。约3000年前，二粒小麦与节节草年前，二粒小麦与节节草(Ageilops squarrosa)杂交，二粒小麦有杂交，二粒小麦有28个染色体，节节草只有个染色体，节节草只有14个染色体，杂交的后代又是不育的。由于低温，个染色体，杂交的后代又是不育的。由于低温，这个杂交种的染色体又突然加倍，形成了具有这个杂交种的染色体又突然加倍，形成了具有42个个(28+14)染色体的异源染色体的异源多倍体，即现在栽培的一般小麦。多倍体，即现在栽培的一般小麦。多倍体：体细胞具有多倍体：体细胞具有多倍体：体细胞具有多倍体：体
5、细胞具有3 3个或个或个或个或3 3个以上染色体组的生物体。个以上染色体组的生物体。个以上染色体组的生物体。个以上染色体组的生物体。二粒小麦二粒小麦二粒小麦二粒小麦 2n=4X=28 2n=4X=28 一般小麦一般小麦一般小麦一般小麦 2n=6X=42 2n=6X=42 陆地棉陆地棉陆地棉陆地棉 2n=4X=52 2n=4X=52二倍体二倍体二倍体二倍体:体细胞具有两体细胞具有两体细胞具有两体细胞具有两组染色体组的生物体组染色体组的生物体组染色体组的生物体组染色体组的生物体 一粒小麦一粒小麦一粒小麦一粒小麦 2n=2X=14 2n=2X=14 水稻水稻水稻水稻 2n=2X=24 2n=2X=2
6、4 玉米玉米玉米玉米 2n=2X=20 2n=2X=202.1.2 多倍体种类多倍体种类异源多倍体：染色体组来源不同的多倍体异源多倍体：染色体组来源不同的多倍体陆地棉陆地棉 异源四倍体异源四倍体 A1A1D1D1；一般小麦一般小麦 异源六倍体异源六倍体 AABBDD小黑麦小黑麦 异源六倍体异源六倍体 AABBRR；异源八倍体异源八倍体 AABBDDRR同源多倍体：染色体组来源相同的多倍体同源多倍体：染色体组来源相同的多倍体 甘薯甘薯 同源六倍体同源六倍体 马铃薯马铃薯 同源四倍体同源四倍体 香蕉香蕉 同源三倍体同源三倍体 2.1.3 多倍体的来源多倍体的来源 多倍体的发生可通过多倍体的发生可通
7、过二倍体的染色二倍体的染色体数目加倍体数目加倍形成，也可经过形成，也可经过不同种属之间不同种属之间杂交，而后经过染色体数目加倍杂交，而后经过染色体数目加倍形成。形成。二倍体种（二倍体种（2X=14）野生一粒小麦）野生一粒小麦拟斯卑尔脱山羊草拟斯卑尔脱山羊草 (AA)(BB)(AB)染色体加倍染色体加倍 四倍体种（四倍体种（2X=28）野生二粒小麦野生二粒小麦 粗山羊草粗山羊草 (AABB)(DD)(ABD)染色体加倍染色体加倍 六倍体种（六倍体种（2X=42）一般小麦一般小麦 （AABBDD）图图 小麦可能的进化途径小麦可能的进化途径2.2 多倍体植物的特点多倍体植物的特点2.2.1 同源多倍
8、体植物的特点同源多倍体植物的特点1)器官的巨型性器官的巨型性一般表现在叶大；茎粗；花大，色浓；果实、种子、细一般表现在叶大；茎粗；花大，色浓；果实、种子、细胞、气孔、花粉都大。胞、气孔、花粉都大。如三倍体、四倍体葡萄粒大；四倍体萝卜主根粗大。如三倍体、四倍体葡萄粒大；四倍体萝卜主根粗大。2)育性差，坚固率低。育性差，坚固率低。3)一般同源多倍体坚固率低。一般同源多倍体坚固率低。4)缘由：同源多倍体由于在减数分裂时，缘由：同源多倍体由于在减数分裂时，染色体间配对不正常，易出现多价体，致使染色体间配对不正常，易出现多价体，致使多数配子含有不正常染色体数，因而表现出多数配子含有不正常染色体数，因而表
9、现出育性差，坚固率低。育性差，坚固率低。5)园艺植物大多数同源多倍体为无性繁殖园艺植物大多数同源多倍体为无性繁殖植物，育性差但不影响在生产中的应用。对植物，育性差但不影响在生产中的应用。对于水果来说，无籽或少籽为优良性状。于水果来说，无籽或少籽为优良性状。6)而异源多倍体，与远缘杂种相反，是高而异源多倍体，与远缘杂种相反，是高度可育的。来自父母本的染色体在减数分裂度可育的。来自父母本的染色体在减数分裂时自行配对，不出现多价体，表现为自交亲时自行配对，不出现多价体，表现为自交亲和，坚固率较高。和，坚固率较高。3)抗逆性强抗逆性强多倍体新陈代谢旺盛，适应环境实多倍体新陈代谢旺盛，适应环境实力强。表
