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1、细胞破碎细胞破碎生化分离工程生化分离工程 胞内产物：胞内酶、大部分重组蛋白等。细胞破碎：破坏细胞壁或细胞膜一、细胞壁的结构和化学组成1.细菌的细胞壁1550nm4090%肽聚糖肽聚糖1.52nm810nm2.酵母的细胞壁由葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质构成，比G+更难破碎。其他真菌细胞壁：主要由多糖组成(几丁质、纤维素)酵母细胞壁结构示意图 M甘露聚糖；P磷酸二酯碱；G葡聚糖酵母细胞酵母细胞3.植物细胞和动物细胞 植物细胞：纤维素 动物细胞：无细胞壁 原核和真核细胞膜：脂质和蛋白构成二、细胞破碎方法二、细胞破碎方法 物理方法物理方法 高压匀浆、珠磨、超声波破碎高压匀浆、珠磨、超声波破碎、喷雾撞、喷雾
2、撞击破碎、研磨、旋刀式匀浆等击破碎、研磨、旋刀式匀浆等（机械破碎）（机械破碎）冻融、低渗裂解冻融、低渗裂解1、高压匀浆法、高压匀浆法高压匀浆器针型阀结构简图 高压匀浆器各种阀型设计 5070MPa450m/s 在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及高浓度的细胞悬液，常采用多次循环的操作方法。其破碎属于一级反应速度过程，被破碎的细胞分率符合下式，破碎的动力学方程可表示为：（3）式中 R细胞破碎率 K与温度等有关的破碎常数 N悬浮液通过匀浆器的次数 P操作压力 a与微生物种类有关的常数。高压匀浆法适合于高压匀浆法适合于酵母和细菌酵母和细菌的大规模破碎的大规模破碎不适于不适于团状或丝状菌团状或
3、丝状菌破碎破碎 2.2.珠磨法珠磨法玻璃玻璃(2.5g/mL)氧化锆氧化锆(6.0g/mL)粒径粒径(0.11.0mm)填充率填充率(8085%)ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机S 破碎率；破碎率；t为破碎操作时间或平均停为破碎操作时间或平均停留时间留时间;k破碎速度常数，破碎速度常数，与搅拌与搅拌转速、料液的循环流速、转速、料液的循环流速、细胞悬浮液的浓度、玻璃细胞悬浮液的浓度、玻璃小珠直径以及温度等操作小珠直径以及温度等操作因素相关因素相关微珠直径微珠直径:目标细胞直径目标细胞直径 30100细菌浓度细菌浓度 60120g/L酵母浓度酵母浓度 140180g/L优点：优点：容易操作，破碎率可控
4、制，易放大；容易操作，破碎率可控制，易放大；实验室和工业规模均可用；实验室和工业规模均可用；绝大多数微生物细胞均适用绝大多数微生物细胞均适用缺点：缺点：产生大量热能，能量利用率仅产生大量热能，能量利用率仅1%1%；影响破碎率的操作参数较多，操作过程优化较复杂影响破碎率的操作参数较多，操作过程优化较复杂 搅拌设计要能够给予研磨剂以最佳推动力，一般设计为搅拌盘。搅拌盘与驱动轴有同心的，也有偏心的；有垂直的，也有倾斜的。有的搅拌盘上有凹槽或是开度口以帮助搅拌。珠磨机搅拌盘设计图 珠磨机搅拌盘与驱动轴方位示意图3、超声波破碎、超声波破碎 空穴作用：空穴作用：在超声作用下液体发生空化作用，空穴的形成、增
5、大、闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎优点：优点：适合于多种细胞的破碎处理少量样品操作方便，液体损失少，破碎率高钛合金钛合金缺点：有效能量的利用率低，产热大，需控温（冰水或通冷却剂）；不易放大，仅应用于实验室规模的细胞破碎；影响因素多，细胞种类、浓度、超声波的声频等4.低渗裂解（渗透压冲击）低渗裂解（渗透压冲击）高渗溶液（如高渗溶液（如20%蔗糖、高浓度盐或甘油）中转到冷水中蔗糖、高浓度盐或甘油）中转到冷水中 适合细胞壁脆弱的细胞（动物细胞、革兰氏阴性菌）。适合细胞壁脆弱的细胞（动物细胞、革兰氏阴性菌）。可分离细胞间质蛋白可分离细胞间质蛋白5.冻融冻融 急冻后室温缓慢融化，反复多次急冻后
