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1、生物选修 3 知识点（区别不同工程和不同操作水平）专题 1 基因工程概念：按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基本原理：让目的基因在受体细胞内稳定且高效的表达理论基础：DNA是生物遗传物质的发现，DNA双螺旋结构，遗传信息传递方式核心：构建重组DNA分子（一）基本工具（技术基础）Cf 工具&工具酶1.限制性核酸内切酶（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的（不切割自身DNA的原因：原核生物中无该限制酶的识别序列或其已被修饰）（2）功能：识别和切割DNA分子内一小段特殊的脱氧核苷酸序列（偶数碱基对
2、回文序列）特异性表现：识别特定片段、切割该片段中的特定位点、形成一种末端 Cf GGATCC&GATC（3）结果：DNA片段末端形成末端碱基互补的黏性末端或平末端用切割（质粒）根据目的基因的位置或剪辑序列来确定限制酶的种类切割后的片段要画全2.DNA连接酶（1）功能：连接具有末端碱基互补的2个 DNA片段，形成重组DNA分子 Cf DNA 聚合酶：只能将单个脱氧核苷酸逐个添加到已有的脱氧核苷酸链之后，需模板 DNA，连接磷酸二酯键3.载体（1）条件：能在受体细胞中稳定保存并大量复制，基本不影响受体细胞正常生命活动一至多个限制酶酶切位点（必须在所需标记基因外），供外源DNA片段插入标记基因，便于
3、筛选含有重组DNA分子的受体细胞往往需要根据需求改造天然载体（2）功能：作为运载工具将目的基因转移到受体细胞内载体选质粒的原因：具有环状结构，能够携带目的基因利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制和转录/表达（3）质粒（最常用的载体）一种能够自主复制，在细菌(或酵母菌)中独立于染色体之外存在的双链环状DNA分子（4）其它载体：噬菌体、动植物病毒(二)基因工程的基本操作程序第一步：获取目的基因1.目的基因：人们所需要的编码蛋白质的结构基因2.方法(1)序列已知化学合成法较长 DNA单链合成过程中容易出现碱基缺失如 反转录法（e.g 获取 mRNA 逆转录成cDNA再用 DNA聚合酶生成双链）聚
4、合酶链式反应(PCR)扩增Polymerase Chain Reaction（1）原料：水、缓冲液、4 种游离脱氧核苷酸、TaqDNA聚合酶、模板DNA(基因)、对基因特异的2 段 DNA引物（防止相互或自身折叠）（2）过程：第一步：加热至9095，DNA在高温下变性解链第二步：冷却到5560，引物结合到互补DNA链（退火）第三步：加热至7075，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成能量来源于dNTP(2)序列未知建立基因文库：建立一个包括目的基因在内的基因文库(保存在受体菌中)，再从基因文库中获取3.目的基因大量扩增/分子水平的克隆利用受体细胞（如E.coli）无性繁殖，利用基因探针钓取
5、，再导入最终受体细胞 e.g目的基因大肠杆菌农杆菌植物细胞植物（主要在细菌分裂时几何级扩增，尽管质粒独立于拟核，可在分裂时发生自我复制，但由于多数细菌对胞内质粒数量有限制，故该种复制对扩增效果不大）PCR技术第二步：形成重组DNA分子（基因表达载体：启动子目的基因终止子标记基因）1.目的：转运目的基因，并使在受体内稳定存在、复制、表达/转录并稳定遗传（基因型X0）2.过程：（1）单酶切：用同种限制酶分别切割目的基因和载体从而形成相同的粘性末端，然后用 DNA连接酶将目的基因和载体连接起来有时用不同限制酶也可以形成相同的粘性末端（2）双酶切：用两种限制酶切割使目的基因和载体两端各形成两种粘性末端