10、现为抗病、抗旱、耐寒，分布力强。表现为抗病、抗旱、耐寒，分布广。广。如多倍体从赤道到极地都有分布；如多倍体从赤道到极地都有分布；高山上多倍体多；在燥热夏季的稻田里高山上多倍体多；在燥热夏季的稻田里常发觉多倍体花粉粒。常发觉多倍体花粉粒。4)养分成分高养分成分高碳水化合物、蛋白质、维生素、植碳水化合物、蛋白质、维生素、植物碱等表现偏高。物碱等表现偏高。如四倍体番茄如四倍体番茄Vc含量比二倍体高一含量比二倍体高一倍。四倍体紫罗兰、桂竹香芳香性强、倍。四倍体紫罗兰、桂竹香芳香性强、蜜腺多。蜜腺多。2.3 2.3 多倍体植物培育多倍体植物培育 生物体内染色体数目的变更是以染生物体内染色体数目的变更是以
11、染色体组为单位进行增减，当生物细胞内色体组为单位进行增减，当生物细胞内染色体数达到染色体数达到3 3组或组或3 3组以上者称为多倍组以上者称为多倍体。它是很多生物群体染色体进化的重体。它是很多生物群体染色体进化的重要特征。在自然界中普遍存在着多倍体要特征。在自然界中普遍存在着多倍体物种，蕨类植物中多倍体可能高达物种，蕨类植物中多倍体可能高达50%50%被被子植物中大约有子植物中大约有30353035种的多倍体，其中种的多倍体，其中70%70%的禾本科属于多倍体。多倍体是植物的禾本科属于多倍体。多倍体是植物最重要的进化方式之一。因此近几十年最重要的进化方式之一。因此近几十年来人们对多倍体进行了深
12、化探讨不仅为来人们对多倍体进行了深化探讨不仅为进化供应大量证据而且在生产实践上有进化供应大量证据而且在生产实践上有着广泛的应用价值。着广泛的应用价值。2.3.1 2.3.1物理诱导方法物理诱导方法 主要有温度激变、射线照射、机械主要有温度激变、射线照射、机械损伤、电离辐射和摘心等均可诱导多倍损伤、电离辐射和摘心等均可诱导多倍体的产生。体的产生。实例：实例：中粒种咖啡花粉母细胞减数分裂时中粒种咖啡花粉母细胞减数分裂时用骤变低温用骤变低温8-108-10干脆处理花器官可干脆处理花器官可获得大量二倍性花粉粒；获得大量二倍性花粉粒；用紫外光照射甜菜花芽用紫外光照射甜菜花芽20min20min分钟也分钟
13、也能导致自交后代中有能导致自交后代中有2 2株产生大花粉；株产生大花粉；Co Co射线照射处理萌动的杜仲种子、射线照射处理萌动的杜仲种子、r r射线照射珍宝粟、射线照射珍宝粟、x x射线照射水稻也可以射线照射水稻也可以产生多倍体。产生多倍体。机械损伤诱导多倍体的产生：机械损伤诱导多倍体的产生：植物的组织被切伤或嫁接后往往在切口处植物的组织被切伤或嫁接后往往在切口处产生愈伤组织某些愈伤组织细胞内的染色体能产生愈伤组织某些愈伤组织细胞内的染色体能自然加倍，将来发育成多倍体枝条如在茄科植自然加倍，将来发育成多倍体枝条如在茄科植物中通过反复摘心打顶而诱导四倍体的产生，物中通过反复摘心打顶而诱导四倍体的
14、产生，其频率可达其频率可达10%10%。其实最早的物理诱导方式就。其实最早的物理诱导方式就是在番茄上通过打顶而实现的。是在番茄上通过打顶而实现的。2.3.22.3.2化学诱导法化学诱导法 是目前应用最广泛的方法。是目前应用最广泛的方法。化学诱化学诱变剂其中尤以秋水仙素处理效果最好。变剂其中尤以秋水仙素处理效果最好。值得留意的是秋水仙素有剧毒为淡黄色值得留意的是秋水仙素有剧毒为淡黄色粉末针状结晶易溶于凉水但不溶于热水粉末针状结晶易溶于凉水但不溶于热水它是从秋水仙的鳞茎和种子中提取出来它是从秋水仙的鳞茎和种子中提取出来的。秋水仙素的作用机理在于它能抑制的。秋水仙素的作用机理在于它能抑制细胞分裂时纺
15、锤体的形成染色单体分裂细胞分裂时纺锤体的形成染色单体分裂但胞质不分别导致染色体数目加倍。处但胞质不分别导致染色体数目加倍。处理时留意浓度和处理时间秋水仙素的有理时留意浓度和处理时间秋水仙素的有效浓度为效浓度为0.01-1.0%0.01-1.0%，而以，而以0.2-0.4%0.2-0.4%应用应用范围最广。范围最广。处理时间一般不少于处理时间一般不少于24h24h，可因运用浓，可因运用浓度大小而异。度大小而异。处理温度一般处理温度一般18-25.18-25.1 1）活体条件下的诱导）活体条件下的诱导 秋水仙素是对正在分裂的细胞产生作用因而生产上常选用萌动秋水仙素是对正在分裂的细胞产生作用因而生产
