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1、第四节第四节 基因工程操作过程基因工程操作过程一、一、DNA的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）二、重组二、重组DNA分子的转化和扩增（转、增）分子的转化和扩增（转、增）三、转化子的筛选和鉴定（检）三、转化子的筛选和鉴定（检）转基因技术转基因技术一一 DNA DNA的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）粘性末端连接和粘性末端连接和5端去磷酸化端去磷酸化利用衔接物进行平末端的连接利用衔接物进行平末端的连接35粘末端平端化的连接粘末端平端化的连接同聚物接尾法同聚物接尾法二二 DNA DNA分子的转化和扩增（转、增）分子的转化和扩增（转、增）nn转化的原理与技术转化的原理与技术转化的原理与技术
2、转化的原理与技术nn转化率转化率转化率转化率nn转化细胞的扩增转化细胞的扩增转化细胞的扩增转化细胞的扩增转化的原理与技术转化的原理与技术 Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化诱导的完整细菌细胞的转化Ca2+诱诱导导的的完完整整细细胞胞的的转转化化适适用用于于革革兰兰氏氏阴阴性性细细菌菌（如如大大肠肠杆杆菌菌等等），1970年年建建立立此此技技术术，其其原原理理是是Ca2+与与细细菌菌外外膜膜磷磷脂脂在在低低温温下下形形成成液液晶晶结结构构，后后者者经经热热脉脉冲冲发发生生收收缩缩作作用用，使使细细胞胞膜膜出出现现空空隙隙，细细菌菌细细胞胞此时的状态叫做感受态。此时的状态叫做感受态。n基因工程菌基因
3、工程菌 HB101,JM109n转化转化(transformation)q制备制备感受态细胞感受态细胞 冷的氯化钙处理，细胞处冷的氯化钙处理，细胞处于最适摄取和容忍外来于最适摄取和容忍外来DNA的生理状态的生理状态n感染感染(infaction)q转导转导(transduction)：由噬菌体和细胞病毒：由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程介导的遗传信息转移过程n转染转染(transfection)：真核细胞主动摄取或被：真核细胞主动摄取或被动导入外源动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。片段而获得新的表型的过程。大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：取取100
4、ml 100 ml 感受态细胞，加入相当于感受态细胞，加入相当于50 ng 50 ng 载体的重组载体的重组DNADNA连接液，混匀连接液，混匀冰浴放置半小时冰浴放置半小时在在42保温保温 2 分钟（热激）分钟（热激）快速将转化细胞转移至冰浴中放置快速将转化细胞转移至冰浴中放置1-2分钟分钟加入加入1 ml 新鲜培养基，于新鲜培养基，于37培养培养 1 小时（扩增）小时（扩增）涂在合适的固体培养基平板上进行筛选涂在合适的固体培养基平板上进行筛选转化率转化率n转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体载体DNADNA在最佳转化条件下进入受
5、体细胞的分子数。由在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体微克载体DNADNA转化后，受体细胞接纳转化后，受体细胞接纳DNADNA的个数，即克隆的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）。数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）。转化率的影响因素：转化率的影响因素：载体及载体及DNA重组分子重组分子受体细胞受体细胞转化方法转化方法 转转化化细细胞胞的的扩扩增增操操作作是
6、是指指转转化化完完成成之之后后细细胞胞的的短短时时间间培培养养。在在实实验验时时，扩扩增增操操作作往往往往与与转转化化操操作作偶偶联联在一起，如：在一起，如：Ca2+诱导转化后的诱导转化后的37培养一个小时培养一个小时 原生质体转化后的再生过程原生质体转化后的再生过程 噬菌体转染后的噬菌体转染后的30培养等，均属扩增操作培养等，均属扩增操作转化细胞的扩增转化细胞的扩增扩增操作的目的扩增操作的目的增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选表达外源基因，便于筛选
7、和鉴定表达外源基因，便于筛选和鉴定三三 转化子的筛选和鉴定（检）转化子的筛选和鉴定（检）n遗传学方法遗传学方法q插入灭活法(insertion inactivation):抗药性标志选择q 标志补救 表达产物与营养缺陷互补 n-互补 蓝白斑筛选n免疫学方法免疫学方法n分子杂交分子杂交 q原位杂交 nPCRn限制性酶切图谱限制性酶切图谱 pBR322AmpTet插入片段插入片段插入片段插入片段AmpAmp平板平板平板平板TetTet平板平板平板平板n 抗药性筛选法抗药性筛选法n显色筛选法显色筛选法将将 外外 源源 基基 因因 克克 隆隆 在在pUC18的的lacZ标标记记基基因因内内部部，使使之
8、之插插入入失失活活，此此 时时 重重 组组 子子 呈呈 Apr、lacZ-，淡淡黄黄（白白）色色菌菌落落；而而非非重重组组子子则则呈呈Apr、lacZ+，蓝色菌落，蓝色菌落lacZoriAp+X-gal重组子（重组子（Apr+lacZ-）AppUC18n菌落噬菌斑原位杂交法菌落噬菌斑原位杂交法 菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基因或根据克隆的目的基因或DNA片段的片段的同源序列同源序列设计并合成设计并合成探针探针，以此搜寻筛选含有目的基，以此搜寻筛选含有目的基因的因的目的重组子目的重组子。其中，。其中，DNA同源序列之间同源序列之间的特异性互补
9、杂交是该技术的基本理论依据。的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据。n聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法如果待筛选鉴定的目标如果待筛选鉴定的目标蛋白既不能测定生物活蛋白既不能测定生物活性，又无现成的抗体使性，又无现成的抗体使用，则可采用聚丙烯酰用，则可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行粗略的胺凝胶电泳进行粗略的筛选筛选nDNA序列分析法序列分析法 DNA序序列列测测定定是是精精确确鉴鉴定定目目的的基基因因的的重重要要手手段段，目目前前国国际际上上流流行行采采用用Sanger发发明明的的双双脱脱氧氧末末端端终终止止法法测测定定DNA序序列列，其其工工作作原原理理是是在在DNA聚聚合合反反应应的的进进程程中中，通通过过位位点点特特异性终止测定异性终止测定DNA序列。序列。作业：n简述基因工程基本原理。n简述基因克隆的主要方法。