6、，防止载体和目的基因自身环化第三步：将重组DNA分子导入受体细胞需将目的基因整合到动植物细胞的染色体DNA上目的基因是否整合到染色体DNA上决定于基因表达载体上是否有相关序列（形成酶）1.植物体细胞：农杆菌转化法（插入Ti 质粒上的T-DNA），基因枪法、花粉管通道法导入叶绿体DNA中，由于细胞质/器 DNA的遗传与性别相关联，故可避免因花粉传播而造成 基因污染（目的基因传播到非转基因生物中）2.动物受精卵：显微注射技术用（如显微注射）技术/方法将目的基因导入cf 转基因/基因工程技术3.原核细胞：CaCl2/Ca2+处理法（先用 Ca2+处理增加细胞壁通透性，使之成为感受态细胞，再将重组质粒
7、与感受态细胞混合，在一定温度下感受态细胞吸收DNA分子）原核生物作为受体细胞的原因：繁殖快体积小新陈代谢旺盛（目的产物合成效率高）遗传物质少（便于操作）、单细胞（容易培养）第四步：筛选含有目的基因的受体细胞1.原因：受体细胞接纳重组DNA分子存在概率2.原理：载体如质粒上的抗性基因等标记基因3.方法：利用选择培养基筛选蔗糖转运蛋白：仅以蔗糖作为碳源的培养基菌落表现型：抗不抗第五步：目的基因的检测和表达目的基因导入受体细胞可能仅进行大量扩增，但不一定以此为目的1.DNA/核酸分子杂交技术用 cDNA作为探针与从受体细胞中提取并解旋的DNA/mRNA 杂交，观察是否会出现杂交带检测染色体DNA上是
8、否插入了目的基因目的基因是否转录出了mRNA 一种基因探针只能检测水体中的一种病毒；检测病毒可对照核酸序列放射性同位素标记探针 基因探针 是一小段 cDNA，可以与相应基因转录出的mRNA 结合（即使被切割）采用 DNA分子杂交技术/方法，用基因探针检测 2.抗原抗体杂交：目的基因是否翻译成蛋白质如 E.coli合成人胰岛素原3.个体水平的鉴定：如转基因抗虫植物（让害虫吞食该转基因棉植株的叶片，观察害虫存活情况，以确定其是否具有抗虫形状）根本原因：联系基因层面，cf 基因序列&碱基对/脱氧核苷酸序列（三）基因工程的应用1.动植物基因、细胞工程：优点 所需时间短克服远缘杂交不亲和的缺陷（对应传统
9、缺点）2.基因工程药物：首次是生长素释放抑制激素，然后胰岛素（E.coli产酶原）、干扰素等干扰素：我国第一个基因重组新药。一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。具有抗病毒、抗细胞分裂、免疫调节等多种生物学功能，是治疗病毒性肝炎和肿瘤的药物。干扰素是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞（NK 细胞）、巨噬细胞和T 淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。3.基因治疗：将正常功能的外源基因导入缺陷细胞内（初级实验阶段、未临床实践
10、）Cf 有基因缺陷的染色体/DNA分子上：具体与哪条DNA分子结合随机治疗隐性遗传病（正常基因相对缺陷基因呈显性）4.安全性问题：在导入目的基因的同时可能会导入其他基因如抗生素抗性基因，可能会使人体内细菌抗药性增强，以致某些药物的药效减弱（四）蛋白质工程的概念蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）转录翻译专题 2 细胞工程（一）克隆1.克隆 clone：无性繁殖系（只由一个模板分子、母细胞或母体直接形成新一代）2.克隆技术c
