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1、课题课题3 3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离(一一)蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理一一.基础知识基础知识根据蛋白质各种特性的差异：根据蛋白质各种特性的差异：分子的形状、大小分子的形状、大小电荷性质和多少电荷性质和多少溶解度溶解度 吸附性质吸附性质对其他分子亲和力对其他分子亲和力 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？何种作用，作用结果是什么被破坏？变性、变性、空间结构变性、变性、空间结构 人们用鸡的红细胞提取人们用鸡的红细胞提取DNADNA，用人的红，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？细胞提取血红蛋白的
2、原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNADNA，便于进行便于进行DNADNA的提取，人的红细胞无细胞的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白取血红蛋白（二）蛋白质提取和分离的方法（二）蛋白质提取和分离的方法凝胶色谱法：凝胶色谱法：又称分配色谱法又称分配色谱法电泳法电泳法1.1.凝胶色谱法凝胶色谱法2 2）材料：凝胶）材料：凝胶(分配色谱法分配色谱法)1 1）概念）概念 根据根据相对分子质量的大小相对分子质量的大小分离蛋白质的分离蛋白质的有效方法有效方法 凝胶是凝胶是微小的多孔性球体微小的多孔性球体，
3、如，如葡聚糖葡聚糖或琼脂糖或琼脂糖。内部有许多贯穿的。内部有许多贯穿的通道通道。3.3.凝胶色谱法的原理凝胶色谱法的原理分子筛效应分子筛效应 大分子大分子大分子大分子通过多孔凝胶颗粒的通过多孔凝胶颗粒的通过多孔凝胶颗粒的通过多孔凝胶颗粒的间隙间隙间隙间隙，路程，路程，路程，路程短短短短，流动，流动，流动，流动快快快快；小分子小分子小分子小分子穿过多孔凝胶颗粒的穿过多孔凝胶颗粒的穿过多孔凝胶颗粒的穿过多孔凝胶颗粒的内部内部内部内部，路程，路程，路程，路程长长长长，流动，流动，流动，流动慢慢慢慢。凝凝胶胶色色谱谱柱柱洗脱：洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差
4、速流动。液，促使蛋白质分子的差速流动。2.2.电泳电泳1)1)概念概念带电粒子在电场作用下发生迁移的过程带电粒子在电场作用下发生迁移的过程2)2)原理原理 利用了待分离样品中各分子利用了待分离样品中各分子带电性质带电性质的的差异以及分子本身的差异以及分子本身的大小、形状大小、形状的不同，的不同，使带电分子产生不同的使带电分子产生不同的迁移速度迁移速度，从而实，从而实现样品中各种分子的分离。现样品中各种分子的分离。3)3)类型类型:琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳4)4)实例：实例：SDSSDS聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳用途用途:测定蛋白质的分子量测定蛋
5、白质的分子量 鉴定蛋白质的纯度鉴定蛋白质的纯度原理：原理：SDSSDS能与各种蛋白质形成蛋白质能与各种蛋白质形成蛋白质SDSSDS复复合物，合物，SDSSDS所带负电荷的量大大超过了蛋所带负电荷的量大大超过了蛋白质白质分子原有电荷量。使电泳分子原有电荷量。使电泳迁移速率完迁移速率完全取决于分子的大小。全取决于分子的大小。讨论：如何测定蛋白质的分子量？讨论：如何测定蛋白质的分子量？使用使用SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用白质的分子量时，可选用一组已知分子量的一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的，根据已知分子量
6、的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。白质的分子量。血血血血液液液液血浆血浆血浆血浆水水水水 分分分分其他物质：其他物质：其他物质：其他物质：血浆蛋白、血浆蛋白、血浆蛋白、血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等血细血细血细血细 胞胞胞胞白细胞白细胞白细胞白细胞血小板血小板血小板血小板红细胞红细胞红细胞红细胞（最多）（最多）（最多）（最多）血红蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白（90909090）两个两个两个两个肽
7、链肽链肽链肽链两个两个两个两个一肽链一肽链一肽链一肽链四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团 血液有哪些成分？血液有哪些成分？血液有哪些成分？血液有哪些成分？(三三)缓冲溶液缓冲溶液 抵制外界的酸或碱对溶液抵制外界的酸或碱对溶液pHpH值的影响，值的影响，维持维持pHpH基本不变基本不变1.1.作用作用2.2.配制配制如如H H2 2COCO3 3/NaHCO/NaHCO3 3，NaHNaH2 2POPO4 4/Na/Na2 2HPOHPO4 4 说出人体血液中缓冲液说出人体血液中缓冲液?通常由通常由1 12 2种缓冲剂种缓冲剂溶解于水中配溶解于水中配制而成。调节缓冲
8、剂的制而成。调节缓冲剂的使用比例使用比例就可以就可以制得在不同制得在不同PHPH范围内使用的缓冲液。范围内使用的缓冲液。二二.实验操作实验操作(1)(1)(1)(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤红细胞的洗涤红细胞的洗涤(2)(2)(2)(2)血红蛋白的释放血红蛋白的释放血红蛋白的释放血红蛋白的释放(3)(3)(3)(3)分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定透析透析除去分子较小的杂质除去分子较小的杂质通过通过凝胶色谱法凝胶色谱法将分子量将分子量较大的杂质蛋白质除去较大的杂质蛋白质除去通过通过聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶
9、电泳泳鉴定血红蛋白纯度鉴定血红蛋白纯度 二、实验操作二、实验操作1.1.样品处理：样品处理：（二）操作过程（二）操作过程 本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。动物的血液来分离血红蛋白。用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取DNADNADNADNA，用哺乳动物的，用哺乳动物的，用哺乳动物的，用哺乳动物的红细胞红细胞红细胞红细胞提取血红蛋白的原因是什么？提取血红蛋白的原因是什么？提取血红蛋白的原因是什么？提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞
