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1、第四章 分子荧光分析第一节 基本原理1、激发光谱曲线和荧光光谱曲线 固定测量波长为荧光最大发射波长，然后改变激发波长，根据所测得的荧光（磷光）强度与激发光波长的关系，即得激发光谱曲线 固定激发光波长为其最大激发波长，然后测定不同的波长时所发射的荧光或磷光强度，即得荧光或磷光光谱曲线1）荧光发射光谱的形状与激发波长无关2）Stokes位移2、荧光发射光谱的特性3）镜像规则 3、荧光效率与荧光分子结构的关系荧光效率荧光效率 (荧光量子产率荧光量子产率)F F越大越大，化合物的荧光越强化合物的荧光越强。有有分分析析应应用用价价值值的的荧荧光光化化合合物物,其其荧荧光光量量子子产产率率通通常常在在 1
2、 之间之间F F=发射的光子数发射的光子数吸收的光子数吸收的光子数kfkf +k 1 1 kf：辐射跃迁的速率常数：辐射跃迁的速率常数 k：各种非辐射跃迁过程的速率常数之和：各种非辐射跃迁过程的速率常数之和=从分子结构来说,绝大多数能发荧光的物质为含有低能的*跃迁能级的芳香环或杂环化合物1)共轭效应电子的共轭程度越大，就越容易被激发,分子的荧光效率越大,而且其最大荧光波长也会相应地“红移”向长波长方向移动2)刚性结构和共平面效应给电子取代基给电子取代基,产生产生n-共轭效应共轭效应,加强荧光。加强荧光。3)取代基的影响a.吸电子取代基吸电子取代基,会使荧光减弱会使荧光减弱,如硝基苯无荧光。如硝
3、基苯无荧光。4)化学环境对荧光的影响温度：温度：温度越低，温度越低，F F越大越大5)5)溶剂溶剂6)pH值的影响值的影响 4、荧光的猝灭荧光物质的分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用，引起其荧光强度降低，消失或荧光强度与浓度不呈线性关系的现象原因：原因：猝灭剂分子与荧光物质发生化学反应猝灭剂分子与荧光物质发生化学反应 溶解氧的存在溶解氧的存在:氧化荧光物质氧化荧光物质自猝灭自猝灭:高浓度时发生高浓度时发生(自碰撞失活自碰撞失活)第二节 荧光分光光度计第三节 分子荧光分析法的应用Zhao,et al.JACS,2003,125,11474 Fluorescence基于硅纳米球的DNA分析技术loopstem“分子信标分子信标”的检测原理的检测原理应用：实时定量荧光PCR探针与DNA杂交时产生荧光 -变性过程：产生非特异性荧光 -退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号 -延伸过程：不产生荧光新型纳米荧光材料量子点(quantum dots,QDs)Goldman,et.al.Anal.Chem.2004,76,684-688.