11、loning：从众多基因或细胞群体中通过无性繁殖和选择获得目的基因或特定类型细胞的操作技术3.内容：（1）分子水平：基因克隆即目的基因的复制（受体细胞的无性繁殖）、分离（特定基因探针选择、钓取目的基因）过程（2）细胞水平：杂交瘤制备单克隆抗体（3）个体水平：不通过两性细胞的结合，从一个单一（体）细胞繁殖出生物个体胚胎细胞克隆以胚胎/卵细胞作为供体、利用核移植，不是严格意义上的动物个体克隆4.条件：（1）理论条件：细胞全能性/细胞有发育成完整个体的全套遗传物质（根本原因）（2）基本条件：具有包含物种完整基因组的细胞核的活细胞具有能有效调控细胞核发育的细胞质物质 e.g去核卵细胞完成胚胎发育的必要
12、的环境条件 e.g 胚胎早期培养环境/子宫5.非正面影响：丰富生物多样性，促进生物进化，维护生态平衡（二）植物克隆1.全能性表达的难易程度：受精卵生殖细胞胚胎/全能干细胞多能（干）细胞专能（干）细胞体细胞；生殖细胞在一定刺激下染色体可加倍；一些动物存在孤雌生殖植物细胞动物细胞；低等动物高等动物不同种类植物或同种植物的不同基因型个体间全能性的表达程度大不相同长期培养后的全能性下降原因：染色体畸变、核变异、非整倍体产生；细胞或组织中激素平衡被打破；细胞对外源生长物质的敏感性改变；形成缺乏成胚性的细胞系植株在多次继代培养后，会逐渐丧失细胞全能性的表达能力2.植物组织培养（植物克隆的技术基础）（1）理
13、论基础：植物细胞全能性，即植物体的每个生活细胞都具有遗传上的全能性，因而都具有发育成完整植株的潜能（2）过程：离体植物细胞、组织或器官（外植体）获得愈伤组织诱导形成试管苗新植株外植体选取形成层(分生组织)部分易于诱导形成愈伤组织 A.培养条件：首先是离体培养(生物体内细胞中基因在特定时间和空间条件下选择性表达，细胞分化为不同组织、器官，故无法表现出全能性)半/固体培养基（固体为例）a.营养物质：水、无机盐、蔗糖、维生素、有机添加剂(氨基酸、琼脂凝固剂等)b.植物激素/生长调节剂（适当 浓度配比 诱导分化出芽/根的顶端分生组织/花）IAACTK诱导外植体脱分化形成愈伤组织 c.无菌条件（外植体7
14、0%酒精消毒、器械高温蒸汽灭菌）杂菌争夺产毒 d.适宜的 pH、温度和渗透压 B.光照：若外植体是（带叶）茎段，不经历脱分化再分化，组培全过程均需要光照；若外植体是非光合作用部位（如胡萝卜块根），再分化成芽后光照 C.试管苗移栽前需炼苗（草炭土/蛭石，逐渐降湿）D.愈伤组织：排列疏松的高度液泡化的活的薄壁组织团外植体愈伤组织摇床液体悬浮培养分散成单细胞胚状体人工种子单细胞植物克隆，类似受精卵的卵裂、分化、器官发生、形态建成 A.单细胞：细胞质丰富、液泡小、细胞核大（胚性细胞特征）酶解细胞壁原生质体培养新植株（2）用途：微型繁殖、制造人工种子(胚状体阶段)、单倍体育种、作物脱毒（植物分生组织细胞
15、，分裂旺盛病毒极少Cf 抗病毒）、在培养基中加入不同浓度的氯化钠溶液，可诱发和筛选抗盐植株细胞产物工厂化生产（愈伤组织阶段已可，试管培养苗、细胞培养反应器也可）3.原生质体融合/植物体细胞杂交（不同植物）获得原生质体：在甘露醇溶液环境（较高渗透压）中用纤维素酶和果胶酶混合液处理用网筛过滤原生质体到离心管内，离心后收集沉淀物，用等渗溶液洗涤；检验原生质体是否符合要求：依据渗透作用原理，采用低渗胀破法（见比较表格）4.植物细胞工程：培养植物细胞（包括原生质体），借用基因工程技术将外源DNA导入受体细胞或通过细胞融合将不同源的遗传物质重新组合，再通过细胞培养，获得具有特定性状的植株 Cf 细胞工程：
16、细胞培养和细胞融合（若基因型不同为细胞杂交）基因定位：利用细胞杂交中染色体丢失与特定基因产物的对应关系（三）动物细胞工程1.动物细胞培养指明“动物”细胞培养（1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。原理：细胞增殖（2）动物细胞培养：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）机械消化或用胰蛋白酶 处理分散成单个细胞（利于细胞与培养液充分接触，进而吸收氧气和营养物质并排出废物）制成细胞悬液转入细胞培养瓶/卡式瓶中进行原代培养细胞间相互依存，呈现一定程度的组织特性，保持生长分裂、接触抑制、衰老死亡贴满瓶壁的细胞用胰蛋