6、室温缓慢融化，反复多次 破坏细胞膜的疏水键，增加其亲水性和通透性；破坏细胞膜的疏水键，增加其亲水性和通透性；胞内结晶引起细胞内外浓度变化，细胞膨胀破裂。胞内结晶引起细胞内外浓度变化，细胞膨胀破裂。破碎率低破碎率低其他物理方法：其他物理方法：研磨研磨（细菌、植物细胞）（细菌、植物细胞）旋刀式匀浆旋刀式匀浆（大多数动植物组织）（大多数动植物组织）化学方法化学方法1.1.酸碱处理酸碱处理 破坏细胞壁和细胞膜，适用于酸碱稳定的产品破坏细胞壁和细胞膜，适用于酸碱稳定的产品 如：细菌如：细菌L-L-天门冬酰胺酶的提取，将菌体悬浮天门冬酰胺酶的提取，将菌体悬浮在在pH11pH11的碱溶液中，振荡的碱溶液中，
7、振荡20min20min即可。即可。2.2.有机溶剂处理有机溶剂处理 甲苯、丙酮等甲苯、丙酮等 溶解脂类物质，增加细胞壁和细胞膜通透性，溶解脂类物质，增加细胞壁和细胞膜通透性，可实现选择性释放。可实现选择性释放。3.3.表面活性剂处理表面活性剂处理 十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠SDSSDS、Triton X-100Triton X-100等等 溶溶解解脂脂蛋蛋白白和和脂脂类类，作作用用细细胞胞壁壁和和细细胞胞膜膜，增加通透性增加通透性 动物细胞完全破碎动物细胞完全破碎 有机溶剂和表面活性剂处理有机溶剂和表面活性剂处理特点：特点：胞胞内内产产物物总总释释放放率率低低，核核酸酸留留在在胞胞内内，料
8、料液黏度低，避免大量细胞碎片，有利于后处理液黏度低，避免大量细胞碎片，有利于后处理 破碎率低，加入试剂会形成新的污染破碎率低，加入试剂会形成新的污染生物方法生物方法1.1.酶法酶法 革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌:溶菌酶溶菌酶(水解肽聚糖层水解肽聚糖层)；革兰氏阴性菌：革兰氏阴性菌：溶菌酶溶菌酶EDTAEDTA 二价阳离子特别是二价阳离子特别是MgMg2 2对细胞壁外层具有稳定作用对细胞壁外层具有稳定作用 酵母：酵母：溶壁酶溶壁酶(Zymolyase)(Zymolyase)、葡聚糖酶、甘露糖酶等；、葡聚糖酶、甘露糖酶等；植物细胞：植物细胞：纤维素酶纤维素酶特点：特点：操作条件温和，产物破坏小，费用高
9、操作条件温和，产物破坏小，费用高肽聚糖溶菌酶(lysozyme):作用于NAM的G1和NAG的C1-C4之间的糖苷键，所以又称乙酰胞壁质酶。对G-菌，在EDTA存在下，受溶菌酶作用。溶菌酶处理后的菌细胞应保存在弱高渗（0.1）蔗糖液中。图中箭头为溶菌酶的水解点。溶菌酶的作用过程：2.2.自溶自溶 一定一定pHpH和温度下诱使细胞产生溶解自身的酶；和温度下诱使细胞产生溶解自身的酶；一般采用加热法，自溶时间较长，必要时加甲一般采用加热法，自溶时间较长，必要时加甲苯、氯仿等防止微生物生长；苯、氯仿等防止微生物生长；酵母酵母4550 20h发生自溶发生自溶。可将多种破碎方法联合使用提高破碎效果。可将多
10、种破碎方法联合使用提高破碎效果。青霉素青霉素(penicillin):(penicillin):作作用用于于肽肽聚聚糖糖肽肽桥桥的的联联结结，即即抑抑制制肽肽聚聚糖糖的的合合成成，故故仅仅对生长着的菌有效，主要是对生长着的菌有效，主要是G G+菌。菌。菌体细胞壁合成受抑制，可促使胞内产物的分泌菌体细胞壁合成受抑制，可促使胞内产物的分泌细胞壁合成抑制细胞壁合成抑制三、目标产物的选择性释放三、目标产物的选择性释放目标产物在细胞内的位置：目标产物在细胞内的位置：细胞质内细胞质内细胞器内细胞器内细胞膜或细胞壁附近（细胞膜或细胞壁附近（如革兰氏阴性菌周质空间中的蛋白）如革兰氏阴性菌周质空间中的蛋白）细胞
11、膜或细胞壁处于结合状态细胞膜或细胞壁处于结合状态选选择择性性释释放放：使使细细胞胞不不完完全全破破碎碎，选选择择性性释释放放目目标标产产物物，尽尽量量减少其他物质的释放。减少其他物质的释放。选择性释放原则：选择性释放原则：仅破坏或破碎存在目标产物的位置仅破坏或破碎存在目标产物的位置 细胞膜附近：细胞膜附近：温和的方法温和的方法(酶法酶法)，或采用较温和，或采用较温和的机械破碎条件，降低细胞破碎程度。的机械破碎条件，降低细胞破碎程度。细胞内：细胞内：机械破碎机械破碎选择性溶解目标产物选择性溶解目标产物 目标产物与细胞膜或细胞壁处于结合状态目标产物与细胞膜或细胞壁处于结合状态 调整溶液调整溶液pH
