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1、第二章第二章 基因克隆工具酶基因克隆工具酶限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶NMPNTPdNMPdNTP一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）发现：1970年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出HindII和HindIII功能：识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链。限制性核酸内切酶的发现与应用导致了体外重组DNA技术的发展，使人们有可能将很大的DNA分子定向性地切割成较小的DNA片段，然后运用各种技术手段对其进行分析，从而能对生物体的基因结构、组织表达及进化问题进行深入的研究 来源：主要是从原核生物中分离纯化得到。到
2、目前为止，已经从近300种不同的微生物中分离出约500种限制性核酸内切酶1.限制性核酸内切酶的发现及其生物功能一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）生物学意义：限制性核酸内切酶，可以帮助细菌限制外来DNA的入侵细菌中的防卫系统：限制与修饰现象 （1）细菌在其感受态的生理条件下，很容易吸收外源DNA进入体内。这种感受态可以是人为的，也可以是在自然条件下发生的。如果细菌不加限制地接受所有的外源DNA，细菌本身就会很快发生遗传变异甚至死亡。（2）限制性核酸内切酶 （3）甲基化酶：对该特异位点的腺嘌呤A进行甲基化修饰，被修饰的DNA就不再被相应的限制酶切割了。（4）细
3、菌自身的DNA受到甲基化修饰，得以保存 （5）外源入侵的DNA未来得及甲基化，被降解 1.限制性核酸内切酶的发现及其生物功能作为分子克隆宿主菌的大肠杆菌（例如DH5），必须是 （1）rec基因缺陷型的突变体 保证必须不与同外来DNA分子发生遗传重组 （2）限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株 保证外来DNA分子不会受其限制酶的降解 一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）1.限制性核酸内切酶的发现及其生物功能2+2+2+一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）2.限制性核酸内切酶的类型主要特性限制修饰蛋白结构辅助因子识别序列I
4、 型多功能异源三聚体ATP Mg2+SAMTGAN8TGCTAACN6GTGCII 型单功能同源二聚体Mg2+旋转对称序列III 型双功能异源二聚体ATP Mg2+SAMGAGCCCAGCAG切割位点 距识别序列1kb处 识别序列内或附近 距识别序列下游随机性切割特异性切割24-26bp处SAM：S-腺苷蛋氨酸 型酶的作用方式在基因工程中具有十分重要的价值，是基因工程中常用的工具酶。型酶、型酶的使用不如型酶方便，切割方式不如型酶那样令人满意，在基因克隆中实用价值不大。一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）2.限制性核酸内切酶的类型属名种名株名Haemophil
5、us influenzae d嗜血流感杆菌d株H i n d IIIH i n d III同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）3.限制性核酸内切酶的命名H：细菌属名的头一个字母in：细菌种名的头两个字母Hin：表示了该菌的物种名称，用斜体d：代表该菌菌株名称III：表示该菌具有几个不同的限制与修饰体系，表示该酶是属于第三个限制修饰系统的酶 一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）3.限制性核酸内切酶的命名一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）4.II
6、型限制性核酸内切酶的基本特性EcoR I的切割位点EcoR I的识别序列5 G C T G A A T T C G A G 33 C G A C T T A A G C T C 5(1)识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列(2)识别序列呈典型的旋转对称型回文结构(3)大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧EcoRI等产生的5粘性末端5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5EcoRI 37 5 G-C-T-G-OH3 C-G-A-C-T-T-A-A-PP-A-A-T-T-C-G-A-G 3OH-G-C-T-C 5退火 4-
7、7 OH P5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5P OH磷酸二酯键发生水解 nick缺口 PstI等产生的3粘性末端5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5PstI 37 5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH3 C-G-A-G-PP-G-G-A-G 3OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5退火 4-7 OH P5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5P OH磷酸二酯键发生水解 nic
8、k缺口 PvuII等产生的平头末端5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5PvuII 37 5 G-C-T-C-A-G-OH3 C-G-A-G-T-C-PP-C-T-G-G-A-G 3OH-G-A-C-C-T-C 5磷酸二酯键发生水解 限制酶的识别序列与DNA的来源无关，不带有种的特征，对各种DNA都普遍适用。因此，甲种生物的DNA与乙种生物的DNA用同一种限制酶作用后，所形成的限制片段带有同样的末端，能够通过碱基的互补配对而连接起来。这是重组DNA技术的重要基础之一。根据这一特性，可以将不同来源的DNA重组成一种新的重组体分
9、子。限制酶切割DNA分子形成的短片段可以自发地重新连接成环状，这些环状分子经过加热又可以打开成线状但如果在环化后加进DNA连接酶，在DNA片段之间的接口处将形成磷酸二酯键，这是一种较强的化学结合力，形成的环形DNA将是十分稳定的，即使再加热也很难再成线状，除非再次受到限制酶的作用。这说明，DNA经限制酶切割后再通过连接酶作用，得到的连接DNA是相当稳固的，这也是分子克隆技术的重要前提。Tris-HCl50 mMMgCl2NaClDTTVolumeTT10 mM0-150 mM1 mM20-100 l37 左右，1-1.5 h（不能过长或过短）0-50 mM 低盐酶100 mM 中盐酶150 m
10、M 高盐酶1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小时，完全水解 1 g 标准DNA所需的酶量（1）大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）5.II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作（2）II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：BamHISmaI5 GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT33 CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA55 GCTACATG3 CGATGTACCTAGGATCCCGGGTTCGCAT3GGCCCAAGCGTA55