16、上常选用萌动或萌发的种子、幼苗、正在生长的嫩梢及芽为处理材料，用确定浓或萌发的种子、幼苗、正在生长的嫩梢及芽为处理材料，用确定浓度的秋水仙素或乳剂对材料进行浸渍、涂抹、滴液、注射等方法处度的秋水仙素或乳剂对材料进行浸渍、涂抹、滴液、注射等方法处理诱导。理诱导。多种果树接受此方法均获成功如猕猴桃。多种果树接受此方法均获成功如猕猴桃。2 2）离体条件下的处理诱导）离体条件下的处理诱导 组织培育技术的发展使以单个细胞或少数细胞为诱导材料再由组织培育技术的发展使以单个细胞或少数细胞为诱导材料再由诱导加倍的细胞分化成植株成为可能，它不仅能削减或避开常规处诱导加倍的细胞分化成植株成为可能，它不仅能削减或避
17、开常规处理易产生嵌合体的干扰，获得同质的多倍体提高诱变效果，而且能理易产生嵌合体的干扰，获得同质的多倍体提高诱变效果，而且能在人为限制试验条件下反复多次试验提高诱变率。此外诱变群体多在人为限制试验条件下反复多次试验提高诱变率。此外诱变群体多也能保证多倍体筛选、选择的成功并且一旦筛选出的多倍体能在短也能保证多倍体筛选、选择的成功并且一旦筛选出的多倍体能在短时间内快速繁殖出大量纯度高、质量好、无病虫害的试管苗便于进时间内快速繁殖出大量纯度高、质量好、无病虫害的试管苗便于进行田间鉴定、示范、推广。行田间鉴定、示范、推广。2.3.3 2.3.3 生物学方法生物学方法1 1）体细胞杂交法）体细胞杂交法
18、体细胞杂交又称原生质体融合该技术的发展体细胞杂交又称原生质体融合该技术的发展是建立在组织培育和原生质体培育的基础上的。是建立在组织培育和原生质体培育的基础上的。随着原生质体再生体系的建立融合探讨的技术和随着原生质体再生体系的建立融合探讨的技术和条件的成熟体细胞杂交法培育多倍体已切实可行。条件的成熟体细胞杂交法培育多倍体已切实可行。首先用纤维素酶和果胶酶处理植物细胞得到大量首先用纤维素酶和果胶酶处理植物细胞得到大量无壁的原生质体再通过化学或物理方法诱导异核无壁的原生质体再通过化学或物理方法诱导异核体进一步融合后成为共核体经培育后诱导分化出体进一步融合后成为共核体经培育后诱导分化出同源或异源多倍体
19、植株，如柑桔。同源或异源多倍体植株，如柑桔。2 2）胚乳培育法）胚乳培育法 胚乳是由胚乳是由3 3个单倍体核融合而成的个单倍体核融合而成的,其中其中1 1个单个单倍体核来自雄配子体倍体核来自雄配子体,2,2个来自雌配子体个来自雌配子体,因此胚乳因此胚乳是自然的三倍体组织是自然的三倍体组织,具有双亲的遗传成分具有双亲的遗传成分,对育对育种后代性状有确定的预见性。而且胚乳同样具有种后代性状有确定的预见性。而且胚乳同样具有一般细胞的全能性一般细胞的全能性,因此胚乳细胞的培育可得三倍因此胚乳细胞的培育可得三倍体植株。如红江橙、柚、猕猴桃等。体植株。如红江橙、柚、猕猴桃等。2.42.4多倍体植物鉴定方法
20、多倍体植物鉴定方法从原理上是依据其外在和内在的特征特性衍生而来从原理上是依据其外在和内在的特征特性衍生而来的。一般而言可以以形态外形视察为基础，组织化的。一般而言可以以形态外形视察为基础，组织化学、叶绿体计数为帮助、细胞学视察染色体数来确学、叶绿体计数为帮助、细胞学视察染色体数来确定。切忌以个别特征为依据妄言断之。定。切忌以个别特征为依据妄言断之。2.4.12.4.1形态鉴定法形态鉴定法通常在对育成多倍体材料进行鉴定时，整个生长期通常在对育成多倍体材料进行鉴定时，整个生长期均可以外部形态特征来推断，它是初步鉴定是否为均可以外部形态特征来推断，它是初步鉴定是否为多倍体的方法也是最简洁、最直观粗放
21、的方法。它多倍体的方法也是最简洁、最直观粗放的方法。它可以为育种工作者削减大量工作量。如巨大性是多可以为育种工作者削减大量工作量。如巨大性是多倍体最为显著的外部形态特征，多倍体一般茎粗大倍体最为显著的外部形态特征，多倍体一般茎粗大且短生长缓慢，发育迟缓，叶变厚，叶色变深，叶且短生长缓慢，发育迟缓，叶变厚，叶色变深，叶形指数变小，花果都较二倍体大。这些主要分四个形指数变小，花果都较二倍体大。这些主要分四个阶段来识别：阶段来识别：:幼苗期、养分生长期、花期、果期。幼苗期、养分生长期、花期、果期。2.4.22.4.2细胞学鉴定法细胞学鉴定法 多倍体较二倍体气孔变大，花粉粒萌发孔多倍体较二倍体气孔变大
