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1、 一、活细胞的观察检测方法一、活细胞的观察检测方法 肉眼观察 相差显微镜观察 细胞在体外培养过程中需要每天观察，以便及时细胞在体外培养过程中需要每天观察，以便及时了解细胞生长状态、数量改变、细胞形态、细胞有了解细胞生长状态、数量改变、细胞形态、细胞有无移动、有无污染、培养液无移动、有无污染、培养液pHpH是否变酸、变黄、是是否变酸、变黄、是否更换等。否更换等。细胞常规检查的方法为：细胞常规检查的方法为：肉眼观察肉眼观察 一般常规检查用肉眼即可观察，主要看培养液的颜色和透明度的变化。pH pH 颜色颜色 透明度透明度 正常正常 7.4 7.4 桃红色桃红色 清亮、透明清亮、透明酸性产物酸性产物
2、变浅、变黄变浅、变黄 污染污染 混浊混浊 变黄变黄 pH pH pHpH 变红变红生长良好的细胞，在显微镜下可观察到细胞透明度大，折光性强，轮廓不清。若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，细胞胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物。细胞的生长状态细胞的生长状态BMSC(bone marrow stromal cells 骨髓基质细胞)Anip973（肺癌细胞）二、细胞计数计数方法有计数方法有血细胞计数板人工计数；血细胞计数板人工计数；细胞计数器自动计数法细胞计数器自动计数法 三
3、、细胞生长曲线细胞生长曲线细胞生长曲线(cell growth curve)是观测细胞在一代生存期内的增生过是观测细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标程的重要指标,可用来分析细胞的增可用来分析细胞的增殖速度，确定细胞进行传代及冻存操殖速度，确定细胞进行传代及冻存操作的最佳时间。作的最佳时间。How to make cell growth curve?首先在培养板的首先在培养板的21个孔内分别接种相个孔内分别接种相同数量的细胞。计数并记录接种的细同数量的细胞。计数并记录接种的细胞悬液之密度。接种时间记为胞悬液之密度。接种时间记为0h 每隔每隔24h计数计数3孔孔(瓶瓶)内的细胞密度，内的细胞密
4、度，算出平均值。如此操作至第七天结束。算出平均值。如此操作至第七天结束。以培养时间为横坐标、细胞密度为纵以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标，将结果在坐标纸上绘图，即得坐标，将结果在坐标纸上绘图，即得四、体外活体染色观察体体外外活活体体染染色色是是在在体体外外条条件件下下用用某某种种染染色色剂剂对对活活的的组组织织或或细细胞胞进进行行染染色色，而不影响活细胞的生命活动方法。而不影响活细胞的生命活动方法。原原理理：一一般般的的生生物物材材料料不不能能穿穿透透细细胞胞膜膜，只只有有当当细细胞胞被被固固定定后后，细细胞胞膜膜被被破破坏坏，染染料料才才能能进进入入细细胞胞内内部部。但但活活体体染染料料
5、却却能能进进入入活活细细胞胞，它它们们是是一一些些无无毒毒或或毒毒性性很很小小的的染染色色剂剂，能能使使细细胞胞中中某某些些特特定定结结构构着着色色。活活体体染染料料基基本本上不影响细胞的生命活动。上不影响细胞的生命活动。1.活体染料的类别活体染料的类别 碱碱性性活活体体染染料料：詹詹纳纳斯斯绿绿，中中性性红红，次甲基蓝、甲苯胺蓝、亮焦油紫等次甲基蓝、甲苯胺蓝、亮焦油紫等酸性活体染料：台盼蓝，刚果红酸性活体染料：台盼蓝，刚果红 2.台盼蓝排除检测法台盼蓝排除检测法台盼蓝溶液的配制：台盼蓝溶液的配制：称取称取g台盼蓝台盼蓝(trypan blue)，加少量双，加少量双蒸水研磨粉碎后，再加水至蒸水
6、研磨粉碎后，再加水至50m1，离心后取上清液，再加入离心后取上清液，再加入NaCl溶溶液至液至100ml，即成。，即成。染色步骤染色步骤1)吸去培养液，洗涤。吸去培养液，洗涤。2)加入活体染料，加入活体染料，2min后观察。后观察。3)在显微镜下观察在显微镜下观察4)倾去染液。洗涤。倾去染液。洗涤。5)加入培养液。继续培养。加入培养液。继续培养。活细胞染料排除检测法 由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，某些染料可大量进入而使细胞呈色。某些染料可大量进入而使细胞呈色。镜下，死细胞呈淡蓝色，活细胞不染镜下，死细胞呈淡蓝色，活细胞不染色。色。注意事项注意事项:细胞悬液
7、放置时间过长细胞悬液放置时间过长,正常细胞可摄正常细胞可摄取染料取染料,从而影响染色结果从而影响染色结果 一一.填空题填空题1血细胞计数板：有不同的型号，常用的是改良的纽巴氏血细胞计数板：有不同的型号，常用的是改良的纽巴氏(Neubauer)血细胞计数板。纽巴氏血细胞计数板有两个计算室，血细胞计数板。纽巴氏血细胞计数板有两个计算室，各室划分为各室划分为-个大格，每个大格的平均面积为个大格，每个大格的平均面积为-。计算室上。计算室上方盖上血细胞计数板专用的盖玻片后，室的深度则为方盖上血细胞计数板专用的盖玻片后，室的深度则为-mm。用于血细胞计数时，白细胞用。用于血细胞计数时，白细胞用-，红细胞用
8、，红细胞用-。2体外活体染色就是在体外活体染色就是在-条件下用某种染色剂对条件下用某种染色剂对-进行进行染色，而不影响活细胞的生命活动的一种方法。利用这种方法，可染色，而不影响活细胞的生命活动的一种方法。利用这种方法，可以对培养物进行染色观察，经染色的培养物还可以继续进行培养。以对培养物进行染色观察，经染色的培养物还可以继续进行培养。二二.名词解释名词解释细胞生长曲线细胞生长曲线 三三.简答题简答题1简述制作细胞生长曲线的过程。简述制作细胞生长曲线的过程。2简述活体染料的染色步骤简述活体染料的染色步骤3简述活细胞的染料排除检测法的原理及台盼蓝排除检测法的操简述活细胞的染料排除检测法的原理及台盼蓝排除检测法的操作过程作过程4简述用细胞计数板计数细胞的操作程序及注意事项：简述用细胞计数板计数细胞的操作程序及注意事项：