17、白酶 处理使贴壁细胞从瓶壁上脱落下来并分散成单个细胞稀释分装传代培养（最初的若干次传代也归入原代培养）大多数细胞最终衰老、凋亡（营养物质耗尽遗传物质没变，衰老凋亡）动物组织培养：动物组织在体外及人工条件下维持生活状态或生长特性可伴随组织分化，但主要的生命活动仍以细胞为单位；由于细胞运动变化，培养物组分发生变异，长期培养最终成为简单的细胞培养（3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。（4）动物细胞培养条件（液体培养基）无菌无毒：培养液和用具无菌处理，一定量的抗
18、生素（种、量），定期更换培养液营养：水无机盐、葡萄糖、氨基酸、维生素、动物（胎牛）血清、滋养细胞、激素Cf 天然(血清)和人工配制成分适宜渗透压、温度、pH（CO2培养箱：维持适宜的pH值 7.2 7.4）提高形成率的措施：选择适宜的培养基和CO2、pH 胰岛素等激素刺激添加血清滋养细胞支持生长(经射线照射本身失去增殖力的小鼠成纤维细胞)（5）细胞系：可连续传代的细胞（首次传代细胞即成为细胞系）连续细胞系 e.g异倍体恶性（致癌）/不死性（保留接触抑制，不致癌）有限细胞系 e.g二倍体细胞 传代培养的原因：细胞密度过大代谢消耗引起营养枯竭细胞株：特殊的细胞系（6）细胞克隆/克隆培养法：定义：把
19、一个单细胞从群体中分离出来单独培养，使之繁衍成一个新的细胞群体特点：细胞群体来自于同一个细胞(否则具有异质性)，遗传性状均一，表达性状相似要求：最基本：分离出来的细胞是一个而非多个一般选择连续细胞系：对培养环境有较大适应范围并具有较强独立生存能力用途：从普通细胞系中分离出缺乏特殊基因的突变细胞系2.动物体细胞核移植技术和克隆动物动物难以克隆的根本原因：细胞分化过程中细胞质中的调节蛋白关闭了核中与个体发育有关的基因，使基因选择性表达，基因组中基因活动不完全（1）原理：动物细胞核的全能性（2）供核细胞：优良动物的传代培养10 代以内的细胞后代性别由核供体动物个体的性别决定受体细胞：去核的MII 中
20、期的卵母细胞 细胞较大，容易操作细胞质营养丰富，具有调控细胞核发育、促进核基因表达的物质（3）体细胞核移植的大致过程是：显微操作去核法多莉羊的成功说明：高度分化细胞经过一定技术处理，也可以回复到类似受精卵时期的功能在胚胎和个体发育中，细胞质具有调控细胞核发育的作用无法培育出相同个体/克隆动物的 基因来源：受体细胞的细胞质基因控制性状表达细胞分裂中基因突变环境因素3.动物细胞融合比较项目细胞融合的原理融合前处理诱导手段应用植物体细胞杂交细胞膜流动性植物细胞全能性获得原生质体（1）物理：离心、电刺激、振荡（2）化学：聚乙二醇克服了远缘杂交的不亲和性研究质遗传动物细胞融合细胞膜流动性细胞增殖细胞分散
21、（1/2）植物物化手段（3）灭活的仙台病毒制备单克隆抗体细胞融合时可出现多种杂种细胞专题 3 胚胎工程胚胎工程是指对动物早期胚胎或配子（针对胚胎发育过程）所进行的多种显微操作和处理技术；研究对象主要限定于高等脊椎动物，尤其是哺乳动物；重点内容包括胚胎移植、体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞培养等。（一）动物胚胎发育的基本过程1、受精作用：成熟的精卵融合成为受精卵的过程（获能精子+减 II中期的成熟卵细胞）过程：精卵识别、精子附着于卵膜、精卵质膜融合受精时精卵质膜融合后，次级卵母细胞才最终完成减II，精卵核融合场所：输卵管上段2、胚胎发育：受精卵发育到幼体胚后发育：出生到性成熟个体发育：受精卵发育到