22、，花粉粒萌发孔沟数目增多，花粉粒大小不整齐，败育花粉粒沟数目增多，花粉粒大小不整齐，败育花粉粒较多，小孢母细胞增大，且在减数分裂中有异较多，小孢母细胞增大，且在减数分裂中有异样行为。样行为。2.4.32.4.3染色体计数法染色体计数法 通常通过检查分生旺盛的器官、组织的染通常通过检查分生旺盛的器官、组织的染色体数目来进行鉴定，它是最干脆、也是最精色体数目来进行鉴定，它是最干脆、也是最精确的鉴定方法。它不但能区分倍性，而且还能确的鉴定方法。它不但能区分倍性，而且还能鉴定是整倍性或非整倍性的变异。鉴定是整倍性或非整倍性的变异。因染色体制片技术早已成熟故切实可行。因染色体制片技术早已成熟故切实可行。
23、2.4.42.4.4分子水平的鉴定分子水平的鉴定 随着分子生物学技术的发展人们起先从分随着分子生物学技术的发展人们起先从分子水平入手探讨多倍体对其倍性、来源进行鉴子水平入手探讨多倍体对其倍性、来源进行鉴定。目前就有用扫描细胞光度仪来测定单个定。目前就有用扫描细胞光度仪来测定单个DNADNA含量，再依据含量，再依据DNADNA含量比较来推断细胞倍性含量比较来推断细胞倍性的报道。同时原位杂交技术的日趋成熟也为多的报道。同时原位杂交技术的日趋成熟也为多倍体的鉴定供应了全新的途径。倍体的鉴定供应了全新的途径。分子生物学分子生物学方法的应用，不仅能鉴定细胞的倍性，而且还方法的应用，不仅能鉴定细胞的倍性，
24、而且还能鉴定其亲本的来源。能鉴定其亲本的来源。此外此外RAPDRAPD，即随机扩增多态性，即随机扩增多态性DNA(Random DNA(Random Amplified Polymorphic DNA),Amplified Polymorphic DNA),此技术建立于此技术建立于 PCR PCR 基础之上基础之上,运用一系列具有运用一系列具有 10 10 个左右碱个左右碱基的单链随机基的单链随机 引物引物,对基因组的对基因组的 DNA DNA 全部进全部进行行 PCR PCR 扩增扩增,以检测多态性以检测多态性 ）RFLPRFLP技术也已成功的应用到本事域的探技术也已成功的应用到本事域的探讨
25、中。讨中。限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（restriction restriction fragment length polymorphism,RFLPfragment length polymorphism,RFLP）分析技术，是分子生物学的重要分析方分析技术，是分子生物学的重要分析方法之一，用于检测法之一，用于检测DNADNA序列多态性。序列多态性。PCR-PCR-RFLPRFLP是将是将PCR PCR 技术、技术、RFLP RFLP 分析与电泳方分析与电泳方法联合应用，先将待测的靶法联合应用，先将待测的靶DNA DNA 片段进片段进行复制扩增，然后应用行复制扩增，然后应用
26、DNA DNA 限制性内切限制性内切酶对扩增产物进行酶切，最终经电泳分酶对扩增产物进行酶切，最终经电泳分析靶析靶DNA DNA 片段是否被切割而分型。片段是否被切割而分型。2.5 2.5 多倍体育种的意义与应用多倍体育种的意义与应用2.5.1 2.5.1 多倍体育种的意义多倍体育种的意义1 1）通过增加一个现有物种的染色体数）通过增加一个现有物种的染色体数目，产生同源多倍体，可获得植物某目，产生同源多倍体，可获得植物某些器官的些器官的“巨大型巨大型”的干脆效果，如的干脆效果，如番茄；番茄；2 2）通过远缘亲本或种间不育杂种的染）通过远缘亲本或种间不育杂种的染色体加倍，克服远缘杂交的困难；色体加
27、倍，克服远缘杂交的困难；3 3）培育多倍体作为不同倍数性间或种）培育多倍体作为不同倍数性间或种间的遗传桥梁，进行基因转移或渗透。间的遗传桥梁，进行基因转移或渗透。2.5.2 人工诱导多倍体在生产上的应用人工诱导多倍体在生产上的应用1）异源多倍体小黑麦）异源多倍体小黑麦2）三单倍体甜菜和三倍体西瓜）三单倍体甜菜和三倍体西瓜3）同源四倍体黑麦，同源四倍体葡萄）同源四倍体黑麦，同源四倍体葡萄三倍体无籽西瓜培育过程三倍体无籽西瓜培育过程3 单倍体与纯合二倍体植物单倍体与纯合二倍体植物3.1 单倍体植物单倍体植物单倍体单倍体:具有配子体染色体数目的孢子体具有配子体染色体数目的孢子体单倍体育种单倍体育种:
28、人工诱导单倍体人工诱导单倍体,并使其成为并使其成为 纯合二倍体，从中选育出新品纯合二倍体，从中选育出新品 种的方法种的方法.单倍体的种类单倍体的种类整倍单倍体整倍单倍体：具有配子体染色体数目的孢子体：具有配子体染色体数目的孢子体 一倍体（单元单倍体）一倍体（单元单倍体）一倍单倍体一倍单倍体：由二倍体植物产生的含有一组：由二倍体植物产生的含有一组 染色体染色体 的单倍体的单倍体多倍单倍体多倍单倍体：多倍体植物产生的含有一组以上：多倍体植物产生的含有一组以上 染色体组的单倍体染色体组的单倍体 同源多倍单倍体同源多倍单倍体：同源多倍体产生的多倍单倍体：同源多倍体产生的多倍单倍体 异源多倍单倍体异源多
29、倍单倍体：异源多倍体产生的多倍单倍体：异源多倍体产生的多倍单倍体按倍数按倍数按倍数按倍数按来源按来源按来源按来源 单倍体既可以自然产生，也可以人工诱导，它一般是由不正常的受精过程产生的，即由孤雌生殖、孤雄生殖、无配子生殖等方式产生的。在育种工作中，单倍体主要靠人工诱导产生。人工诱导产生单倍体的途径主要有下列几种：1）组织和细胞离体培育 通过细胞和组织培育是育种工作中产生单倍体的主要途径。(1)花药（花粉）离体培育：这是目前人工获得单倍体最简洁有效的方法。其原理是：作物的每一特化的细胞都具有发育成完整植株的潜力。花药培育产生单倍体的途径有二：一是花粉阅历了去分化和胚胎发生过程，通过胚状体而形成单
30、倍体的胚，以后干脆发育成单倍体植株(胚胎发生系统)；另一种是花粉多细胞团增殖，形成愈伤组织，以后再经诱导分化成再生植株(器官发生系统)。用花粉培育获得单倍体是否有育种价值，取决于用于培育的原材料是否优良和是否易于诱导成功。实践证明，不同基因型的植物材料间单倍体的诱导率不同，所以选择恰当的培育材料是花粉育种的重要一环。3.1.1 产生单倍体的主要途径和方法产生单倍体的主要途径和方法2)2)未授粉的子房（胚珠）培育未授粉的子房（胚珠）培育:用未授粉的子房（胚珠）离体培用未授粉的子房（胚珠）离体培育是诱导大孢子发育成单倍体的另一育是诱导大孢子发育成单倍体的另一途径。探讨表明，来自大孢子的单倍途径。探
31、讨表明，来自大孢子的单倍体有更强的生活力，并且后代的性状体有更强的生活力，并且后代的性状也比较稳定，尤其是对于那些难以用也比较稳定，尤其是对于那些难以用花粉培育获得单倍体的植物或雄性不花粉培育获得单倍体的植物或雄性不育植物供应了获得单倍体的有效途径，育植物供应了获得单倍体的有效途径，所以在植物的改良中有较大意义。所以在植物的改良中有较大意义。未授粉胚珠离体培育是人工诱导形成单倍体植株的技术之一。近未授粉胚珠离体培育是人工诱导形成单倍体植株的技术之一。近年来国内外学者在此方面做了很多探究工作。相继有人在小麦、烟草、年来国内外学者在此方面做了很多探究工作。相继有人在小麦、烟草、玉米、杨树、甜菜等植
32、物上进行了未授粉胚珠或子房的离体培育，大玉米、杨树、甜菜等植物上进行了未授粉胚珠或子房的离体培育，大多获得了单倍体植株。与花药培育相比，经未授粉胚珠离体培育诱导多获得了单倍体植株。与花药培育相比，经未授粉胚珠离体培育诱导的单倍体植株有三个独特的优点：的单倍体植株有三个独特的优点：(1)(1)有些植物花药培育至今难以成功有些植物花药培育至今难以成功或诱导率太低，而未授粉胚珠离体培育可供应一条单倍体育种新途径；或诱导率太低，而未授粉胚珠离体培育可供应一条单倍体育种新途径；(2)(2)对于雄性不育的植物无法用花药来培育获得单倍体，可接受未授粉对于雄性不育的植物无法用花药来培育获得单倍体，可接受未授粉