11、 GCTACATGGATCCC3 CGATGTACCTAGGGGGGTTCGCAT3CCCAAGCGTA5一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）5.II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作（3）II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切倍体积的 5 M NaAc倍体积的冰冷乙醇冰浴 5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）5.II 型限制性核酸内
12、切酶酶解反应的操作（1）DNA样品的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1 g DNA 用 10U 酶加大反应总体积延长反应时间一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）6.影响限制性核酸内切酶活性的因素655（2）DNA样品的甲基化程度：大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但BamH I、Bgl II、Sau3A I不受影响大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II等哺乳动物中的
13、甲基化酶在5CG3序列中的C5位上引入甲基一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）6.影响限制性核酸内切酶活性的因素（3）核酸内切酶的缓冲液性质：EcoR I在正常条件下识别并切割5GAATTC3序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5PuPuATPyPy3或者5AATT3一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）6.影响限制性核酸内切酶活性的因素高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Star activity现象二、DNA连接酶（DNA ligase）
14、连接酶的基本性质（1）修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键 催化5-磷酸基团和3-羟基末端之间形成磷酸二酯键 nickOH P5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5P OH nickDNA连接酶5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5二、DNA连接酶（DNA ligase）连接酶的基本性质（2）修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C 5P OHni
15、ckT4-DNA连接酶5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C 5二、DNA连接酶（DNA ligase）连接酶的基本性质（3）连接多个平头双链DNA分子：5 G-C-T-C-A-G-OH3 C-G-A-G-T-C-PP-C-T-G-G-A-G 3OH-G-A-C-C-T-C 5T4-DNA连接酶5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5二、DNA连接酶（DNA ligase）连接酶的反应条件Tris-HClMgCl2ATPDTTVolumeTT10 mM0.5-1
16、 mM5 mM10-20 l4-15 4-16 h1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 反应 1 小时，完全连接 1 g-DNA（Hind III片段）所需的酶量二、DNA连接酶（DNA ligase）3.平头双链DNA片段的连接操作从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多提高平头末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-2
17、00 mM2+三、DNA聚合酶（DNA polymerase）1.大肠杆菌DNA聚合酶 I（DNA pol I）（1）大肠杆菌DNA聚合酶 I的基本性质：53的DNA聚合酶活性 53的核酸外切酶活性 35的核酸外切酶活性3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 55 C-G-A-G-T-OHDNA pol I5 ppp dN Mg2+3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 55 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH322+32三、DNA聚合酶（DNA polymerase）1.大肠杆菌DNA聚合酶 I（DNA pol I）（2）大肠杆菌DNA聚合酶 I 的
18、基本用途：5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5DNase I5 G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5缺口前移标记法Nick translation（切口平移）制备32P标记的探针DNA pol IMg2+5 dNTP 5 ppp dA（-32P-dATP）5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5三、DNA聚合酶（DNA polymerase）2.大肠杆菌DNA聚合酶
19、 I 大片段（Klenow）（1）Klenow酶的基本性质：大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即为Klenow酶Klenow酶仍拥有53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性，但失去了53的核酸外切酶活性三、DNA聚合酶（DNA polymerase）2.大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（Klenow）（2）Klenow酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的5粘性末端DNA片段的同位素末端标记cDNA第二链的合成双脱氧末端终止法测定DNA序列三、DNA聚合酶（DNA polymerase）2.大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（Klenow）5 G-C-T-G
20、-OH3 C-G-A-C-T-T-A-A-PKlenow5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH3 C-G-A-C-T-T-A-A-PP-A-A-T-T-C-G-A-G 3OH-G-C-T-C 5dATP dTTPP-A-A-T-T-C-G-A-G 3OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5（2）Klenow酶的基本用途1：补平由核酸内切酶产生的5粘性末端32（2）Klenow酶的基本用途2：DNA片段的同位素末端标记5 G-C-T-G-OH3 C-G-A-C-T-T-A-A-PKlenow5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH3 C-G-A-C-T-T-A-A-PP-A-A-T-T-C-G