22、性成熟3、动物胚胎发育的基本过程（1）卵裂期（28）：细胞数量增加，有机物总量/总体积减小，每个细胞都具有全能性，未出现细胞分化，每个细胞都能发育成完整新个体（2）桑椹胚（1632）（3）囊胚/胚泡：细胞开始分化，形成滋养层（胚胎附属结构/胚外结构）和内细胞团（胚胎干/ES 细胞，发育全能性），之间为囊胚腔注意题目要求填写滋养层细胞还是滋养层（4）原肠胚：三胚层分化，其将分化成各种器官原基；哺乳动物胚胎有机物总量增加（胚泡期已着床），其他动物有机物减少 PS 早期胚胎（桑葚胚和早期囊胚）（二）胚胎干细胞1、哺乳动物胚胎干细胞来源于囊胚内细胞团（ES）或胎儿的原始性腺（EK）2、形态特征：具有胚
23、胎细胞的特性，体积小，核大，核仁明显，二倍体核型功能特征：具有发育全能性3、胚胎干细胞体外培养：分离早期胚胎中的内细胞团；胰酶处理解离培养饲养层（胚胎成纤维细胞）：促进生长，抑制分化4、胚胎干细胞的主要用途是：基因敲除；用分化诱导因子诱导胚胎干细胞定向分化，组织器官移植；治疗人类的某些顽疾，修复坏死或退化的部位；胚胎干细胞核移植，经胚激活、胚胎培养、胚胎移植；改良和创造动物新品种（三）胚胎工程的应用1.体外受精 (1)卵母细胞的采集和培养：卵巢经促性腺激素处理超数排卵，使用超声监视器确定卵泡位置，插入穿刺针吸取卵泡液，取出 卵母细胞（各阶段卵母细胞均有可能）体外培养至成熟（减II中）(2)精子
24、的采集和获能（获得能与卵细胞结合的能力）：获能液由相关物质组成非 ATP (3)受精：获能精子 和成熟卵细胞 在体外合适环境中共同培养 试管动物/珍稀动物保护（体外受精）Cf克隆动物（核移植）2.胚胎体外培养：（1）由于胚胎不同发育时期生理代谢需求不同，需配制一系列含有不同成分的培养液；由于哺乳动物胚胎发育条件复杂，尚不能实现胚胎全体外培养（2）目的：检测受精状况和受精卵的发育能力（3）培养液成分：水、无机盐、有机盐、维生素、激素、氨基酸、核苷酸、动物血清（4）胚胎去向：胚胎移植液氮冷冻保存3.胚胎移植胚胎可能来自受精卵/核移植/胚胎分割；8 细胞期之后 (1)供体：经济价值高、遗传性状优良受
25、体：同种生理状态相同/同期发情但未配种常见或存量大具有健康体质和正常繁殖能力 (2)胚胎移植的意义：大大缩短供体的繁殖周期，充分发挥雌性优良个体的繁殖能力 (3)生理学基础：动物发情排卵后，同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的。早期胚胎在一定时间内处于游离状态。（胚胎收集）受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应。（胚胎存活）若同种不需接受免疫检查，若不同种需要供体胚胎与受体建立生理联系（仅提供胚胎发育场所），但其遗传特性不受影响 (4)基本程序主要包括：对供、受体的选择和处理：同期发情处理（激素处理）：供体促性腺激素，受体前列腺素或孕酮超数排卵：供体促性腺激素配种或人工授精胚胎收集
26、、检查、培养或保存：冲卵（早期胚胎）胚胎移植到受体的相应部位（输卵管/子宫角）移植后检查小型动物：促性腺激素处理，排卵后直接从输卵管中冲取卵子，直接参与体外受精；早期胚胎之前的阶段即可移植大型动物：从活体卵巢中吸取卵母细胞，经体外培养成熟后参与体外受精；胚胎发育到桑椹胚或囊胚阶段才能进行移植4.胚胎分割（无性繁殖）(1)意义：快速繁殖良种畜 (2)材料：早期胚胎 (3)操作过程（囊胚为例）：(1)用 切割针/刀将内细胞团均等分割（否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育）采用 酶处理 将卵裂球中的细胞分散开 (2)分割的胚胎/细胞直接移植或 体外培养至囊胚阶段再移植HGP Human Genome Project