33、胚珠培育来诱导；胚珠培育来诱导；(3)(3)未授粉胚珠培育的后代能产生较多的绿苗。培育未授粉胚珠培育的后代能产生较多的绿苗。培育地方品种或杂种一代的未授粉胚珠或子房，可快速获得高纯度种质资地方品种或杂种一代的未授粉胚珠或子房，可快速获得高纯度种质资源，在高效率利用种质资源、提高选育效果方面有理论探讨和实际应源，在高效率利用种质资源、提高选育效果方面有理论探讨和实际应用价值。用价值。以下是以西葫芦未授粉胚珠为材料，进行子房离体培育诱导单倍体以下是以西葫芦未授粉胚珠为材料，进行子房离体培育诱导单倍体的方法：的方法：附：参考资料附：参考资料 西葫芦西葫芦(Cucurbita pepo L)(Cucu
34、rbita pepo L)是重要的蔬菜作物，其瓠果是重要的蔬菜作物，其瓠果养分丰富，我国各地普遍栽培。生产上迫切须要耐低温、耐弱养分丰富，我国各地普遍栽培。生产上迫切须要耐低温、耐弱光等特殊生态条件和抗白粉病、病毒病等兼抗性高产品种。但光等特殊生态条件和抗白粉病、病毒病等兼抗性高产品种。但常规育种周期长，变异谱范围有限，不宜捕获目标性状。在瓜常规育种周期长，变异谱范围有限，不宜捕获目标性状。在瓜类蔬菜方面，类蔬菜方面，Trong-AndreTrong-Andre7 7等利用辐射处理的黄瓜花粉，等利用辐射处理的黄瓜花粉，授在黄瓜子房上，半月后取出胚珠进行离体培育，获得诱导频授在黄瓜子房上，半月后
35、取出胚珠进行离体培育，获得诱导频率为率为3%3%的单倍体植株。但迄今，有关西葫芦未受精胚珠培育的的单倍体植株。但迄今，有关西葫芦未受精胚珠培育的报道很少。本试验以西葫芦未授粉胚珠为试材，进行离体培育报道很少。本试验以西葫芦未授粉胚珠为试材，进行离体培育诱导，并获得再生植株，为进一步利用细胞工程选育西葫芦良诱导，并获得再生植株，为进一步利用细胞工程选育西葫芦良种，加快育种进程供应一种有效的试验系统。种，加快育种进程供应一种有效的试验系统。1 1材料与方法材料与方法1.11.1材料材料供试西葫芦为供试西葫芦为“早青一代早青一代”。1.21.2培育条件培育条件诱导愈伤组织的预培育基：诱导愈伤组织的预
36、培育基：MS+2MS+2，4-D 1 mg/L+NAA 0.5 4-D 1 mg/L+NAA 0.5 mg/Lmg/L；诱导愈伤组织的培育基：诱导愈伤组织的培育基：MS+2MS+2，4-D 1 mg/L+NAA 0.5 4-D 1 mg/L+NAA 0.5 mg/L+BA 1 mg/Lmg/L+BA 1 mg/L；愈伤组织继代培育基：愈伤组织继代培育基：MS+2MS+2，4-D 0.5 4-D 0.5 mg/L+BA 1 mg/Lmg/L+BA 1 mg/L；芽分化培育基：芽分化培育基：MS+NAA 0.5 mg/L+BA 1 MS+NAA 0.5 mg/L+BA 1 mg/Lmg/L；诱导培
37、育基：诱导培育基：1/2MS+0.5%KNO31/2MS+0.5%KNO3。培育基培育基培育基培育基、均添加均添加均添加均添加3%3%的蔗糖，的蔗糖，的蔗糖，的蔗糖，0.8%0.8%琼脂，琼脂，琼脂，琼脂，pHpH为为为为5.75.7。在。在。在。在号培育基中添加号培育基中添加号培育基中添加号培育基中添加3.5%3.5%的蔗糖和的蔗糖和的蔗糖和的蔗糖和0.8%0.8%的琼脂，的琼脂，的琼脂，的琼脂，号培育基蔗糖号培育基蔗糖号培育基蔗糖号培育基蔗糖浓度取浓度取浓度取浓度取2%2%，3.5%3.5%，7%7%，10%410%4个水平，琼脂浓度取个水平，琼脂浓度取个水平，琼脂浓度取个水平，琼脂浓度取
38、0.6%0.6%，0.8%0.8%，1%31%3个水平。于个水平。于个水平。于个水平。于2525、每日、每日、每日、每日16 h16 h光照，光照，光照，光照，4 500 lx4 500 lx光强条件光强条件光强条件光强条件下进行培育。下进行培育。下进行培育。下进行培育。1.31.3材料处理材料处理选取无病、无伤的未授粉的西葫芦，无菌条件下，选取无病、无伤的未授粉的西葫芦，无菌条件下，将子房在将子房在75%75%的酒精中浸泡的酒精中浸泡1 min1 min，以无菌水冲洗，以无菌水冲洗2 2次，次，再放入再放入0.1%0.1%的升汞溶液中浸泡的升汞溶液中浸泡10 min10 min，无菌水冲洗，