10、具有细胞核，含有DNADNA，便于进行，便于进行，便于进行，便于进行DNADNA的提取；人的的提取；人的的提取；人的的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。1.1.洗涤红细胞洗涤红细胞洗涤过程：洗涤过程：洗涤过程：洗涤过程：血液血液100mL100mL3g3g柠檬酸钠柠檬酸钠低速离心低速离心2 min2 min红细胞红细胞血血 浆浆吸出血浆吸出血浆红细胞红细胞5 5倍体积生理盐
11、水倍体积生理盐水搅拌搅拌10min10min重复洗涤重复洗涤3 3次，直至上清液没有黄色次，直至上清液没有黄色速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果等一同沉淀，达不到分离的效果1.1.洗涤红细胞洗涤红细胞阅读思考：阅读思考：阅读思考：阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤的目的是什么？洗涤的目的是什么？洗涤的目的是什么？除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化的分离纯化的分离纯化的分离纯化2.2.释放血红蛋白释放血红蛋
12、白阅读思考：阅读思考：1.1.释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入2.2.了哪些物质？了哪些物质？3.3.2.2.为了加速释放过程，采取了什么措施？为了加速释放过程，采取了什么措施？目的分析：目的分析：1.1.蒸馏水的作用是蒸馏水的作用是_。2.2.加入甲苯的作用是加入甲苯的作用是_。3.3.充分搅拌的目的是充分搅拌的目的是_。使红细胞大量吸水胀裂使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂加速红细胞的破裂3.分离血红蛋白分离血红蛋白分离过程分离过程红细胞破红细胞破碎混合液碎混合液高速离心高速离心10min 离心管离心管滤
13、纸滤纸过滤过滤脂类物质脂类物质烧杯烧杯2000r/min的速度的速度(3)(3)(3)(3)分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液：过程：过程：过程：过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以将搅拌好混合液转移到离心管内，以 2000r/min2000r/min的速度离心的速度离心10 min10 min。试管中溶液层次：试管中溶液层次：试管中溶液层次：试管中溶液层次：第第1 1层（最上层）：甲苯层（层（最上层）：甲苯层（无色无色 透明透明）；第）；第2 2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白白 色薄层固体色薄层固体）；第）；第3 3层
14、（中下层）：血红蛋白的水溶层（中下层）：血红蛋白的水溶 液层（液层（红色透明液体红色透明液体）；第）；第4 4层（最下层）：杂质沉层（最下层）：杂质沉 淀层（淀层（暗红色暗红色）。）。分离：分离：分离：分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏 斗中静置片刻后，分出下层的斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体红色透明液体。二、实验操作二、实验操作2 2、血红蛋白的粗分离、血红蛋白的粗分离-透析：透析：过程：过程：过程：过程：取取1ml1ml的血红蛋白溶液装入的血红蛋白溶液装入透析袋透析袋中，将透中，将透 析袋放入盛有析袋放入盛有300ml300ml的物质
15、的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/l20mmol/l的的 磷酸缓冲液磷酸缓冲液中（中（pHpH为），透析为），透析1212小时。小时。透析目的透析目的透析目的透析目的：除去样品中分子量较小的杂质除去样品中分子量较小的杂质。实验操作实验操作原理：透析袋能使小分子自由进出，而大原理：透析袋能使小分子自由进出，而大原理：透析袋能使小分子自由进出，而大原理：透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。分子保留在袋内。分子保留在袋内。分子保留在袋内。透析过程动画演示透析过程动画演示纯化纯化凝胶色谱法凝胶色谱法1.凝胶色谱柱的制作凝胶色谱柱的制作2.凝胶色谱柱的装填凝胶色谱柱的装填3.样品的加入和
16、洗脱样品的加入和洗脱纯度鉴定纯度鉴定 使用使用SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用白质的分子量时，可选用一组已知分子量的一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。白质的分子量。观察你处理的血液样品离心后观察你处理的血液样品离心后是否分层是否分层（见（见教科书图教科书图5-185-18），），如果分层不明显，可能是如果分层不明显，可能是洗
17、涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。三三.实验结果分析与评价实验结果分析与评价1 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？描述处理后的样品发生了哪些变化吗？由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶
18、柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。胶是否装填得均匀。此外，还可以此外，还可以加入大分子加入大分子的有色物质，的有色物质，例如蓝色葡聚糖例如蓝色葡聚糖20002000或红色或红色葡聚糖，葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。消除气泡，消除不了时要重新装柱。2 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填
19、得成功吗？你是如何判断的？的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。3 3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？并据此判断分离效果？凝胶色谱柱凝胶色谱柱注意：注意：注意：注意：正确的加样操作正确的加样操作（1 1）不要触及和破坏凝胶面不要触及和破坏凝胶面（2 2）贴壁加样（）贴壁加样（3 3）使吸管管口沿管壁环绕移动。）使吸管管口沿管壁环绕移动。样品加入与洗脱样品加入与洗脱