12、pH、离子强度、添加能够溶解释放目标离子强度、添加能够溶解释放目标产物的试剂产物的试剂(如表面活性剂、螯合剂如表面活性剂、螯合剂)。化学渗透法选择性释放胞内产物流程图 按是否使用外加作用力可将常用的破碎方法分为机械法和非机械法两大类。分 类作用机理适 应 性机械法珠磨法固体剪切作用可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难高压匀浆法液体剪切作用可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌超声破碎法液体剪切作用对酵母菌效果较差，破碎过程易升温剧烈，不适合大规模操作X-press法固体剪切作用破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适应非机械法酶法酶分解作用
13、具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，酶价格高，自溶法的细胞浆液分离困难化学法改变细胞膜渗透性具有一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差，破碎后需特别除去化学试剂渗透压法渗透压剧烈改变破碎率较低，常与其它方法结合使用冻融法反复冻结融化破碎率较低，不适合对冷冻敏感的目的产物干燥法改变细胞膜渗透性条件变化剧烈，易引起大分子物质失活四、破碎率的测定四、破碎率的测定a.直接测定直接测定 利用显微镜观察或计数；染色可将破碎细胞和完利用显微镜观察或计数；染色可将破碎细胞和完整细胞区分开。整细胞区分开。如革兰氏染色能将破碎后的革兰氏阳性菌染成阴性如革兰氏染色能将破碎后的革兰氏阳性菌染成阴性菌的颜色；
14、菌的颜色；受损的酵母细胞为亮红色，未受损的酵母细胞为紫受损的酵母细胞为亮红色，未受损的酵母细胞为紫色。色。b.测定释放的蛋白量或酶活测定释放的蛋白量或酶活 将破碎后的细胞悬液离心，测定上清液中蛋白浓度将破碎后的细胞悬液离心，测定上清液中蛋白浓度或酶活。或酶活。c.测电导率测电导率 电导率随破碎率的增加而线性增加电导率随破碎率的增加而线性增加1、多种破碎方法相结合、多种破碎方法相结合 化学法与酶法取决于细胞膜壁的化学组成，机化学法与酶法取决于细胞膜壁的化学组成，机械法取决于细胞结构的机械强度，而化学组成又决械法取决于细胞结构的机械强度，而化学组成又决定了结构的机械强度，组成的变化必然影响到强度定
15、了结构的机械强度，组成的变化必然影响到强度的差异，这就是化学法或酶法与机械法相结合的原的差异，这就是化学法或酶法与机械法相结合的原理。理。五、细胞破碎的发展趋势五、细胞破碎的发展趋势2 2、与上游过程相结合、与上游过程相结合 （1 1）克隆噬菌体裂解基因）克隆噬菌体裂解基因 噬菌体裂解基因噬菌体裂解基因 举例：举例：于慧敏等构建得到了一株具有于慧敏等构建得到了一株具有噬菌体裂解基因的产噬菌体裂解基因的产PHB重组大肠杆菌，通过发酵后期升高温度至重组大肠杆菌，通过发酵后期升高温度至50保温保温2h，或者加入螯合剂或者加入螯合剂EDTA，均可使细胞裂解释放出目标产物，均可使细胞裂解释放出目标产物P
16、HB。图图 不同时刻和裂解处理前后的不同时刻和裂解处理前后的PHB颗粒颗粒（于慧敏，2001年，清华大学博士论文）PHB：聚-羟基丁酸酯，是一种生物可降解塑料（2）耐高温产品的基因表达）耐高温产品的基因表达 在破碎和分离过程中，为防止产品失活而消耗的制在破碎和分离过程中，为防止产品失活而消耗的制冷费是相当可观的。如果产品能表达成耐高温型，那么冷费是相当可观的。如果产品能表达成耐高温型，那么在较高的温度下进行操作既节省了冷却费用，又简化了在较高的温度下进行操作既节省了冷却费用，又简化了分离步骤。分离步骤。嗜热酶嗜热酶 嗜热微生物嗜热微生物3、避开菌体破碎的方法、避开菌体破碎的方法 需要进行细胞破碎的前体是目标产物存在于细需要进行细胞破碎的前体是目标产物存在于细胞内，当目标产物可以在发酵过程中释放到胞外，胞内，当目标产物可以在发酵过程中释放到胞外，则细胞破碎的操作即可省去。则细胞破碎的操作即可省去。毕赤酵母、枯草芽孢杆菌毕赤酵母、枯草芽孢杆菌跨膜运输，分泌到胞外跨膜运输，分泌到胞外蛋白质蛋白质信号肽序列信号肽序列下一节：下一节：初级分离初级分离