39、无菌水冲洗4 4次次后，在无菌超净台取出含胚珠的胎座组织，待用。后，在无菌超净台取出含胚珠的胎座组织，待用。1.41.4培育方法培育方法分别取开花前分别取开花前3 3日、开花当日、开花后日、开花当日、开花后2 2日未授粉日未授粉子房，经无菌处理后，挑取子房内含胚珠的胎座组织，子房，经无菌处理后，挑取子房内含胚珠的胎座组织，接种至接种至号培育基进行预培育。号培育基进行预培育。15 d15 d后，取胎座组织后，取胎座组织内胚珠，以横切分、纵切分、切啄、完整胚珠内胚珠，以横切分、纵切分、切啄、完整胚珠4 4种方法种方法接种于接种于号培育基。将生长致密愈伤组织切成号培育基。将生长致密愈伤组织切成0.5
40、 cm30.5 cm3大小，接到培育基大小，接到培育基继代培育。继代后的愈伤组织转继代培育。继代后的愈伤组织转入入号培育基培育。分化出的不定芽移入号培育基培育。分化出的不定芽移入号培育基号培育基作诱根培育。作诱根培育。1.51.5再生植株染色体倍性视察再生植株染色体倍性视察取取0.10.10.5 cm0.5 cm长的根类。长的根类。0.1%0.1%秋水仙中素预处理，秋水仙中素预处理，2 h2 h后，以卡诺固定液处理后，以卡诺固定液处理24 h24 h。常温下将固定后的根。常温下将固定后的根尖用尖用1 mol HCl1 mol HCl溶液解离溶液解离30 min30 min，清水冲洗，压片镜检。
41、，清水冲洗，压片镜检。2 2结果与分析结果与分析2.12.1培育方法对未授粉胚珠愈伤组织形培育方法对未授粉胚珠愈伤组织形成的影响成的影响试验结果表明，开花当日的未受精试验结果表明，开花当日的未受精胚珠愈伤组织的诱导率最高，达胚珠愈伤组织的诱导率最高，达14.2%14.2%；开花前开花前3 3日的未受精胚珠次之，为日的未受精胚珠次之，为10.5%10.5%；而开花后；而开花后2 2日的未受精胚珠为日的未受精胚珠为4.4%4.4%。内源激素内源激素内源激素内源激素(如内源如内源如内源如内源GAGA，BABA等等等等)水平对未受精胚珠愈伤组织水平对未受精胚珠愈伤组织水平对未受精胚珠愈伤组织水平对未受
42、精胚珠愈伤组织的诱导有重要作用，而在瓜的诱导有重要作用，而在瓜的诱导有重要作用，而在瓜的诱导有重要作用，而在瓜类花器内源激素的水平在开类花器内源激素的水平在开类花器内源激素的水平在开类花器内源激素的水平在开花前几日起先上升，开花当花前几日起先上升，开花当花前几日起先上升，开花当花前几日起先上升，开花当日日日日 图图图图a a 预培育后的西葫芦未预培育后的西葫芦未预培育后的西葫芦未预培育后的西葫芦未受精胚珠；图受精胚珠；图受精胚珠；图受精胚珠；图b b 西葫芦未受精西葫芦未受精西葫芦未受精西葫芦未受精胚珠膨大；图胚珠膨大；图胚珠膨大；图胚珠膨大；图c c 继代培育后的继代培育后的继代培育后的继代
43、培育后的未受精胚珠愈伤组织；图未受精胚珠愈伤组织；图未受精胚珠愈伤组织；图未受精胚珠愈伤组织；图d d 有有有有嫩芽发生的西葫芦未受精胚嫩芽发生的西葫芦未受精胚嫩芽发生的西葫芦未受精胚嫩芽发生的西葫芦未受精胚珠愈伤组织块；图珠愈伤组织块；图珠愈伤组织块；图珠愈伤组织块；图e e 西葫芦未西葫芦未西葫芦未西葫芦未受精胚珠愈伤组织再生芽块；受精胚珠愈伤组织再生芽块；受精胚珠愈伤组织再生芽块；受精胚珠愈伤组织再生芽块；图图图图f f 西葫芦未受精胚珠离体培西葫芦未受精胚珠离体培西葫芦未受精胚珠离体培西葫芦未受精胚珠离体培育再生植株；图育再生植株；图育再生植株；图育再生植株；图g g 再生植株根再生植
44、株根再生植株根再生植株根尖染色体数。尖染色体数。尖染色体数。尖染色体数。比较比较4 4种接种方法后发觉，横切分法接种的胚珠，最先从切口种接种方法后发觉，横切分法接种的胚珠，最先从切口处长出愈伤组织，且愈伤组织诱导率最高达处长出愈伤组织，且愈伤组织诱导率最高达28%(28%(图图 1-c)1-c)，其，其次为切啄、纵切分，而以完整胚珠法所得愈伤组织诱导率最低次为切啄、纵切分，而以完整胚珠法所得愈伤组织诱导率最低，为，为6%6%，究其缘由可能是横切分、切啄和纵切分三种方法给外，究其缘由可能是横切分、切啄和纵切分三种方法给外植体以较大的创伤面而激发了愈伤组织的形成，也可能是加大植体以较大的创伤面而激