21、-A-G 3OH-G-C-T-C 5-32P-pppdA dTTPP-A-A-T-T-C-G-A-G 3OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5三、DNA聚合酶（DNA polymerase）2.大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（Klenow）三、DNA聚合酶（DNA polymerase）聚合酶（1）T4-DNA酶的基本特性：53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性在无dNTP时，可以从任何3-OH端外切在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位三、DNA聚合酶（DNA polymerase）聚合酶5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH3
22、 C-G-A-G-PT4-DNA聚合酶5 G-C-T-C-OH3 C-G-A-G-PP-G-G-A-G 3HO-A-C-G-T-C-C-T-C 5P-G-G-A-G 3HO-C-C-T-C 5注意：该酶也能降解双链DNA，只是其活性比单链降解活性低很多（2）T4-DNA聚合酶的基本用途1：切平由核酸内切酶产生的3粘性末端2+32（2）T4-DNA聚合酶的基本用途2：DNA片段的同位素末端标记5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5T4-DNA pol5 G-C-T-C A-G-C-T-G-OHHO-T-C-G-A-C-
23、C-T-C-A 5T4-DNA polMg2+5 ppp dN 5 ppp dA（-32P-dATP）5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5三、DNA聚合酶（DNA polymerase）聚合酶2+三、DNA聚合酶（DNA polymerase）4.依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）3AAAAAAAAAAAAAA5TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-185mRNA反转录酶3AAAAAAAAAAAAAA5TTTTTTTTTTTTTTMg2+dNTP5mRNA3cDNA（1）反转录酶的基本特性：以RNA为
24、模板合成cDNA链（2）反转录酶的基本特性：双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链53335反转录酶反转录酶3 RNA3 RNA5 DNA5 DNA5 DNA三、DNA聚合酶（DNA polymerase）4.依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）2+四、核酸酶（nuclease）1.单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）5353ExoVII3535大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+2+四、核酸酶（nuclease）2.双链核酸外切酶：核酸外切酶 III（ExoIII）大肠杆菌的核酸外切酶 III 特异性地从3 端外切535ExoVII3Mg2+33552+四、核酸酶（nuc
25、lease）2.双链核酸外切酶：核酸外切酶（Exo）核酸外切酶特异性地从5 端外切533Exo5Mg2+53532+四、核酸酶（nuclease）3.单链核酸内切酶：S1核酸酶（1）S1核酸酶的基本特性：来自米曲霉（Aspergillus oryzae）降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍Zn2+必需最适pH范围为需要NaCl 10-300 mM降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍2+（2）S1核酸酶的基本反应：内切单链DNA或RNA5 G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T 3S15 G-C-T-C-A-G-C-T-CZn2+T-T-G-A
26、-G-G-A-G-T 35 G-C-T-CA-G-C-T-CT-T-G-A-GG-A-G-T 35 dNMPs 或 5 NMPs四、核酸酶（nuclease）3.单链核酸内切酶：S1核酸酶S1Zn2+2+（2）S1核酸酶的基本反应：内切带缺口或缺刻的双链DNA或RNAnick5 G-C-T-C-A-G C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 55 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 35 G-C-T-C-A-G3 C-G-A-G-T-CT-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-CA-C-C-T-C-A 5gapA-C-C-T
27、-C-A 5四、核酸酶（nuclease）3.单链核酸内切酶：S1核酸酶（3）S1核酸酶的重要用途：在DNA上定位RNA（S1 mapping）DNAEcoRI杂交S1mRNA四、核酸酶（nuclease）3.单链核酸内切酶：S1核酸酶4.单链内切、双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶（1）Bal31核酸酶的基本特性：来自艾氏交替单胞菌（）ssDNA or RNACa2+Ca2+Ca2+5 dNMPs 或 5 NMPs四、核酸酶（nuclease）A4.单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶（2）Bal31核酸酶的基本用途：诱发DNA突变C环化EcoRIEcoRIBCAEcoRIBal31B
28、CABCA四、核酸酶（nuclease）2+五、核酸修饰酶（Nucleic Acid modification enzymes）1.末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）（1）TdT的基本特性：来自小牛胸腺不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs5 p3 HOp 5OH3TdTMg2+dATP5 p3 HOp 5AAAAAAAAAAAA OH32+2+TdT的基本特性：5 p3 HOOH 3p 5TdTCo2+dATP5 p3 HO AAAAAAAAAAA5 p3 HOOH 3AAAAAAAAAA OH 3p 5p 55 p3 HO AAAAAAAAAAATdTCo2+dATPAAAAAAAAAA
29、AAAA OH 3p 5五、核酸修饰酶（Nucleic Acid modification enzymes）2.碱性磷酸单酯酶：只能水解磷酸单酯键，但不水解磷酸二酯键 来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIP）来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAP）作用：催化核酸分子脱掉5磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5-P末端转换成5-OH末端，在分子克隆中的作用是为了防止粘性末端之间的自连。5 pOH 35 HOOH 3DNA or RNABAP/CIP5 ppp dN5 pppN5 HO dN5 HO N2+32五、核酸修饰酶（Nucleic Acid modification enzymes）多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）T4-PNP的基本特性：催化ATP的g-磷酸基团转移至DNA或RNA的5-OH末端上作用：用于探针的末端同位素标记5 HOOH 33 HOOH55 p3 HOT4-PNPMg2+pppATP（-32P-ATP）OH 3p 5实验技术核酸凝胶电泳结果处理软件quantity one