45、发了愈伤组织的形成，也可能是加大了创伤面而增加了未授粉胚珠对养分的吸取实力。了创伤面而增加了未授粉胚珠对养分的吸取实力。内源激素达到较高的水平，之后快速下降。故开花当日未受精胚珠活力较高，内源激素达到较高的水平，之后快速下降。故开花当日未受精胚珠活力较高，内源激素达到较高的水平，之后快速下降。故开花当日未受精胚珠活力较高，内源激素达到较高的水平，之后快速下降。故开花当日未受精胚珠活力较高，其愈伤组织诱导率也最高。经预培育其愈伤组织诱导率也最高。经预培育其愈伤组织诱导率也最高。经预培育其愈伤组织诱导率也最高。经预培育15 d15 d后，子房表面起先发白，体积加大，胚后，子房表面起先发白，体积加大
46、，胚后，子房表面起先发白，体积加大，胚后，子房表面起先发白，体积加大，胚珠突出珠突出珠突出珠突出(图图图图 1-a)1-a)。取出胚珠，在。取出胚珠，在。取出胚珠，在。取出胚珠，在号培育基中培育号培育基中培育号培育基中培育号培育基中培育20 d20 d后，发觉部分胚珠膨大呈后，发觉部分胚珠膨大呈后，发觉部分胚珠膨大呈后，发觉部分胚珠膨大呈半透亮状半透亮状半透亮状半透亮状(图图图图 1-b)1-b)。诱愈培育。诱愈培育。诱愈培育。诱愈培育30 d30 d后，统计表明经预培育的未受精胚珠，其愈伤后，统计表明经预培育的未受精胚珠，其愈伤后，统计表明经预培育的未受精胚珠，其愈伤后，统计表明经预培育的未
47、受精胚珠，其愈伤组织诱导率可达组织诱导率可达组织诱导率可达组织诱导率可达15.6%15.6%，而未经预培育的比照仅为，而未经预培育的比照仅为，而未经预培育的比照仅为，而未经预培育的比照仅为6.9%6.9%。这可能是预培育的胚珠。这可能是预培育的胚珠。这可能是预培育的胚珠。这可能是预培育的胚珠能同时从胎座组织和预培育基中吸取养分，也可能胎座组织含有培育基不具备的、能同时从胎座组织和预培育基中吸取养分，也可能胎座组织含有培育基不具备的、能同时从胎座组织和预培育基中吸取养分，也可能胎座组织含有培育基不具备的、能同时从胎座组织和预培育基中吸取养分，也可能胎座组织含有培育基不具备的、某种促进西葫芦未受精
48、胚珠愈伤组织形成的物质所致。某种促进西葫芦未受精胚珠愈伤组织形成的物质所致。某种促进西葫芦未受精胚珠愈伤组织形成的物质所致。某种促进西葫芦未受精胚珠愈伤组织形成的物质所致。图图图图 1-a 1-a图图图图 1-b 1-b图图图图 1-c 1-c2.22.2愈伤组织分化和植株再生愈伤组织分化和植株再生愈伤组织经愈伤组织经1 12 2次继代培育后，移至由次继代培育后，移至由琼脂、蔗糖不同浓度组合的分化培育基。发琼脂、蔗糖不同浓度组合的分化培育基。发觉在觉在0.8%0.8%琼脂和琼脂和2%2%蔗糖组合的芽分化培育基蔗糖组合的芽分化培育基上，上，25 d25 d后，个别未授粉胚珠愈伤组织块有后，个别未
49、授粉胚珠愈伤组织块有绿色芽点状突起，并有嫩芽发生。绿色芽点状突起，并有嫩芽发生。(图图 1-d 1-d，1-e)1-e)其芽诱导率最高，达其芽诱导率最高，达15.6%15.6%。而其它。而其它组合的芽分化培育基，芽诱导率低，这可能组合的芽分化培育基，芽诱导率低，这可能是培育基中养分物质向愈伤组织扩散的速度是培育基中养分物质向愈伤组织扩散的速度减慢，使诱芽效果变差。而且未授粉胚珠愈减慢，使诱芽效果变差。而且未授粉胚珠愈伤组织芽的分化需较低的渗透压，随蔗糖浓伤组织芽的分化需较低的渗透压，随蔗糖浓度的增加，培育基渗透压加大，故诱芽效果度的增加，培育基渗透压加大，故诱芽效果差。差。不定芽经伸长及生根培
50、育，形成完整植株不定芽经伸长及生根培育，形成完整植株不定芽经伸长及生根培育，形成完整植株不定芽经伸长及生根培育，形成完整植株(图图图图 1-f)1-f)。在做诱根试验时发觉，诱根培育基中添加高浓度在做诱根试验时发觉，诱根培育基中添加高浓度在做诱根试验时发觉，诱根培育基中添加高浓度在做诱根试验时发觉，诱根培育基中添加高浓度的的的的NO-3NO-3有利于不定芽根的形成，但其作用机理尚有利于不定芽根的形成，但其作用机理尚有利于不定芽根的形成，但其作用机理尚有利于不定芽根的形成，但其作用机理尚不清晰。再生植株经染色体倍性视察发觉，其染不清晰。再生植株经染色体倍性视察发觉，其染不清晰。再生植株经染色体倍